高粱CIPK家族基因的全基因組鑒定及非生物脅迫下的表達特征

徐鵬 李春宏 范昕琦 梁篤 沈新蓮

摘要：鈣調磷酸酶B樣蛋白互作蛋白激酶（CIPK）是一種重要的Ca2+信號傳感器，在植物應答逆境非生物脅迫過程中發揮著重要作用。為了探究高粱中CIPK家族基因的功能，本研究從高粱基因組中鑒定了31個SbCIPK基因，這些基因不均勻地分布在高粱的9條染色體上，編碼蛋白質的氨基酸數量為403～519個，等電點為6.07～938，相對分子質量為46 357.31～58 316.97。基因結構分析結果表明，SbCIPK家族基因分為內含子缺失型和內含子富集型2類。進化樹分析結果表明，SbCIPK家族蛋白質成員分為8個亞族。基于轉錄組數據的表達模式分析結果表明，SbCIPK基因廣泛參與對鹽脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫的響應。本研究結果可以為高粱CIPK家族基因的功能研究奠定基礎。

關鍵詞：高粱；CIPK基因；全基因組鑒定；非生物脅迫

中圖分類號：S514文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0591-08

Whole genome-wide identification of CIPK family and their expression characteristics under abiotic stress in Sorghum bicolor

XU Peng1，LI Chun-hong1，FAN Xin-qi2，3，LIANG Du2，3，SHEN Xin-lian1

（1.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China;2.College of Agriculture， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801;3.Shanxi Key Laboratory of Sorghum Genetic and Germplasm Innovation， Sorghum Research Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Jinzhong 030600）

Abstract：Calcineurin B-like proteins interacting protein kinase （CIPK） is an important Ca2+ signal sensor， which plays an important role in plants response to abiotic stress. In order to explore the function of CIPK family gene members in Sorghum bicolor a total of 31 SbCIPK genes were identified， which were unevenly distributed on nine chromosomes from Sorghum bicolor in this study. The length of the SbCIPKs encoded proteins ranged from 403 to 519 aa， the isoelectric points ranged from 607 to 938， and the relative molecular weights ranged from 46 357.31 to 58 316.97. The SbCIPK gene family members were divided into intron deletion type and intron enrichment type by gene structure analysis. According to the results of phylogenetic tree analysis， the S. bicolor SbCIPK family protein members were divided into eight subgroups. SbCIPK genes were widely involved in abiotic stress responses to salt and drought and so on based on the published transcriptome data. These results can lay the foundation for the functional study of SbCIPK family members in S. bicolor.

Key words：Sorghum bicolor;CIPK gene;whole genome-wide identification;abiotic stress

植物在生長發育過程中經常遭受各種非生物脅迫，如鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫。在漫長的進化過程中，為了適應生存條件，植物形成了完整的脅迫反應分子機制。植物通過調節信號轉導和內源激素代謝來應對非生物脅迫。Ca2+作為第二信使，在多種非生物脅迫的響應中發揮著重要作用[1]。Ca2+信號傳感器主要包括3種：鈣結合蛋白鈣調蛋白（CaM）和CaM樣蛋白（CMLs）、鈣依賴蛋白激酶（CDPK）、類鈣調磷酸酶B蛋白（CBL）[2]。CBL是植物特有的一種新型EF手型鈣感受器蛋白，其本身并沒有激酶活性，當它識別到鈣信號后，可以與下游的鈣調磷酸酶B樣蛋白互作蛋白激酶（CIPK）相互作用，形成絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶復合體，通過調節植物細胞中離子濃度以緩解逆境脅迫。

CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常具有N端激酶催化結構域和C端調節結構域。C端調節結構域內有21～24個氨基酸組成的保守的NAF結構域。CIPK通過C端的NAF與CBL相互作用，從而產生一個復雜的信號網絡。NAF結構域具有雙重功能，包括自我抑制和與CBL特異性結合以激活CIPK活性[3]。目前，在水稻[4]、小麥[5]以及棉花[6]中分別發現了33個、20個以及79個CIPK基因。已有研究者鑒定出部分CBL-CIPK系統成員在植物應答逆境脅迫中發揮的功能[7-9]。CIPK的結構高度保守，同一物種CIPK成員之間存在部分功能冗余，不同物種間也存在功能高度相似的CIPK，它們可能介導相同的應激反應。為了進一步揭示CIPK介導的復雜網絡系統，利用基因工程技術改良作物在非生物脅迫下的抗性，我們還需要對CIPK基因的功能進行詳細研究。

高粱（Sorghum bicolor）是世界第五大禾谷類作物，也是中國主要的雜糧作物之一，具有耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿等多重抗性。隨著高粱基因組序列的公布，高粱基因家族鑒定的研究工作廣泛開展，但目前尚未見有關高粱CIPK基因家族全基因組鑒定的報道。本研究擬基于公布的高粱基因組序列，在基因組水平上鑒定高粱CIPK家族成員，并對其進行生物信息學分析以及表達特征分析，以期為進一步探究高粱CIPK家族基因功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1高粱CIPK基因家族成員的鑒定

從擬南芥TAIR數據庫（http：//www.arabidopsis.org）中獲取26個CIPK蛋白的氨基酸序列，并利用本地BLASTP同源比對高粱基因組數據庫[10]，獲得候選高粱CIPK基因家族成員。在Pfam網站（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載獲得保守結構域NAF的種子文件（PF03822），利用本地HMMER軟件對候選高粱CIPK成員的NAF功能結構域進行篩選，獲得同時具有N端激酶催化結構域和C端NAF調節結構域的SbCIPK家族成員。

1.2高粱CIPK基因家族成員染色體分布及其編碼蛋白質的理化性質分析

利用ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/protparam）分析高粱CIPK家族成員的氨基酸數量、等電點以及相對分子質量等理化性質；根據高粱CIPK家族基因的基因組位置信息提取基因全長序列，利用Mapinspect軟件繪制染色體分布圖。

1.3高粱CIPK基因家族系統進化與基因結構分析

利用MEGA 6.0軟件構建高粱和擬南芥的CIPK蛋白系統進化樹；利用GSDS軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析SbCIPK家族基因結構；利用MEME軟件（http：//meme-suite.org/tools/meme）對SbCIPK蛋白進行保守基序（Motif）分析。

1.4非生物脅迫下高粱CIPK家族基因的表達特征分析

分析高粱SbCIPK家族基因在非生物脅迫下的表達特征。在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載高粱表達序列標簽（EST）數據，提取鹽脅迫、干旱脅迫、水分脅迫以及低溫脅迫等非生物脅迫誘導表達的EST序列共30 771條。分析非生物脅迫下，在耐非生物脅迫材料與對非生物脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因。在NCBI網站下載已發表的高粱非生物脅迫下的轉錄組數據，將Clean data與高粱參考基因組數據庫[10]進行比對，以每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（FPKM）量化基因的表達量，采用DESeq軟件以偽發現率（FDR）≤0001且差異倍數在2倍以上作為標準篩選差異表達的SbCIPK基因。

2結果與分析

2.1高粱CIPK家族基因的鑒定、染色體定位及其編碼蛋白質的理化性質

基于同源比對獲得31個高粱CIPK基因家族成員，命名為SbCIPK1～SbCIPK31。31個SbCIPK基因不均勻地分布在高粱9條染色體上，其中染色體3上分布的最多，有7個SbCIPK基因；其次是染色體2和染色體9，各有6個SbCIPK基因；染色體1和染色體8上均有3個SbCIPK基因；染色體5和染色體10上均有2個SbCIPK基因；染色體4和染色體7上均只有1個SbCIPK基因；而染色體6上沒有SbCIPK基因（圖1）。

