水稻氮素利用相關基因遺傳研究進展

唐偉杰 陳海元 張所兵 唐駿 林靜 方先文 張云輝

摘要： ?水稻氮素利用效率的高低直接影響水稻產量以及生態環境。在水稻氮素利用相關基因的研究中，研究人員通過連鎖作圖和關聯作圖等方法克隆基因，并解析水稻的氮素利用機理，為水稻氮素高效利用育種提供了基因資源。本文從水稻氮素利用QTL定位及基因克隆，基于全基因組關聯分析的水稻氮素利用相關基因克隆，利用突變體克隆水稻氮素利用相關基因，利用反向遺傳學克隆水稻氮素利用相關基因等方面總結了近年水稻氮素利用相關基因的研究進展。同時對該領域的未來研究進行了展望。本文為水稻氮素高效利用基因的研究和氮素高效利用育種提供了參考。

關鍵詞： ?水稻; 氮素利用效率; 基因變異

中圖分類號： ?S511 ???文獻標識碼： A ???文章編號： ?1000-4440（2024）03-0570-07

Progress in genetic research on genes related to nitrogen utilization in rice

TANG Wei-jie1， CHEN Hai-yuan1， ZHANG Suo-bing1， TANG Jun1， LIN Jing1， FANG Xian-wen1， ZHANG Yun-hui1，2

（1.Provincial Key Laboratory of Agrobiology， Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 2.Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops， Yangzhou 225009， China）

Abstract： ?Nitrogen use efficiency （Nue） of rice directly affects rice yield and ecological environment. In the research of rice nitrogen use-related genes， researchers cloned the genes by means of linkage mapping and association mapping， and analyzed the mechanism of rice nitrogen utilization， which provided genetic resources for rice nitrogen efficient utilization breeding. This article summarized the research progress of rice nitrogen utilization related genes in recent years， including QTL mapping and gene cloning of rice nitrogen utilization， cloning of rice nitrogen utilization related genes based on whole genome association analysis， cloning of rice nitrogen utilization related genes using mutants， and cloning of rice nitrogen utilization related genes using reverse genetics. At the same time， the future research in this field was prospected. This paper provides a reference for the research of nitrogen efficient utilization genes and nitrogen efficient utilization breeding in rice.

Key words： ?rice; nitrogen utilization efficiency; gene variations

水稻作為全球最重要的糧食作物之一，為保障世界糧食安全和滿足日益增長的人口對糧食的需求起到了至關重要的作用[1]。氮肥是水稻種植過程中用量最大的肥料，對水稻產量的提高至關重要。然而，隨著農田氮肥的過度施用，氮肥對環境的污染問題日益嚴重[2-3]，提高水稻氮素利用效率（Nitrogen use efficiency，NUE）已成為實現農業可持續發展和環境保護的重要途徑之一[4-5]。因此，開展水稻的氮營養與遺傳交叉研究，發掘水稻氮素利用相關基因，鑒定基因的優異單倍型，對于提升糧食產量和保護生態環境，實現農業可持續發展具有重要意義。

水稻氮素利用包括氮吸收、轉運、同化和再利用等過程，涉及到多個基因、多個途徑的參與和調控[6]。氮肥在土壤中以硝態氮和銨態氮形式存在，水稻根系通過NO-3轉運子和NH+4轉運蛋白等調控硝態氮和銨態氮的吸收、轉運，通過硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶實現氮同化[7-12]。在植株地上部分，氮素的運輸和分配受到氮素轉運蛋白、氨基酸轉運蛋白等的調控[7，13]。此外，水稻對氮素的同化和再利用還受到天冬氨酸合成酶和相關轉錄因子的調控[6，14]。這些氮素利用相關基因的克隆、功能分析等揭示了水稻氮素利用的調控機制，為培育氮高效利用水稻品種，提高水稻氮肥利用效率提供了科學依據和基因資源。

QTL（數量性狀基因座）定位是基因克隆、功能驗證的重要技術手段，且推動了品種的改良[15-16]。同時，基因組學和高密度遺傳圖譜等高通量技術也為基因遺傳研究提供了新的思路和方法[17-18]。在水稻氮素高效利用的研究中，通過研究氮素利用相關基因在不同品種中的變異情況，篩選出能夠高效利用氮素的優異單倍型，為水稻育種提供種質和基因資源。

