PEG降低HIV第四代試劑檢測假陽性干擾的研究

陽冬冬 穆銀玉 張日伊 李靜 徐琳

[摘要]?目的?探討聚乙二醇（polyethylene?glycol，PEG）沉淀法降低化學(xué)發(fā)光法人類免疫缺陷病毒（human?immunodeficiency?virus，HIV）第四代試劑檢測假陽性干擾的研究。方法?選取2022年1月至6月就診于寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院的門診和住院患者109例，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法初篩陽性的樣本經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法確證實驗，確證真陽性樣本20例、假陽性樣本89例。根據(jù)是否添加處理劑將假陽性樣本分為三組：無PEG沉淀組（無特殊處理，89例）、PEG沉淀組（PEG沉淀處理，89例）和對照組（生理鹽水處理，89例），離心后測定上清液HIV抗原/抗體（antigen/antibody，Ag/Ab）水平，比較不同處理方法前后HIV?Ag/Ab水平的差異及回收率。結(jié)果?處理后，PEG沉淀組和對照組的HIV?Ag/Ab濃度顯著均低于無PEG沉淀組（P<0.001）。處理后，PEG沉淀組陽性3例，對照組陽性56例，陽性率均顯著低于無PEG沉淀組（P<0.001）；PEG沉淀組的回收率為4.92（2.12，12.69）%，對照組的回收率為65.28（18.04，91.28）%。不論P(yáng)EG處理還是生理鹽水處理，真陽性樣本的回收率均>50%。結(jié)論?PEG沉淀法可有效降低化學(xué)發(fā)光法HIV第四代試劑檢測的假陽性干擾，且對真陽性樣本無影響。

[關(guān)鍵詞]?人類免疫缺陷病毒；聚乙二醇；化學(xué)發(fā)光法；假陽性；干擾

[中圖分類號]?R446.1??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.13.011

Study?on?PEG?reducing?false?positive?interference?in?HIV?fourth?generation?reagent?detection

YANG?Dongdong，?MU?Yinyu，?ZHANG?Riyi，?LI?Jing，?XU?Lin

Clinical?Laboratory，?Ningbo?Medical?Center，?Lihuili?Hospital，?Ningbo?315040，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?Study?on?the?reduction?of?false?positive?interference?in?the?detection?of?human?immunodeficiency?virus?（HIV）?by?chemiluminescence?method?with?polyethylene?glycol?（PEG）?precipitation.?Methods??A?total?of?109?outpatients?and?inpatients?in?Ningbo?Medical?Center，?Lihuili?Hospital?from?January?to?June?2022?were?selected.?The?positive?samples?initially?screened?by?chemiluminescence?method?were?confirmed?by?Western?blotting，?and?20?true?positive?samples?and?89?false?positive?samples?were?confirmed.?According?to?whether?treatment?agent?was?added，?the?false-positive?samples?were?divided?into?three?groups：?no?PEG?precipitation?group?（no?special?treatment，?89?cases），?PEG?precipitation?group?（PEG?precipitation?treatment，?89?cases）?and?control?group?（normal?saline?treatment，?89?cases）.?The?level?of?HIV?antigen/antibody?（Ag/Ab）?in?supernatant?was?measured?after?centrifugation，?and?the?difference?of?HIV?Ag/Ab?level?and?recovery?rate?before?and?after?different?treatment?methods?were?compared.?Results??After?intervention，?the?HIV?Ag/Ab?concentration?in?PEG?precipitation?group?and?control?group?was?significantly?lower?than?that?in?non-PEG?precipitation?group?（P<0.001）.?After?intervention，?there?were?3?positive?cases?in?PEG?precipitation?group?and?56?positive?cases?in?control?group，?and?the?positive?rates?were?significantly?lower?than?those?in?non-PEG?precipitation?group?（P<0.001）.?The?recovery?rate?of?PEG?precipitation?group?was?4.92?（2.12，?12.69）%，?and?that?of?control?group?was?65.28?（18.04，?91.28）%.?The?recovery?rate?of?true?positive?samples?was?>?50%?regardless?of?PEG?treatment?or?normal?saline?treatment.?Conclusion?PEG?precipitation?method?can?effectively?reduce?the?false?positive?interference?of?chemiluminescent?HIV?fourth-generation?reagent?detection，?and?has?no?effect?on?true?positive?samples.

