蛋白核小球藻產油率的影響因素

李成成 劉康欣 代百樂 陳雪茹 唐紅楓

摘要：采用BG-11為基礎培養基，通過添加、替換不同碳源和氮源、改變碳源和氮源比例、去除磷元素或硫元素及額外添加植物生長調節劑建立不同培養體系，進行蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）培養，考察各因素對蛋白核小球藻生長情況及產油率的影響。結果表明，無論是自養體系還是異養體系，蛋白核小球藻生長量和產油率均比普通小球藻（Chlorella vulgaris）更優，異養體系下2種小球藻產油率分別為20.14%和18.66%；葡萄糖為碳源時蛋白核小球藻生長情況最好且產油率最高，產油率為26.40%；氮源為尿素時蛋白核小球藻有最大產油率，為32.70%；碳氮比為30∶1時蛋白核小球藻產油率最高，為34.42%；硫元素缺乏時蛋白核小球藻產油率比對照提高28.54個百分點；1.5 mg/L茉莉酸干擾下，蛋白核小球藻產油率最高，為40.42%。由此得出，蛋白核小球藻生長量和產油率都比普通小球藻更優；葡萄糖為最優碳源；尿素為最優氮源；碳氮比為30∶1時產油率最高；硫元素缺乏時對蛋白核小球藻影響更大；1.5 mg/L茉莉酸干擾下，蛋白核小球藻產油率最高。

關鍵詞：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）；碳源；氮源；植物生長調節劑；產油率

中圖分類號：Q949.93? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）04-0037-04

Influencing factors of oil production rate of Chlorella pyrenoidosa

Abstract： BG-11 was used as the basic medium to establish different culture systems for Chlorella pyrenoidosa culture by adding and replacing different carbon and nitrogen sources， changing the proportion of carbon and nitrogen sources， removing phosphorus or sulfur and adding additional plant growth regulator， and the effects of various factors on the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were investigated. The results showed that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris in both autotrophic and heterotrophic systems. The oil production rates of the two Chlorella species in the heterotrophic system were 20.14% and 18.66%， respectively. When glucose was used as the carbon source， the growth of Chlorella pyrenoidosa was the best and the oil production rate was the highest， and the oil production rate was 26.40%. When the nitrogen source was urea， the maximum oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was got， and was 32.70%. The highest oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was 34.42% when the carbon-nitrogen ratio was 30∶1. The oil production rate of Chlorella pyrenoidosa under sulfur deficiency increased by 28.54 percentage points compared with the control. Under the interference of jasmonic acid with the concentration of 1.5 mg/L， the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest， which was 40.42%. The results indicated that the growth and oil production rate of Chlorella pyrenoidosa were better than those of Chlorella vulgaris； glucose was the best carbon source； urea was the best nitrogen source； the oil production rate was the highest when the carbon nitrogen ratio was 30∶1； sulfur deficiency had a greater effect on Chlorella pyrenoidosa； the oil production rate of Chlorella pyrenoidosa was the highest under the interference of jasmonic acid with a concentration of 1.5 mg/L.

Key words： Chlorella pyrenoidosa； carbon source； nitrogen source； plant growth regulator； oil production rate

伴隨著全球環境污染和氣候變暖，以煤炭、石油為典型代表的化石燃料正逐漸減少，找到對環境無污染的新型生物能源迫在眉睫［1］。生物柴油是一種以動植物油脂為原料制備、可替代化石柴油的新型生物燃料。然而使用動植物油脂成本過高，靠餐飲廢棄油脂能夠有效降低成本需求，但其來源有限且產品質量難以保證［2］。小球藻是一類體積小、結構簡單、生長繁殖迅速的微型自養生物，種類繁多，可以適應于不同的生長環境，并且在人工培養基中生長良好［3］，除能利用光能自養外，還可以異養培養。小球藻細胞中含有豐富的脂類、蛋白質、藻多糖、多種色素及礦質元素等。小球藻產生的油脂與甲醇反應可制得生物柴油［4］。以小球藻為載體，通過對小球藻進行培養，篩選出生長和產油均較好的藻株，針對其進行碳氮源、碳氮比、磷或硫元素缺乏、植物生長調節劑對小球藻油脂積累影響的研究，旨在尋求既能保證小球藻的生長又能提高其油脂產量，同時還能降低小球藻培養成本的方法，為利用小球藻生產生物柴油提供理論基礎［5，6］。