綜上所述，本文從水稻氮素利用QTL定位及基因克隆，基于全基因組關聯分析的水稻氮素利用相關基因克隆，利用突變體克隆水稻氮素利用相關基因，利用反向遺傳學克隆水稻氮素利用基因等方面總結近年水稻氮素利用相關基因的研究進展，討論了該領域存在的問題并對未來的研究方向進行展望，以期為人們快速深入了解水稻氮素利用相關研究，對于推動水稻氮素高效利用育種有積極作用。

1 水稻氮素利用QTL定位及基因克隆

水稻種植歷史悠久，分布廣泛，形成了多種多樣的遺傳資源，具有豐富的遺傳多樣性[19]。Zhang等[20]利用秈稻資源特青與普通野生稻（Oryza rufipogon）雜交后代群體，通過調查0.24 mmol/L硝酸銨和1.44 mmol/L硝酸銨處理21 d的水稻植株相對干質量，進行QTL檢測，克隆到 ?TOND1 ?基因，該基因優勢單倍型主要在秈稻品種中存在。通過基因內關聯分析，發現該基因和啟動子上的5個SNP（單核苷酸多態性）可能是導致優勢單倍型的原因，在減氮條件下，該基因過表達后可有效提高水稻產量。

Yang等[21]以廣西普通野生稻Y11和秈型恢復系GH998雜交構建后代群體，測定不同施氮處理的水稻體內氮濃度，以氮素利用效率作為定位指標，采用QTL-seq技術定位到1個位于6號染色體的影響氮素利用效率的QTL位點，進一步精細定位得到 ?OsNPF3.1 ?，功能分析發現該基因影響株高、抽穗期和千粒質量。在OsNPF3.1蛋白結構域內存在1個氨基酸變異，由蘇氨酸變為丙氨酸，導致了野生稻和栽培稻不同的氮素利用效率表型。進一步分析栽培稻中的變異，發現有2個自然變異位點 ?OsNPF3.1 ?Chr6_8741040和 ?OsNPF3.1 ?Chr6_8742153與氮素利用效率相關，且 ?OsNPF3.1 ?Chr6_8742153位點具有明顯的秈粳分化[22]。

水稻中的秈稻和粳稻亞群具有不同的氮素利用效率，因此研究者利用秈稻和粳稻雜交構建后代群體，通過調查與氮素利用效率相關的性狀，發掘與氮素利用效率相關的等位基因，解釋秈粳間的差異，進而提高粳稻的氮素利用效率。Sun等[23]利用氮素敏感秈稻品種南京6號和氮不敏感粳稻品種千重浪2號雜交構建后代群體，調查不同氮素處理下的株高，采用QTL作圖，發現1個氮敏感基因 ?DEP1 ?，已有報道稱該基因為1個控制穗型基因， ?DEP1 ?控制穗型直立， ?dep1 ?為其等位基因[24]，其中 ?dep1 ?缺失了長度為625 bp的片段，導致翻譯提前終止。在體內，DEP1蛋白與Gα（RGA1）和Gβ（RGB1）亞基互作，降低RGA1活性或增強RGB1活性均會導致植物對氮不敏感。攜帶 ?dep1-1 ?等位基因的植株在營養生長期對氮素不敏感，從而可以提高中等氮肥水平下的水稻產量和收獲指數。

