玉米ZmZIM家族基因鑒定及其對氮素的響應特征

孫揚名 張明亮 葛敏 鄔奇 趙涵

摘要：為明確玉米ZmZIM家族基因結構、位置、編碼蛋白質性質及其對氮素的響應特征，本研究利用TBtools、MEGA X等軟件分析玉米ZmZIM家族基因的結構、染色體位置、順式作用元件及系統發育關系及其編碼蛋白質的理化性質、保守結構域及基序，結合玉米不同發育時期不同器官的轉錄組數據及充足氮與低氮水平下四葉一心期玉米地上部轉錄組數據解析玉米ZmZIM家族基因的表達模式及差異。結果表明：從玉米全基因組中共鑒定到32個玉米ZmZIM基因，主要分布于1號、2號、5號和7號染色體， 8號和10號染色體上無ZmZIM基因。32個ZmZIM基因可劃分為4個亞類，其編碼蛋白質由134～467個氨基酸殘基構成，均為親水性蛋白質且全部定位在細胞核中。32個ZmZIM基因啟動子區域順式作用元件主要有調控元件、光信號響應元件、激素信號響應元件、脅迫響應元件、生長發育元件及蛋白質結合位點等6大類。不同發育時期，ZmZIM基因在玉米不同器官中存在差異性表達；在充足氮與低氮處理下，隨著處理時間的增加，玉米植株地上部12個ZmZIM基因無表達或相對表達量較低，6個ZmZIM基因相對表達量較高且穩定，其余的14個ZmZIM基因的相對表達量差異較大；ZmZIM5、ZmZIM16、和ZmZIM31 3個基因的相對表達量普遍高于其他基因。充足氮條件下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對表達量普遍高于低氮條件。本研究結果為玉米氮高效吸收利用基因篩選和利用奠定基礎。

關鍵詞：玉米；ZIM轉錄因子；基因家族分析；氮響應

中圖分類號：S513文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0577-14

Identification of ZmZIM family genes and their response to nitrogen in maize

SUN Yang-ming1，2，ZHANG Ming-liang2，GE Min2，WU Qi2，ZHAO Han2

（1.College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;2.Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：In order to clarify the structure， location， encoded protein properties and response characteristics of maize ZmZIM family genes to nitrogen， this study used TBtools， MEGA X and other softwares to analyze the structure， chromosome location， cis-acting elements and phylogenetic relationships of maize ZmZIM family genes and the physical and chemical properties， conserved domain and motifs of their encoded proteins. The expression patterns and differences of maize ZmZIM family genes were analyzed by combining the transcriptome data of different organs at different development stages of maize and the transcriptome data of maize shoots at four-leaf and one-heart stage under sufficient nitrogen and low nitrogen levels. The results showed that a total of 32 ZmZIM genes were identified from the whole genome of maize， which were mainly distributed on chromosomes 1， 2， 5 and 7， and no ZmZIM genes were found on chromosomes 8 and 10. The 32 ZmZIM genes could be divided into four subclasses， and the encoded proteins were composed of 134-467 amino acid residues， all of which were hydrophilic proteins and located in the nucleus. The cis-acting elements in the promoter region of 32 ZmZIM genes were mainly divided into six categories： regulatory elements， light signal response elements， hormone signal response elements， stress response elements， growth and development elements and protein binding sites. At different developmental stages， ZmZIM gene was differentially expressed in different organs of maize. Under sufficient nitrogen and low nitrogen treatments， with the increase of treatment time， the 12 ZmZIM genes in the aboveground part of maize plants had no expression or low relative expression， the relative expression of six ZmZIM genes was high and stable， and the relative expression of the remaining 14 ZmZIM genes varied greatly. The relative expression levels of ZmZIM5， ZmZIM16， and ZmZIM31 were generally higher than other genes. Under sufficient nitrogen conditions， the relative expression levels of ZmZIM8， ZmZIM15， ZmZIM20， ZmZIM24， ZmZIM29 and ZmZIM31 were generally higher than those under low nitrogen conditions. The results of this study lay a foundation for the screening and utilization of nitrogen efficient absorption and utilization genes in maize.