[Key?words]?Human?immunodeficiency?virus;?Polyethylene?glycol;?Chemiluminescence;?False?positive;?Interference

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired?immunodeficiency?syndrome，AIDS）是一種由人類免疫缺陷病毒（human?immunodeficiency?virus，HIV）感染引起的危害性極大的傳染病。HIV主要攻擊并破壞人體免疫系統(tǒng)?CD4?T淋巴細(xì)胞使人體喪失免疫功能。目前HIV感染尚無法治愈，因此早期準(zhǔn)確診斷顯得尤為重要[1]。臨床實驗室診斷HIV主要有第三代HIV試劑、第四代HIV試劑、蛋白質(zhì)印跡法及核酸補(bǔ)充檢測等方法，但各有優(yōu)缺點[2]。化學(xué)發(fā)光法第四代HIV試劑比第三代試劑可縮短HIV檢測窗口期，敏感度有所提高，操作簡單，檢測時間短，但假陽性率也隨之提高；假陽性的出現(xiàn)不僅給實驗室的報告工作帶來負(fù)擔(dān)，且對患者心理產(chǎn)生極大影響，因此如何降低化學(xué)發(fā)光法檢測HIV的假陽性干擾是急需解決的問題。

目前臨床實驗室檢測HIV多為免疫學(xué)方法，但該檢測方法受多種因素如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、自身抗體、補(bǔ)體、纖維蛋白、溶血或脂血、交叉反應(yīng)物質(zhì)、交叉污染等干擾可造成假陽性結(jié)果。針對假陽性出現(xiàn)的原因，常見的處理方法有高速離心、37℃水浴后再離心檢測、稀釋樣本、聚乙二醇（polyethylene?glycol，PEG）沉淀法和重新采血復(fù)檢等[3-4]。PEG是一種高分子聚合物，可廣泛與蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸和納米粒子等結(jié)合，在消除實驗室診斷干擾方面可發(fā)揮重要作用[5]。本研究對初篩HIV抗原/抗體（antigen/antibody，Ag/Ab）陽性的樣本進(jìn)行PEG沉淀處理，觀察PEG沉淀法是否可降低化學(xué)發(fā)光法HIV第四代試劑檢測的假陽性干擾。

1??資料與方法

1.1??研究對象

選取2022年1月至6月就診于寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院的門診和住院患者109例，其中男55例，女54例，平均年齡（52.08±18.10）歲。經(jīng)化學(xué)發(fā)光法初篩陽性的樣本經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法確證實驗，確證真陽性樣本20例、假陽性樣本89例。根據(jù)是否添加處理劑將假陽性樣本分為三組：無PEG沉淀組（89例）、PEG沉淀組（89例）和對照組（89例）。回收率=（處理后HIV?Ag/Ab檢測值/處理前HIV?Ag/Ab檢測值）×100%，回收率<50%提示樣本中含有干擾物質(zhì)。本研究經(jīng)寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：李惠利醫(yī)院倫審2022研第430號）。

1.2??儀器與試劑

化學(xué)發(fā)光分析儀（Magulumi4000Plus，深圳新產(chǎn)業(yè)，中國），HIV第四代試劑（深圳新產(chǎn)業(yè)，中國，批號114210811）；WB試劑盒（recomLine?HIV?1＆HIV2?IgG，?德國，批號M6672），實驗過程嚴(yán)格按照試劑及儀器說明書操作。