NO-3是重要的氮素來源，且具有信號功能。學者用氯酸鹽代替NO-3，檢測不同水稻品種對硝酸鹽的吸收和同化能力，發現秈稻和粳稻對NO-3的吸收存在差異[25]。Hu等[25]利用氯酸鹽敏感秈稻品種IR24和氯酸鹽鈍感粳稻品種日本晴雜交構建BC2F5家系，進行QTL檢測，發現了1個在秈粳稻間分化的編碼NO-3轉運子的基因 ?NRT1.1B ?，該基因編碼的蛋白在氨基酸序列中第327位氨基酸的變異導致秈粳稻間NO-3吸收的差異。秈稻中的變異有效提高NO-3吸收和NO-3響應相關基因的表達上調，導入到粳稻中可有效提高粳稻氮素利用效率，從而提高粳稻產量。Guo等[26]同樣利用氯酸鹽抗性不同的秈稻品種9311和粳稻品種日本晴雜交構建后代群體，進行QTL定位，在2號染色體上檢測到與目標性狀相關的位點，經過圖位克隆得到基因 ?OsNR2 ?，該基因編碼NAD（P）H-依賴性硝酸還原酶，NAD（P）H-依賴性硝酸還原酶氨基酸序列中第738位精氨酸是決定NO-3還原能力的關鍵位點，當該位點的精氨酸變為色氨酸時，NO-3還原能力下降。進一步調查產量，發現秈稻9311水稻產量較高，這是由于9311中存在 ?OsNR2 ?基因的優勢單倍型， ?OsNR2 ?基因的不同單倍型導致 ?NRT1.1B ?的不同表達。且 ?NRT1.1B ?和 ?OsNR2 ?的克隆充分闡明了秈稻中NO-3吸收和同化效率高于粳稻的機制，為粳稻提高氮素利用效率，特別是NO-3吸收同化提供了優異基因資源。

NH+4是水稻主要的氮源，通過遺傳手段了解NH+4吸收相關基因可有效提高水稻對氮肥的利用效率。Li等[27]利用銨態氮吸收速率較高的育種家系NM73，與銨態氮吸收速率較低的秈稻品種南京6號（NJ6）雜交構建后代群體，通過調查水稻對15N標記的NH+4吸收速率，檢測到2個QTL，經過圖位克隆，發現2個基因分別是 ?sd1 ?和 ?GRF4 ?。其中 ?GRF4 ???ngr2 ?是一種可以促進銨根吸收的單倍型，跟NJ6相比，NM73的單倍型 ?GRF4 ???ngr2 ?在第3個外顯子上具有2個SNP（1 187 T→A和1 188 C→A），在啟動子上有3個SNP（-884 T→A，-847 C→T和-801 C→T）。 ?GRF4 ?不僅能調節銨根吸收，還能受到氮的調控。經過分子生物學驗證，GRF4蛋白不僅是一個正向調控植物碳-氮代謝的因子，可以促進植物氮素代謝、光合作用以及生長發育，而且GRF4蛋白也參與赤霉素信號傳遞途徑，能與DELLA蛋白互作。結果證明，GRF4蛋白與水稻生長抑制因子DELLA蛋白相互之間的調節賦予了植物生長與碳-氮代謝之間的穩態。

生長素是植物生長必需激素，氮素利用效率也受生長素相關基因的調控。Zhang等[28]利用秈稻品種華粳秈74和粳稻品種IRAP9雜交構建CSSL（染色體片段置換系）群體，通過調查15N標記的NO-3吸收速率，并進行QTL定位，發現 ?qDNR1 ?位點，進一步精細定位發現得到1個參與生長素合成基因 ?DNR1 ?。該基因存在明顯的秈粳差異，秈稻 ?DNR1 ?基因的啟動子-1 728到-1 209位置上缺失長度為520 bp的片段，該片段的缺失導致了 ?DNR1 ?的表達量下降，從而促進了氮的吸收和同化，在中度氮肥施用情況下，可有效提高水稻產量。 ?DNR1 ?基因通過影響生長素合成，促進ARF基因表達，調控氮吸收轉運。進一步研究發現，利用RSA（Root system architecture，根系結構）不同和氮敏感性不同的秈稻品種華粳秈74和粳稻品種IRAT261雜交構建后代群體，通過圖位克隆得到 ?RNR10 ?基因[29]。該基因編碼的F-box蛋白，可以與DNR1互作，RNR10對K53殘基進行單泛素化修飾，使DNR1更加穩定不易降解，從而負調控生長素的積累。同樣，該基因具有顯著的秈粳差異，秈稻中該基因內含子存在604 bp長度的插入片段，啟動子上3 496 bp長度的片段發生結構變異，使秈稻氮素利用效率提高。 ?DNR1和RNR10 ?的基因克隆以及相互作用，為生長素參與氮素利用效率提供了基因資源，并為解釋秈粳間氮素利用效率差異提供了更多證據。