Key words：maize;ZIM transcription factors;gene family analysis;nitrogen response

ZIM（Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem）轉錄因子含有C2C2-GATA鋅指結構（CX2CX20CX2C，其中X代表任意氨基酸），由Nishii等[1]從擬南芥花序分生組織中發現，因此被命名為ZIM。隨后GATA鋅指結構在其他蛋白質中也被發現，相應的蛋白質被歸入植物特異性轉錄因子GATA家族[2-3]。ZIM蛋白除了含鋅指結構域外，還包含一段由36個氨基酸殘基構成的結構域（T[I/L]F[F/Y]XG，其中X代表任意氨基酸），但該結構域在各數據庫中使用的基序略有不同。White[4]報道了擬南芥中另外兩個分別由AT4G14713和AT4G14720基因編碼的PEAPOD1蛋白和PEAPOD2蛋白，含有TIFY及一段特殊結構域。與ZIM蛋白不同的是，PEAPOD蛋白不存在GATA結構域，因此將其歸類為C2C2-GATA家族并不準確，Vanholme等[5]認為應將其重新命名并歸類為TIFY家族。在TIFY超轉錄因子家族中僅含有TIFY結構域的蛋白劃分為TIFY亞族，含有TIFY結構域和Jas結構域的劃分為JAZ亞族，同時含有TIFY、GATA和CCT結構域的劃分為ZML亞族，在N端包含一段PEAPOD蛋白且序列中含有TIFY結構域的劃分為PPD亞族[4，6-9]。本研究沿用以ZIM命名的蛋白質進行研究。玉米是世界上最主要的糧食作物之一，在工業、農業、食品等行業都起著重要的作用[10-11]，但生產中由于氮肥的過度施用，導致玉米的氮肥利用效率較低[12]。ZIM家族在植物生長發育、非生物脅迫（高鹽、低溫和干旱）應對及茉莉酸信號通路調控等多種反應中發揮重要作用[13-14]。因此研究玉米ZIM基因家族的特征、表達模式，解析玉米ZIM基因家族在氮素響應中的分子機制對選育氮高效玉米品種具有重要意義。

自2000年Nishii等[1]從擬南芥中首次鑒定到AtZIM1基因以來，水稻[15]、葡萄[16]、二穗短柄草[13]、大豆[17]、棉花[18-19]、小麥[20]、西瓜[21]、木薯[22]、番茄[6]、杜仲[14]、柑橘[23]等植物中的ZIM基因繼續得到了鑒定。同時ZIM家族基因的功能也得到了廣泛研究。擬南芥JAZ蛋白可與AtMYB21和AtMYB24的R2R3結構域結合導致擬南芥雄性不育，接收到茉莉酸信號后COI1結合JAZ蛋白并被泛素化降解使AtMYB21和AtMYB24激活下游基因表達調控雄蕊發育[24]；蘋果MdABI4蛋白與ICE1和JAZ蛋白互作形成JAZ-ABI4-ICE1-CBF模塊調控ABA（脫落酸）信號介導的蘋果耐冷性[25]； SlJAZ10和SlJAZ11蛋白不僅可通過茉莉酸信號來抑制番茄葉片衰老，還可通過協同電信號、鈣離子信號等調控番茄再生[26]；丙烯可誘導MaTIFY1基因表達，加快香蕉果實成熟[27]；小麥TaZIM-A1基因的表達量有明顯的晝夜節律，且過表達TaZIM-A1基因會下調部分關鍵開花調控基因的表達量進而導致小麥開花時間的推遲[28]；鹽脅迫下過表達TdTIFY11a基因可使小麥在高滲透壓條件下仍保持較高的成活率及發芽率[29]，同樣PnJAZ1蛋白賦予核桃種子較高的萌發率及耐鹽性[30]；TIFY家族基因積極參與毛果楊對高鹽、極端溫度、干旱等非生物脅迫的調控過程[31]。