1.3??樣本處理及檢測方法

1.3.1??樣本處理??采集患者靜脈血5ml置于促凝管，3500轉(zhuǎn)/min離心10min，留取上清液用于測定HIV濃度。

1.3.2??檢測方法??25%?PEG水溶液用作HIV的沉淀劑。貯存于2～8℃冰箱，有效期3個月。使用前置室溫平衡，達(dá)到室溫后使用。無PEG沉淀組：樣本直接用化學(xué)發(fā)光法檢測。PEG沉淀組：樣本經(jīng)PEG處理后再用化學(xué)發(fā)光法檢測。PEG沉淀處理：300μl血清加等量300μl的25%?PEG溶液，充分混勻后室溫放置5min，3500轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清液于發(fā)光分析儀上檢測HIV濃度。對照組：300μl血清加等量300μl生理鹽水，充分混勻后室溫放置5min，3500轉(zhuǎn)/min離心5min，取上清液于發(fā)光分析儀上檢測HIV濃度。真陽性樣本分別使用PEG和生理鹽水處理，方法同上。HIV結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HIV?Ag/Ab濃度<1AU/ml為陰性，≥1AU/ml為陽性。

1.4??統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS?26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)K-S法檢測屬非正態(tài)分布的以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，比較采用非參數(shù)Mann-Whitney?U檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??各組HIV假陽性樣本HIV?Ag/Ab水平比較

處理后，PEG沉淀組的HIV?Ag/Ab濃度顯著低于無PEG沉淀組[0.14（0.05，0.26）AU/ml?vs.?2.15（1.35，3.73）AU/ml，Z=8.127，P<0.001]，無PEG沉淀組的HIV?Ag/Ab濃度顯著高于對照組[2.15（1.35，3.73）AU/ml?vs.?1.45（0.30，2.56）AU/ml，Z=6.393，P<0.001]。

2.2??各組HIV假陽性樣本處理后HIV?Ag/Ab陽性率比較

處理后，PEG沉淀組的HIV?Ag/Ab陽性率為3.37%（3/89），顯著低于無PEG沉淀組（χ2=166.391，P<0.001）；對照組的HIV?Ag/Ab陽性率顯著低于無PEG沉淀組（62.92%?vs.?100%，χ2=40.510，P<0.001）。

2.3??PEG沉淀組和對照組的回收率比較

處理后，PEG沉淀組的HIV?Ag/Ab濃度明顯降低，回收率為4.92（2.12，12.69）%，對照組的回收率為65.28（18.04，91.28）%，見表1。

2.4??真陽性樣本的回收率情況

不論P(yáng)EG處理還是生理鹽水處理，真陽性樣本的回收率均>50%，見表2。

3??討論

隨著HIV病毒在全球的蔓延，受感染人群逐漸增加，但目前尚無特效治療措施。HIV感染者往往繼發(fā)心理疾病，如焦慮、抑郁、恥感等心理問題，給患者及家屬帶來極大的心理負(fù)擔(dān)[6-7]。因此快速準(zhǔn)確地檢測出HIV已成為實驗室工作中刻不容緩的責(zé)任。

目前，診斷HIV感染的實驗室方法很多，但其敏感度、特異性各有差異，假陽性率較高。假陽性的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，如樣本的狀態(tài)、是否為脂血或溶血、試劑本身的缺陷及檢測方法等[8]。HIV第四代試劑可同時檢測HIV抗體與P24抗原，較第三代試劑敏感度有所提升，假陽性率也有所下降[9]。但仍有研究表明HIV第四代試劑檢測具有較高的假陽性率。方歡英等[10]發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法低信號界值比（signal/cutoff，S/CO）樣本假陽性率較高，隨著S/CO值的增加，與確證實驗的陽性符合率也升高。Cui等[11]發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法篩查HIV?Ag/Ab假陽性結(jié)果受臨床干擾因素（如腎臟疾病、腫瘤）影響；本研究中16例假陽性患者為腎臟疾病和腫瘤患者，與Cui等報道一致。另外，與陳超超等[12]提出類風(fēng)濕因子在化學(xué)發(fā)光法中引起假陽性也有相似之處。

PEG為一種高分子聚合物，研究發(fā)現(xiàn)其可與多種抗體、補(bǔ)體等大分子結(jié)合，從而達(dá)到減少干擾的目的[13-14]。王燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)PEG沉淀法在泌乳素血癥篩查中有一定的價值，對單體泌乳素灰區(qū)的設(shè)置是有效的，可排除20%的假陽性巨泌乳素血癥患者。戴悅等[16]的研究也表明PEG沉淀法對篩查巨泌乳素血癥，鑒別由垂體瘤或其他原因引起的假陽性病例有幫助，與本研究的PEG沉淀法可降低HIV假陽性的結(jié)果一致。