氮素不僅影響水稻根系生長，還影響葉面積變化和纖維素含量。Gao等[30]以葉面積和纖維素含量為指標，通過日本晴和9311雜交構建的CSSL群體，檢測到1個位于1號染色體的QTL，通過圖位克隆，發現區間內 ?MYB61 ?是導致表型變化的基因，該基因編碼的轉錄因子作用于下游的 ?GRF4 ?基因，調控水稻纖維素合成和氮素利用。遺傳分析發現， ?MYB61 ?具有明顯的秈粳分化。秈稻中的單倍型具有更高的轉錄水平，在減氮的條件下，氮素利用效率更高。

以上研究結果對于解釋部分優異材料的氮高效原因起到了關鍵作用，但雙親本QTL定位存在不足，如群體構建時間較長和檢測等位基因數量少等，研究人員嘗試利用自然變異群體快速克隆水稻氮素利用相關基因。

2 基于全基因組關聯分析的水稻氮素利用相關基因克隆

隨著二代測序成本降低，結合水稻種質資源的多樣性，利用全基因組關聯分析 （Genome Wide Association Study，GWAS）成為快速克隆水稻氮素利用相關基因的有效方法。Tang等[31]利用117份來自世界各地的具有極端氮響應的地方品種，結合GBS（隨機測序式基因型檢測）和Imputation（預測）方法檢測其多態性，連續3年調查不同氮素處理下的株高、有效穗數和單株產量，克隆到硝酸根轉運子OsNPF6.1，該轉運子負責硝酸根的吸收轉運，其優勢單倍型的氨基酸序列第160位氨基酸由甘氨酸變成天冬氨酸，水稻對硝酸根吸收能力更強。同時發現，優勢單倍型具有更高的 ?OsNPF6.1 ?基因表達水平，是因為優勢單倍型品種的 ?OsNPF6.1 ?啟動子具有4個CACG元件，可以被調控水稻氮素高效利用的轉錄因子OsNAC42結合，而劣勢單倍型品種只有2個CACG元件，該研究結果在轉錄調控水平上解釋了 ?OsNPF6.1 ?優勢單倍型以及 ?OsNPF6.1 ?基因表達量高的原因。

利用同一群體， ?OsNLP4 ?和 ?OsGS1;1 ?基因相繼被發現[32-33]， ?OsNLP4 ?基因具有8個SNP，優勢單倍型HapB具有更高的轉錄水平，對下游基因OsNiR具有更高的轉錄激活能力。同時，還發現不同品種中 ?OsNLP4 ?下游的OsNiR基因啟動子上的NRE（硝酸鹽響應元件）數量存在差異，NRE數量的增加提高植株對亞硝酸鹽的耐受性，并提高分蘗數，最終影響產量和氮素利用效率[32]。Liu等[33]發現 ?OsGS1;1 ?基因通過可變剪切產生2種轉錄本，均可編碼具有活性的谷氨酰胺合成酶，優勢單倍型HapB中的轉錄本OsGS1;1b具有更高的谷氨酰胺合成酶活性，可以提高水稻氮素利用效率，影響直鏈淀粉含量。在同一群體中4個基因（ ?OsNPF6.1，OsNAC42，OsNLP4和OsGS1;1 ?）的發掘驗證了GWAS對于氮素利用相關基因的發掘能力，為快速鑒定與氮素利用有關的新基因提供了性狀（株高、有效穗數和單株產量）借鑒和經驗。

分蘗是氮素影響水稻發育的直觀表型，隨著氮肥施用量的增加，水稻分蘗呈現增加的趨勢。Liu等[34]利用來自世界各地的110份種質資源，通過TRN（分蘗氮響應）表型鑒定到1個氮素利用相關基因 ?OsTCP19 ?，該基因通過調控下游DLT 基因的表達負調控水稻分蘗，其優勢單倍型啟動子上缺失了29 bp長度的片段，該優勢單倍型在Aus稻中占比較高，通過近等基因系發現，該優勢單倍型可有效提高水稻分蘗、產量和氮素利用效率。