雖然ZIM家族基因及其功能在多種植物中得到了研究，但玉米ZIM家族基因的鑒定及氮素響應特征研究還鮮見報道。本研究基于玉米V5版本的基因組數據，利用生物信息學及TBtools軟件鑒定玉米ZmZIM基因家族成員，從基因的結構、染色體位置、系統進化關系、啟動區域順式作用元件及表達模式及其編碼蛋白質的理化性質、蛋白質結構、保守基序等角度解析ZmZIM基因家族的特性，并通過充足氮及低氮水平下玉米地上部的轉錄組測序，進一步分析玉米ZmZIM家族基因的表達量差異，旨在為ZmZIM家族基因對氮素的響應機制挖掘及氮高效利用玉米種質選育提供依據。

1材料與方法

1.1玉米ZmZIM家族基因的鑒定及其在染色體上的分布

從MaizeGDB網站和EnsemblPlant數據庫分別下載玉米B73_RefGen_V5版本ZIM家族蛋白質氨基酸序列和全部蛋白質氨基酸序列，利用TBtools提取ZIM家族的蛋白質氨基酸序列，通過氨基酸序列比對后保留序列相同的蛋白質氨基酸序列，并在NCBI網站下載玉米ZIM家族蛋白質氨基酸序列，將兩種方式獲得的ZIM家族蛋白質氨基酸序列再次進行比對，選擇兩次比對結果中氨基酸序列均一致的蛋白質氨基酸序列作為玉米ZIM家族蛋白質氨基酸序列用于后續分析。使用TBtools軟件的Gene Location Visualize from GXF模塊分析玉米ZmZIM家族基因在染色體上的位置[32]。

1.2玉米ZmZIM基因編碼蛋白質的理化性質分析及亞細胞定位

采用TBtools軟件中Protein Parameter Calc程序進行ZIM家族基因編碼蛋白質的氨基酸數目、理論等電點（PI）、不穩定指數、脂肪系數、平均親水系數等理化性質分析。根據蛋白質氨基酸序列采用Cell-PLoc2.0網站進行玉米ZIM蛋白的亞細胞定位。

1.3基因結構分析及蛋白質結構分析

利用TBtools軟件結合保守結構域數據庫（CDD）和基因編碼蛋白質氨基酸序列進行玉米ZIM家族保守結構域預測。設置保守基序（Motif）最大數值為20，采用TBtools軟件的Simple MEME Wrapper模塊進行玉米ZIM家族蛋白質保守基序預測。根據ZmZIM家族基因的編號（ID）下載對應的基因序列，利用TBtools軟件的Gene Structures View模塊對下載的ZmZIM基因序列進行基因非編碼區（UTR）及編碼序列（CDS）分析。

1.4啟動子順式作用元件分析

首先利用TBtools軟件的GXF Sequences Extract模塊提取玉米基因組全部基因CDS上游2 000 bp的序列，隨后使用TBtools中Fasta Extract模塊提取ZmZIM家族基因CDS上游2 000 bp序列，再利用PlantCARE在線網站預測啟動子區域的順式作用元件，對各個基因中存在的無過多生物學意義的元件如TATA-box、CAAT-box等元件進行刪減后，保留注釋文件中具有抗逆、光響應、激素響應等功能的順式作用元件，利用TBtools中Basic BioSequence View模塊對玉米ZmZIM家族基因啟動子區域順式作用元件可視化。

1.5系統發育樹分析

采用MEGA-X軟件的MUSCLE模塊對玉米ZmZIM蛋白進行多序列比對[33]，設置Bookstrap值為1 000，利用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，并利用iTOL在線網站進行進化樹的可視化。

1.6表達模式分析

以玉米自交系B73為試驗材料，先在育苗盤中育苗，待發芽后選取長勢相近的個體移栽至人工攪拌均勻的基質中，每3 d補水1次，保證基質水分適宜，期間適當施加尿素及復合肥保證植株正常生長。在玉米生長發育的不同階段對不同組織取樣并進行轉錄組測序，每樣品3個重復。利用FastQC v11.9[34]和Fastp軟件進行測序結果的質量控制，按照默認參數去除重復和低質量的read，得到高質量序列（Clean data）。利用Hisat2 v2.2.1[35]將Clean data比對到玉米參考基因組（B73_RefGen_v5），然后利用Samtools v1.19[36]軟件將SAM文件轉化成BAM文件并排序，參考基因組數據和注釋信息下載自MaizeGDB數據庫。提取玉米ZmZIM家族基因的FPKM值，統計獲得ZmZIM家族基因的相對表達量。利用TBtools軟件進行不同生長發育階段不同組織ZmZIM家族基因表達量的熱圖（Heat map）制作與分析。