蛋白質理化性質分析結果（表1）表明，SbCIPK家族的氨基酸數量差異不大，氨基酸數量最多的為519個，最少的為403個；相對分子質量為46 357.31～58 316.97，雖然SbCIPK15含有的氨基酸數量最多，但相對分子質量并非最大，相對分子質量最大的是SbCIPK16，含有516個氨基酸。SbCIPK21含有的氨基酸數量最少，相對分子質量也最小。SbCIPK家族蛋白質理論等電點為6.07～938，大部分為堿性蛋白質，僅SbCIPK12、SbCIPK13和SbCIPK24為酸性蛋白質。

2.2高粱CIPK家族的進化樹分析

對31個高粱CIPK家族成員和26個擬南芥CIPK家族成員構建進化樹，分析高粱CIPK家族系統進化關系。圖2顯示，將高粱CIPK家族成員分為8個亞族，其中A亞族中SbCIPK成員最多，有10個SbCIPK成員（SbCIPK1、SbCIPK8、SbCIPK10、SbCIPK16、SbCIPK17、SbCIPK18、SbCIPK22、SbCIPK25、SbCIPK26、SbCIPK28）；B亞族中有4個SbCIPK成員（SbCIPK11、SbCIPK15、SbCIPK29、SbCIPK30）；C亞族中有3個SbCIPK成員（SbCIPK7、SbCIPK12、SbCIPK24）；D亞族有8個SbCIPK成員（SbCIPK2、SbCIPK3、SbCIPK4、SbCIPK9、SbCIPK13、SbCIPK19、SbCIPK21、SbCIPK31）；E亞族和G亞族中均僅有1個SbCIPK成員，分別為SbCIPK5和SbCIPK14；F亞族和H亞族中各有2個SbCIPK成員，分別為SbCIPK6、SbCIPK20和SbCIPK23、SbCIPK27。在系統進化上高粱和擬南芥CIPK具有較高的同源復制系數，推測它們的同源基因執行相似的功能。

2.3高粱CIPK家族基因結構分析

圖3顯示，有11個SbCIPK基因包含內含子，分別為SbCIPK2、SbCIPK3、SbCIPK4、SbCIPK7、SbCIPK9、SbCIPK12、SbCIPK13、SbCIPK19、SbCIPK21、SbCIPK24、SbCIPK31。另外20個SbCIPK基因沒有內含子，其中SbCIPK23只有外顯子。結合進化樹分析結果，發現11個包含內含子的SbCIPK基因均聚類在C亞族和D亞族；A、E、F、G亞族中所有基因都有上下游非編碼區；B亞族中SbCIPK11和SbCIPK15沒有下游非編碼區，其余基因均含有上下游非編碼區；H亞族中的2個基因SbCIPK23和SbCIPK27均沒有上游非編碼區。因此，推測C亞族、D亞族與其他亞族相比在功能上存在較大差異。

2.4高粱CIPK家族蛋白質保守基序分析

利用MEME軟件分析高粱CIPK家族中10個保守基序，31個SbCIPK家族成員的基序分析結果（圖4）表明，每個亞族的成員具有相同或類似的基序類型和排列順序。A亞族中10個SbCIPK家族成員具有全部10個保守基序且排列順序完全一致；B亞族中的4個SbCIPK成員均缺少基序9，除了SbCIPK11外，其他3個成員還缺少基序8；C亞族中的3個SbCIPK成員均缺少基序9；D亞族中SbCIPK2、SbCIPK3、SbCIPK9和SbCIPK19具有全部10個保守基序，SbCIPK13和SbCIPK31缺少基序9，SbCIPK4缺少基序2，SbCIPK21缺少基序2和基序4；E亞族中的SbCIPK5缺少基序8；F亞族中SbCIPK20包含全部的基序，而SbCIPK6缺少基序6；G亞族中的SbCIPK14缺少基序8；H亞族中SbCIPK23缺少基序6和基序7，而SbCIPK27僅含有5個基序，缺少的基序較多。