有機氮可有效提升水稻氮素利用效率。Guo等[13]發現，水稻不同亞群對于天冬氨酸的吸收水平不同，粳稻的吸收速率約為秈稻的1.5倍，對水稻中不同的氨基酸轉運蛋白序列進行基因內關聯分析，發現 ?LHT1 ?基因與表型關聯程度高。根據3個SNP可以將 ?LHT1 ?分成兩種單倍型，其中type1在粳稻中存在，具有更高的 ?LHT1 ?基因表達量和天冬氨酸吸收速率，type2在秈稻中存在，具有較低的 ?LHT1 ?基因表達量和天冬氨酸吸收速率。

關聯分析克隆氮素利用相關基因，并解釋其變異，有效拓寬了水稻不同亞群的利用，不局限于秈稻和粳稻的差異，且自然變異群體可以檢測到多個氮素利用相關基因，結合優異單倍型，更容易鑒定氮高效利用品種資源。

3 利用突變體克隆水稻氮素利用相關基因

谷氨酸在水稻氮素吸收利用過程中起到關鍵作用，GOGAT（谷氨酸合酶）負責將谷氨酰胺轉化為谷氨酸。Yang等[35]通過一個水稻細胞分裂素異常反應突變體abc1，克隆到水稻Fd-GOGAT基因，該基因在氮素同化和碳氮平衡中起到關鍵作用，遺傳變異分析結果表明，該基因編碼區內含有5個非同義變異，在水稻亞群中具有明顯的秈粳分化。Wang等[36]后續利用再突變的方式，將突變體abc1表型恢復，并篩選到了表型恢復的突變體are1，ARE1是1個葉綠體定位蛋白，突變后葉片葉綠素含量升高，衰老延遲，可以使水稻產量提升10%～20%。遺傳變異分析結果表明，在18%的秈稻和48%的aus稻中 ?ARE1 ?基因序列中被插入長度6 bp的片段，使得該基因表達量降低，水稻產量升高。后續研究發現，在ghd7突變體中， ?ARE1 ?的表達量升高。研究結果表明，轉錄抑制因子Ghd7可以與 ?ARE1 ?的啟動子和第1個內含子結合，抑制 ?ARE1 ?的表達， ?Ghd7 ?的優勢單倍型和 ?ARE1 ?的優勢單倍型在東亞和南亞氮肥施用少的地方具有相對較高的比例，可以提高氮素利用效率和水稻產量[37]。有研究結果表明，DELLA蛋白在氮素利用中起到關鍵作用[27]。Wu等[38]利用EMS誘變，得到1個分蘗數量減少，對氮肥供應量變化不敏感的突變體ngr5。通過圖位克隆，發現NGR5是水稻響應氮素的正調控因子，含有APETALA2（AP2）結構域，與PRC2蛋白復合物互作，通過介導組蛋白H3K27me3甲基化修飾水平來調節靶基因的表達，最終調控水稻的分蘗等生長發育性狀。研究還發現，NGR5與DELLA蛋白互作，DELLA競爭性結合赤霉素受體GID1（Gibberellin Receptor），抑制赤霉素介導的NGR5蛋白降解，增加NGR5蛋白穩定性。遺傳分析發現， ?NGR5 ?基因含有5種單倍型，其中Hap2單倍型與 ?NGR5 ?高轉錄水平有關，具有更高的分蘗數和田間產量，高產秈稻品種桂朝2號屬于Hap2單倍型。

在對NH+4影響水稻根系生長的研究中，Xie等[39]通過EMS誘變，得到1個對銨鹽超敏感的突變體rohan，并克隆其突變基因ASL。研究發現，過表達ASL可以顯著增強水稻根系對銨鹽的耐受性，顯著提高水稻的產量和氮素利用效率。進一步分析ASL基因的自然變異，發現該基因在秈稻和粳稻之間具有明顯的分化，ASL基因共有37個SNP，其中錯義突變SNP（Chr3：10847318，A→G）導致編碼的賴氨酸變為精氨酸，SNPG植株根系對NH+4敏感性高于SNPA植株。在高氮誘導下，SNPA植株的ASL表達水平更高，對NH+4的耐受性更強。