1.7ZmZIM家族基因對氮素的響應

以玉米自交系B73為試驗材料，于2023年3月進行水培處理。種子發芽后移入含2 mmol/L KNO3的Hoagland培養液中，每3 d更換1次培養液，待植株長至四葉一心時移入充足氮（50 mmol/L KNO3）和低氮（05 mmol/L KNO3+45 mmol/L KCl）的水培液中進行不同氮素水平培育，并于處理后0 h、05 h、10 h、15 h、20 h、30 h、40 h、60 h、80 h時進行地上部取樣，取得樣品采用植物總RNA提取試劑盒（南京諾唯贊醫療科技有限公司產品）提取RNA后，送北京貝瑞和康生物技術有限公司進行轉錄組測序，測序結果參照材料與方法16中的方法進行質量控制與表達量分析，進而得到不同氮素水平下ZmZIM家族基因表達量的熱圖。

2結果與分析

2.1玉米ZIM家族基因的鑒定及分析

根據MaizeGDB網站及NCBI網站比對后共鑒定出32個玉米ZIM基因。將獲得的32個ZIM基因按照其在染色體分布位置依次命名為ZmZIM1～ZmZIM32。32個ZIM基因不均勻分布在玉米8條染色體上（圖1）。其中1號染色體含有10個ZmZIM基因，2號、5號染色體各分布6個ZmZIM基因，3號、7號染色體分別分布2個和5個ZmZIM基因，4號、6號、9號染色體各分布1個ZmZIM基因。值得注意的是ZmZIM基因有時在染色體上成簇分布，每簇包含3個ZmZIM基因，如1號染色體含有2個ZmZIM基因簇（ZmZIM1、ZmZIM2、ZmZIM3和ZmZIM6、ZmZIM7、ZmZIM8），5號染色體含有1個ZmZIM基因簇（ZmZIM22、ZmZIM23、ZmZIM24）。32個ZmZIM基因的編碼蛋白質共鑒定出3個典型的特征結構域（圖2），其中含TIFY結構域的共27個，含CCT結構域的共31個，僅ZmZIM4基因的編碼蛋白質不含有CCT結構域，同時含鋅指結構域GATA、TIFY結構域和CCT結構域的編碼蛋白質共4個（ZmZIM9、ZmZIM20、ZmZIM25及ZmZIM26）。

上述32個ZmZIM蛋白由134～467個氨基酸殘基構成，相對分子質量為14 161.23～52 501.39，理論等電點（PI）為4.60～1018，其中等電點大于70的蛋白質有23個，表明大多數ZmZIM蛋白偏堿性，32個ZmZIM蛋白均為親水性蛋白（表1）。亞細胞定位預測結果顯示，32個蛋白質均定位在細胞核中。

2.2玉米ZmZIM家族基因結構分析及編碼的蛋白質結構域預測

32個ZmZIM基因中ZmZIM13、ZmZIM17和ZmZIM27沒有非編碼區（UTR），其余29個ZmZIM基因均含1～2個UTR及多個編碼序列（CDS）。ZmZIM14、ZmZIM19、ZmZIM25、ZmZIM26、ZmZIM28、ZmZIM20和ZmZIM9含有不少于7個CDS（圖3），這些基因形成剪切體的潛在能力較高。ZIM31和ZIM5具有較為相似的結構，表明這2個基因的進化過程可能較為相似。

32個ZmZIM基因編碼的蛋白質均含有多個保守基序（Motif）（圖4）。其中，Motif1、Motif3、Motif4出現次數較多，表明ZmZIM家族基因可能具有較為相似的功能，一些基因編碼的蛋白質獨有特定的Motif說明這些基因可能有特殊的功能。基因編碼的蛋白質保守基序的多樣性與基因編碼的蛋白質的保守結構域多樣化基本一致。