1 材料與方法

1.1 藻種

供試藻種為普通小球藻（Chlorella vulgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、EDTA、Na2CO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O等，試劑均為分析純。

主要儀器有D-37520型臺式離心機、BCD-247C型電冰箱、SPX-300B-G型恒溫光照培養箱、CB800V型超凈工作臺、LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋、紫外分光光度計等。

1.3 小球藻的培養

1.3.1 小球藻的擴培及更優藻種的篩選 分別配制BG-11（添加葡萄糖）及BG-11基礎培養基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取普通小球藻藻種、蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15min，取沉淀接種至各錐形瓶內（每個藻種每種培養液各3組平行樣，共12組），編號。23 ℃恒溫培養，光照度為2 000 lx，光/暗周期為12 h/12 h，每天3次定時充分搖動［7］。

1.3.2 不同碳源、氮源下小球藻的培養 配制含不同碳源（葡萄糖、乙酸鈉、碳酸氫鈉，濃度均為15 000 mg/L）及不同氮源（硝酸鈉、硝酸銨、尿素，濃度均為1 500 mg/L）的BG-11培養基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶內（不同碳源及氮源各3組平行樣，共18組），編號。培養條件同“1.3.1”。

1.3.3 最佳碳氮比的篩選 配制不同碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）［8］BG-11培養基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶內（不同碳氮比各3組平行樣，共18組），編號，培養條件同“1.3.1”。

1.3.4 缺磷、硫元素下小球藻的培養 配制BG-11［外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺磷）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（缺硫）、外加碳源葡萄糖15 000 mg/L（對照）］培養基100 mL，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶內（每種培養基各3組平行樣，共9組），編號，培養條件同“1.3.1”。

1.3.5 不同植物生長調節劑下小球藻的培養 分別配制含0.5、1.0、1.5 mg/L共3種濃度的水楊酸、脫落酸、茉莉酸的BG-11培養基各100 mL及基礎BG-11培養基100 mL（對照）［9］，高壓蒸氣滅菌。取蛋白核小球藻藻種10 mL，2 000 r/min離心15 min，取沉淀接種至各錐形瓶（不同濃度的各植物生長調節劑各3組平行樣，共30組），編號，培養條件同“1.3.1”。

1.4 藻細胞生長量測定

在無菌環境下將培養的小球藻取樣3 mL，置于無菌離心管中，標記。在波長為490 nm處測量蛋白核小球藻的吸光度，記錄。在培養階段每隔2 d測其吸光度，各平行樣取平均值，制作標準曲線，得到蛋白核小球藻的生長情況［10］。

1.5 藻細胞油脂含量的測定

在無菌環境下將培養的蛋白核小球藻取樣10 mL，5 000 r/min離心10 min獲取藻泥，經24 h 低溫干燥，獲取藻粉，稱重記為m0，再量取60 mL藻液，2 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀加少量去離子水洗出。將樣品置于細胞破碎儀下破碎，每次10 min，重復2次。加入氯仿∶甲醇（1∶2）9 mL與樣品混合均勻，取上清液加入10 g/L的NaCl，吸取氯仿層于潔凈干燥的試管中，60 ℃水浴鍋蒸去多余氯仿［11］。試管稱重記為m2，潔凈干燥試管稱重記為m1，藻細胞單位干重油脂含量即產油率（C）計算式如下。

C=（m2- m1）/6m0×100%

2 結果與分析

2.1 小球藻的擴培和更優藻種的篩選

建立不同的小球藻培養體系（自養體系和異養體系），在各培養體系中培養小球藻，試驗結果中普通小球藻和蛋白核小球藻在異養條件下所測得生長量和產油率都比自養條件下更優；蛋白核小球藻在2種培養體系中，無論是生長量還是產油率都比普通小球藻更優，如圖1、表1所示，因此選取蛋白核小球藻進行后續試驗。