4 利用反向遺傳學克隆水稻氮素利用相關基因

Fan等[40]發現NRT2.3是1個對pH值敏感的硝酸根轉運子，其可變剪切體OsNRT2.3b主要在韌皮部表達，并在胞質側具有調節基序，能通過pH傳感機制開啟或關閉硝酸鹽轉運活性。在水稻中過表達 ?OsNRT2.3b ?，可以使水稻對氮素的利用效率提高40%。同時，Xie等[41]發現，相比于Indica Ⅰ， ?OsNRT2.3 ?在Indica Ⅱ進化過程中受到了選擇。Fan等[40]試驗數據也驗證了這一結果。Zhang等[42]在前人研究基礎上，繼續探究 ?OsNRT2.3 ?的功能，發現 ?OsNRT2.3 ?的等位基因 ?HTNE-2 ?發生SNP變異（距離ATG 111 bp的C堿基和距離ATG 7 bp的T堿基），導致OsNRT2.3b蛋白水平增加，使水稻在受到高溫脅迫時具有更高產量，為抗高溫和氮高效利用育種改良提供了基因資源。

5 展 望

挖掘水稻氮素利用相關基因是提高水稻產量和減少氮肥施用量的關鍵，研究者利用雙親QTL檢測、GWAS等方法克隆到多個水稻氮素利用相關基因。然而，水稻基因組極為復雜，基因組包含了大量基因，其中涉及到氮素吸收、轉運、同化和再利用的基因有數百個，在水稻染色體上還存在結構變異[43]。因此，鑒定和解析與水稻氮素利用相關的基因是一個巨大的挑戰，需要高通量測序或者單細胞測序等先進技術來進行基因篩選和功能研究。同時，還需要根據已克隆的與氮高效利用有關的基因進一步地構建水稻氮營養調控網絡，包括氮素信號感知、轉錄因子調控和代謝途徑調控等調控網絡。

水稻氮素利用還受到環境因素的影響[44-45]，如土壤氮含量和氣候條件等，環境因素使得研究水稻氮素利用相關基因的遺傳機制更加困難。因此需要多年多點、大規模和更精準的種植結果進行相互驗證，從而獲取更全面的數據和準確的結果[46]。目前研究多使用低產親本日本晴、中花11等作為背景親本，與實際生產上所用的水稻品種有較大差異，如何用已克隆的優異單倍型改善現有的種植品種性狀也是需要關注的重點。

不同品種水稻對氮素的利用效率不同，這與其遺傳背景密切相關。因此，在研究水稻氮素利用相關基因變異的同時，需要考慮到不同品種之間的遺傳多樣性，并進行全基因組關聯分析和群體遺傳學研究，以揭示品種間的差異和遺傳機制。目前已克隆到多個與氮素利用相關的基因[47-48]，后續可以結合不同水稻品種進行單倍型分析，進一步發掘、驗證這些基因的優異單倍型，為氮素高效利用新品種選育提供氮高效利用的優異單倍型資源。前期研究發現的氮高效利用優異單倍型普遍存在于秈稻中，如 ?OsNRT1.1B-IR24 ?、 ?OsNR2-9311 ?、 ?OsNPF6.1HapB ?、 ?GRF4ngr2 ?和 ?NGR5 ?- ?Hap2 ?等。然而，粳稻中同樣具有豐富的氮高效種質資源，后續研究可以圍繞粳稻地方種質資源進行氮素利用相關基因的發掘和驗證，加快粳稻氮高效利用育種進程。

目前研究主要對水稻與氮素利用有關的表型如株高、分蘗等進行分析，較少分析氮含量直接指標，如不同時期、不同部位氮含量的測定，氮含量直接指標可以更有效地反映氮素在水稻體內不同時期、不同部位的變化情況，并且結合關聯分析形成動態的位點分析，既可以為氮素利用相關基因的克隆提供更多的位點，又可為氮高效利用育種的精準改良提供更精確的位點。

水稻氮素利用相關基因的研究有著廣闊的發展前景，隨著基因編輯技術等技術的不斷進步，可以更精確地研究和編輯水稻氮素利用相關基因。同時，組學研究結合大數據和人工智能等技術，可以更深入地挖掘水稻基因組中與氮素吸收、轉運、同化和再利用有關的基因，加速氮素利用相關基因的鑒定和功能驗證，從而縮短氮高效利用品種的育種周期。挖掘水稻氮素利用相關基因，研究水稻氮素利用的分子調控機制，培育氮高效利用水稻品種對于推動中國農業可持續發展、保障國家糧食安全都具有重要意義。

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