2.3玉米ZIM家族基因啟動子順式作用元件

32個ZmZIM基因啟動子區域包含的順式作用元件主要有6大類：調控元件、光信號響應元件、激素信號響應元件、脅迫響應元件、生長發育元件及蛋白質結合位點等（圖5）。其中，光信號響應元件和激素信號響應元件數量最多，分別出現453次及341次，且每個ZmZIM中均有1個以上的光信號響應元件。這表明ZmZIM家族可能調控多種信號通路，從而對玉米生長發育及多種脅迫作出應答。同時，ZmZIM家族可能受光信號通路的影響從而存在表達的周期性。脅迫響應元件出現141次。上述結果說明ZmZIM家族可能在調控玉米脅迫應答、激素調節和光信號響應中發揮重要作用。

2.4玉米ZIM蛋白系統發育樹分析

玉米ZmZIM家族蛋白質系統發育樹顯示32個ZmZIM蛋白可以劃分為S1、S2、S3、S4 4個亞類。其中，S4亞類包含19個基因的編碼蛋白質，S1亞類包含3個基因的編碼蛋白（ZmZIM14、ZmZIM19、ZmZIM28），S2和S3亞類各含有5個基因的編碼蛋白質，分別是ZmZIM9、ZmZIM12、ZmZIM20、ZmZIM25、ZmZIM26和ZmZIM11、ZmZIM18、ZmZIM21、ZmZIM30、ZmZIM32（圖6）。

2.5玉米ZIM家族基因表達模式分析

不同生長發育時期，玉米自交系B73不同組織ZmZIM基因的表達模式如圖7所示。從圖中可以看出，32個ZmZIM基因的表達差異顯著。15個基因（ZmZIM1、ZmZIM2、ZmZIM4、ZmZIM9、ZmZIM10、ZmZIM12、ZmZIM13、ZmZIM14、ZmZIM17、ZmZIM18、ZmZIM22、ZmZIM23、ZmZIM26、ZmZIM27、ZmZIM32）在玉米生長過程中多個組織中幾乎不表達或低表達，ZmZIM21、ZmZIM25和ZmZIM30在玉米生長過程中相對表達量基本穩定，其余14個基因在玉米生長過程中相對表達量存在較大差異。在第9葉片展開期第8葉中ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM24、ZmZIM28和ZmZIM29等基因的相對表達量較高，在第14葉片展開期第13葉中ZmZIM7、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM29、ZmZIM30和ZmZIM31等基因的相對表達量較高。

2.6玉米ZIM家族基因對氮素的響應

充足氮和低氮處理后，玉米自交系B73地上部ZmZIM基因表達量的變化分別如圖8和圖9所示。從圖中可以看出，2種氮素水平下，隨著氮素處理時間的增加，32個ZmZIM基因的相對表達量出現不同的變化特征：12個ZmZIM基因（ZmZIM4、ZmZIM6、ZmZIM10、ZmZIM12、ZmZIM13、ZmZIM17、ZmZIM18、ZmZIM21、ZmZIM22、ZmZIM27、ZmZIM30和ZmZIM32）在2種氮素水平下均不表達或表達量極低；ZmZIM9、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM20、ZmZIM25和ZmZIM26 6個ZmZIM基因相對表達量較高，且變化比較穩定，其余14個ZmZIM基因的相對表達量差異較大。與處理初始相比，充足氮處理8 h后ZmZIM1、ZmZIM3、ZmZIM8、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對表達量提高了4倍以上。2種氮素水平下，ZmZIM5、ZmZIM16和ZmZIM31基因的相對表達量普遍高于其他基因。充足氮處理下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31基因的相對表達量普遍高于低氮處理，這表明該家族基因對氮素變化的響應較為明顯。因此，可以認為玉米ZmZIM基因在氮素響應調控中確實發揮了重要功能。