本研究中假陽性樣本的回收率低于50%，說明PEG可有效去除干擾因素，這有利于提高診斷水平和檢測質(zhì)量。PEG能消除干擾因素的原因可能有以下幾點：①患者體內(nèi)含抗體、補(bǔ)體及異常蛋白等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)與試劑包被的抗原成分結(jié)合，干擾檢測而導(dǎo)致假陽性。②樣本未充分離心，含有較多纖維蛋白原，導(dǎo)致假陽性。89例樣本中還有3例未能消除干擾，樣本中可能還存在其他的干擾物質(zhì)，如交叉抗原、異嗜性抗原等，這些干擾因素使用PEG無法消除。另外，本研究發(fā)現(xiàn)采用生理鹽水稀釋也可消除部分假陽性干擾，但消除干擾的能力顯著低于PEG沉淀法。

總之，PEG沉淀法可消除部分化學(xué)發(fā)光法HIV第四代試劑檢測的假陽性干擾，且對真陽性樣本無影響，可提高實驗室檢測的準(zhǔn)確性、減輕患者心理負(fù)擔(dān)，在AIDS的篩查中具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Chen?J，?Zhou?T，?Zhang?Y，?et?al.?The?reservoir?of?latent?HIV[J].?Front?Cell?Infect?Microbiol，?2022，?12（1）：?945956.

[2] 張亞蘭，?衛(wèi)曉麗，?鄭海潮，?等.?使用四代HIV抗原抗體試劑篩查聯(lián)合蛋白印跡或核酸補(bǔ)充實驗的檢測策略臨床評價[J].?中國艾滋病性病，?2018，?24（3）：?286–288，?306.

[3] 賈珂珂，?孫文苑，?聶睿，?等.?免疫透射比濁法常見干擾因素的識別與應(yīng)對策略[J].?檢驗醫(yī)學(xué)，?2021，?36（4）：?362–368.

[4] 郝俊峰，?王丹，?朱海寧.?3種不同除脂方法在消除脂血對丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶檢測干擾的比較研究[J].?心理月刊，?2020，?15（7）：?169.

[5] HOANG?THI?T?T，?PILKINGTON?E?H，?NGUYEN?D?H，?et?al.?The?importance?of?poly?（ethylene?glycol）?alternatives?for?overcoming?PEG?immunogenicity?in?drug?delivery?and?bioconjugation[J].?Polymers?（Basel），?2020，?12（2）：?298.

[6] 李瀟，?韓晶，?劉宇，?等.?新診斷HIV感染的中青年男男性行為者抑郁焦慮發(fā)生現(xiàn)狀及其影響因素[J].?中國艾滋病性病，?2022，?28（3）：?299–304.

[7] 張兵，?郭會敏，?欒玉泉，?等.?HIV/AIDS患者的心理問題及心理干預(yù)現(xiàn)狀[J].?中國艾滋病性病，?2021，?27（6）：?671–674.

[8] 宋靜艷.?溶血對臨床免疫和生化檢驗項目的干擾和影響[J].?臨床檢驗雜志（電子版），?2020，?9（1）：?15–16.

[9] Wiredja?D，?Ritchie?T?A，?Tam?G，?et?al.?Performance?evaluation?and?optimized?reporting?workflow?for?HIV?diagnostic?screening?and?confirmatory?tests?in?a?low?prevalence?setting[J].?J?Clin?Virol，?2021，?145：?105020.

[10] 方歡英，?郭金虎，?姜鵬飛，?等.?第四代電化學(xué)發(fā)光HIV篩查試劑在AIDS診斷中的應(yīng)用探討[J].?中國皮膚性病學(xué)雜志，?2020，?34（8）：?959–963.

[11] Cui?C，?Liu?P，?Feng?Z，?et?al.?Evaluation?of?the?clinical?effectiveness?of?HIV?antigen/antibody?screening?using?a?chemiluminescence?microparticle?immunoassay[J].?J?Virol?Methods，?2015，?214：?33–36.