2.2 蛋白核小球藻合適碳源、氮源的篩選

在基礎培養基BG-11的基礎上添加、置換不同種類的碳源15 000 mg/L（葡萄糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉）、氮源1 500 mg/L（硝酸鈉、硝酸銨、尿素）培養蛋白核小球藻。添加不同碳源情況下，蛋白核小球藻在以葡萄糖為碳源的條件下所測得的吸光度及產油率均為最優，乙酸鈉次之（圖2、表2）。謝林靜等［12］的研究表明，相對于葡萄糖為碳源的小球藻來說，以乙酸鈉為碳源的小球藻的生物量要小一些。添加不同氮源情況下，蛋白核小球藻在以硝酸鈉為氮源的條件下所測得吸光度最優，硝酸銨次之，尿素最小（圖2）。但是蛋白核小球藻在以尿素為氮源的條件下所測得的產油率最大，為32.70%；硝酸鈉次之，為18.42%；硝酸銨最小，為17.50%。金虹等［13］的研究表明，在添加尿素的環境中，小球藻生物量和產油率明顯高于其他氮源和無氮環境。

2.3 異養條件下適合小球藻生長和油脂積累的最佳碳氮比篩選

采用最適合蛋白核小球藻生長和油脂積累的碳源（葡萄糖）與氮源（尿素），設置合適碳氮比（30∶1、30∶3、30∶9、60∶1、60∶3、60∶9）培養小球藻，其中碳氮比為60∶1的培養基中蛋白核小球藻的長勢最好，其他依次為30∶9、30∶1、60∶3、30∶3和60∶9（圖3）。碳氮比為30∶1的培養基中蛋白核小球藻的產油率最高，為34.42%，其次為碳氮比60∶1，產油率為29.78%，其中碳氮比為30∶3的產油率最低，產油率為17.79%（表3）。

2.4 磷、硫缺乏對小球藻生長和油脂積累的影響

建立不同的培養體系，測定缺磷或硫元素情況下蛋白核小球藻生長量和油脂積累量，得出硫、磷元素缺乏對蛋白核小球藻生長和油脂積累的影響。與對照相比，當培養基中磷、硫元素缺乏時，蛋白核小球藻的生長量會有所下降，特別是缺乏硫元素的培養基會使蛋白核小球藻生長量大幅度下降，而缺乏磷元素的培養基下降幅度比缺乏硫元素的培養基小，但一段時間后仍然會大幅度下降（圖4）。蔡佳佳等［14］的研究表明，缺硫對藻株生長的抑制作用要大于缺磷。雖然硫的缺乏會使蛋白核小球藻的生物量大幅度減少，但能促進蛋白核小球藻油脂的積累，其含油量最高，為48.10%，磷的缺乏只能小幅度提高藻株的含油量（表4）。

2.5 自養條件下不同植物生長調節劑對小球藻生長和油脂積累的影響

在自養培養條件下，根據植物生長調節劑種類和濃度的設置建立不同的培養體系，測定不同植物生長調節劑條件下蛋白核小球藻生長量和產油率（圖5至圖8、表5）。結果表明，0.5 mg/L茉莉酸、1.0 mg/L茉莉酸、1.5 mg/L脫落酸、1.5 mg/L水楊酸對蛋白核小球藻的生長有促進作用，其中1.0 mg/L茉莉酸對蛋白核小球藻生長有最大促進作用。在油脂的測定中，1.5 mg/L茉莉酸培養條件對蛋白核小球藻生長后期雖無促進作用，但對蛋白核小球藻油脂積累促進效果最好。0.5 mg/L脫落酸培養條件下，蛋白核小球藻產油率最低，隨著脫落酸含量的上升，蛋白核小球藻的產油率增加。肖丹曦［15］的研究表明，脫落酸對藻類生長具有一定的影響。水楊酸濃度為0.5 mg/L時，對應的藻細胞產油率低于對照，隨著水楊酸濃度的上升，蛋白核小球藻的產油率增加。以上3種植物生長調節劑中，茉莉酸對蛋白核小球藻的油脂積累促進效果最好。