3討論

轉錄因子參與生物體眾多生理生化過程的調控，從基因組及轉錄組水平入手解析轉錄因子家族結構和功能有助于明確轉錄因子基因家族的特性[37-39]。ZIM蛋白是植物特有的一類轉錄因子，在植物應對非生物脅迫、光響應、激素信號傳導等方面起著重要的作用。本研究通過挖掘ZmZIM家族基因的染色體位置、結構、順式作用元件、表達模式及其對氮素的響應特征，初步明確了ZmZIM基因的功能及對氮素的響應機制。

本研究基于最新版本玉米基因組信息鑒定出玉米全基因組中含有32個ZmZIM基因，對前人研究結果進行了補充與完善[40]。玉米ZmZIM基因在染色體上的分布較為分散，在1號染色體及5號染色體有成簇密集分布的現象，這可能與基因的重復、互補功能相關。根據ZmZIM家族成員結構相似程度及系統進化關系將32個玉米ZmZIM基因分為4個亞類。本研究中對該家族成員的分類標準和范疇與其他學者研究有所不同。其他學者[5]側重TIFY家族的分類 ，而本研究則是重點關注蛋白質中是否存在TIFY結構域、CCT結構域及GATA鋅指結構域而進行分類。盡管本研究中ZmZIM4蛋白僅含TIFY結構域，但多次驗證后本研究認為該蛋白質仍屬于ZIM家族，這為ZIM家族的進化分析提供了基礎。

Shikata等[3]研究結果表明長日照條件下（16 h光照/8 h黑暗）過表達AtZIM可使擬南芥細胞增大進而導致擬南芥下胚軸及葉柄伸長，短日照條件下（8 h光照/16 h黑暗）過表達AtZIM則使擬南芥葉片變小，這說明光周期能影響到該家族基因的表達，進而調控植株形態。本研究中ZmZIM基因啟動子區域順式作用元件預測結果顯示，ZmZIM基因中光信號響應元件數量最多，每個ZmZIM基因至少含有1個脅迫響應元件及激素相應元件，這表明該家族在響應外源激素及非生物脅迫的過程中發揮重要功能。此外，ZmZIM家族基因在玉米葉片中表達量普遍較高，且在不同生長發育期表達量有顯著差異，推測ZmZIM基因可能與其他基因互作來調控玉米葉片的發育。

在充足氮及低氮環境下，隨著氮素處理時間的增加，12個ZmZIM基因不表達或表達量極低，ZmZIM9、ZmZIM11、ZmZIM19、ZmZIM20、ZmZIM25和ZmZIM26等6個ZmZIM基因相對表達量較高，且變化比較穩定，其余14個ZmZIM基因的相對表達量差異較大；ZmZIM5、ZmZIM16、和ZmZIM31等3個基因的相對表達量普遍高于其他基因。充足氮條件下，ZmZIM8、ZmZIM15、ZmZIM20、ZmZIM24、ZmZIM29和ZmZIM31等基因的相對表達量普遍高于低氮條件下相對表達量。上述結果說明ZmZIM基因可積極響應氮素條件的變化，一些成員在低氮條件下高表達以增強玉米對外界氮素的吸收、同化及轉運用來維持植株自身的生長，而另一部分成員在充足氮素條件下高表達一方面促進氮素的同化及轉運，另一方面通過其生長發育響應元件與其他基因互作來調控玉米的生長發育來維持玉米植株碳氮平衡。因此，可以認為玉米ZmZIM家族基因在氮代謝過程中可能發揮重要作用，在未來的研究中可通過ZmZIM基因的過表達試驗、敲除突變體試驗及共表達網絡分析，從表型及遺傳角度進一步驗證和解析ZmZIM基因的功能，明確ZmZIM基因在玉米氮代謝中的作用。

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（責任編輯：石春林）

收稿日期：2023-05-09

基金項目：國家自然科學基金項目（32272133）；江蘇省種業振興“揭榜掛帥”項目[JBGS（2021）012]

作者簡介：孫揚名（1998-），男，吉林長春人，博士研究生，主要從事玉米氮素吸收及高效利用研究。（Tel）18151665609;（E-mail）Sunyangming9808@163.com

通訊作者：趙涵，（E-mail）zhaohan@jaas.ac.cn