3 小結

本試驗通過測定蛋白核小球藻培養液吸光值間接反映蛋白核小球藻的生長情況，并通過細胞破碎法，氯仿-甲醇提取法測定蛋白核小球藻的產油率，得到結果如下。

1）不同碳源情況下，蛋白核小球藻在以葡萄糖為碳源的條件下所測得的吸光度以及產油率均最優；添加不同氮源情況下，蛋白核小球藻在以硝酸鈉為氮源的條件下所測得的吸光度最優，乙酸鈉次之，但是蛋白核小球藻在以尿素為氮源的條件下所測得的產油率最大。

2）碳氮比為60∶1的培養基中蛋白核小球藻的長勢最好，碳氮比為30∶1的培養基中蛋白核小球藻的產油率最高。

3）培養基中缺硫比缺磷對蛋白核小球藻生長量和油脂產量影響更大。

4）茉莉酸濃度為1.0 mg/L時對蛋白核小球藻生長有最大促進作用；茉莉酸、脫落酸和水楊酸3種植物生長調節劑中，1.5 mg/L茉莉酸對蛋白核小球藻油脂積累有最大促進作用。

參考文獻：

［1］ 孫 婷，杜 偉， 劉德華， 等.固定全細胞催化可再生油脂合成生物柴油的穩定性［J］ .生物工程學報，2009，25（9）：1379-1385.

［2］ CHISTI Y. Biodiesel from microalgae［J］. Biotechnology advances，2007，25（3）：294-306.

［3］ 金 城.小球藻生產生物柴油的研究［J］.微生物學通報，2010，37（8）： 1258.

［4］ 毛功平，王 威，石凱凱，等.野生小球藻生物柴油制備工藝的優化研究［J］.可再生能源，2019，37（7）：965-971.

［5］ 周 艷，汪 旭，王蘊博，等.一種戶外開放式微藻培養體系優化［J］.廣東海洋大學學報，2021，41（2）：33-40.

［6］ 張 勇，陳 燕，李欣陽，等.微生物混合培養生產油脂的研究進展［J］.中國油脂，2022，47（4）：133-137，152.

［7］ 張正潔， 汪 蘋.自養小球藻培養條件的優化［J］.北京工商大學學報（自然科學版）， 2011， 29（1）：54-58.

［8］ 范同強，黃有軍.不同碳氮比對小球藻增殖及油脂積累的影響［J］.安徽農業科學，2020，48（11）：7-10.

［9］ 蔣麗群.植物激素提高微藻在廢水中的活性和生物質積累的過程及機制［D］.濟南：山東大學，2019.

［10］ 潘孝妍.微藻油脂積累的環境調控及分子機制研究［D］.海口：海南大學，2020.

［11］ 劉 飛，王 超，王振瑤，等.植物激素誘導對小球藻Chlorella vulgaris細胞生物量和油脂合成積累的影響［J］.中國生物制品學雜志，2017，30（4）：390-394.

［12］ 謝林靜，韓宇馳.不同有機碳源對小球藻的生長與產油量的影響［J］.湖南環境生物職業技術學院學報，2013，19（4）：8-11.

［13］ 金 虹， HONG P K A， BAO D，等.不同碳氮源對一株產油小球藻油脂積累的影響［J］.安徽師范大學學報（自然科學版），2014，37（4）：363-365，400.

［14］ 蔡佳佳，費小雯，李亞軍，等.元素缺乏和外加碳源對小球藻（Chlorella sp KMMCC FC-21）生長和油脂積累的影響［J］.熱帶作物學報，2011，32（11）：2029-2036.

［15］ 肖丹曦.植物激素ABA和GA對紫球藻生長的影響［D］.廣州：暨南大學，2009.