2.5高粱CIPK家族基因在非生物脅迫下的表達特征

本研究分析了高粱CIPK家族基因在非生物脅迫下的誘導表達情況。以31個高粱CIPK家族基因作為查詢序列，以獲得的30 771條EST序列作為參考序列進行本地BLASTN比對。結果（表2）表明，受水分脅迫誘導表達的基因有7個，分別為SbCIPK6、SbCIPK18、SbCIPK19、SbCIPK20、SbCIPK21、SbCIPK22和SbCIPK24；受鹽脅迫誘導表達的基因有6個，分別為SbCIPK2、SbCIPK7、SbCIPK9、SbCIPK18、SbCIPK21和SbCIPK22；受干旱脅迫誘導表達的基因有3個，分別為SbCIPK4、SbCIPK18和SbCIPK22；受低氮脅迫誘導表達的基因有1個，為SbCIPK23。總共有12個SbCIPK基因受至少一種非生物脅迫誘導表達，SbCIPK18和SbCIPK22同時受干旱脅迫、鹽脅迫以及水分脅迫誘導表達；SbCIPK21同時受鹽脅迫和水分脅迫誘導表達。

我們同樣分析了在耐非生物脅迫材料與對非生物脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因。在水分脅迫誘導下，在耐水分脅迫材料與對水分脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因有2個，分別為SbCIPK7和SbCIPK12；在鹽脅迫誘導下，在耐鹽脅迫材料與對鹽脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因有4個，分別為SbCIPK4、SbCIPK6、SbCIPK18和SbCIPK22；在干旱脅迫下，在耐干旱脅迫材料與對干旱脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因有4個，分別為SbCIPK4、SbCIPK5、SbCIPK22和SbCIPK29；在低溫脅迫下，在耐低溫脅迫材料與對低溫脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因有1個，為SbCIPK10；在低氮脅迫下，在耐低氮脅迫材料與對低氮脅迫敏感材料之間差異表達的SbCIPK基因有1個，為SbCIPK30。總共有10個SbCIPK基因在至少一種非生物脅迫下表現為在耐非生物脅迫材料與對非生物脅迫敏感材料之間差異表達。在鹽脅迫和干旱脅迫下，SbCIPK4和SbCIPK22在耐鹽/耐干旱脅迫材料與對鹽/干旱脅迫敏感材料之間差異表達。

3討論

CIPK蛋白在植物界廣泛存在，對于植物通過介導Ca2+信號響應各種生理和發育過程至關重要[11]。CIPK蛋白最早是在模式植物擬南芥中被發現的，在植物應對逆境脅迫中發揮著重要的作用。在本研究中，我們從高粱基因組中鑒定出31個SbCIPK基因家族成員。不同物種中CIPK數量的差異較大，如擬南芥中有26個CIPK，水稻中有33個CIPK[4]，小麥中有20個CIPK[5]，棉花中有79個CIPK[6]，菠蘿中21個CIPK[12]，蘿卜中有51個CIPK[13]，茄子中有15個CIPK[14]，苜蓿中有135個CIPK[15]。基因可以通過多種機制復制，包括多倍化等全基因組復制。大量連續的全基因組復制產生了重復的基因，隨后大量重復的基因在非功能化過程中趨于丟失。推測在進化過程中CIPK家族基因的復制和丟失是導致植物CIPK基因數量不等的主要原因[16]。

作為鈣傳感器CBL的靶向激酶，CIPK在N端含有激酶催化結構域，在C端含有NAF基序。CIPK的磷酸化是調節這些靶向互作的重要模式[17]。在本研究中，所有SbCIPK都具有相似的N端和C端的調控結構域，磷酸化仍然是大多數CIPK發揮作用的主要途徑[18]。NAF是CIPK C端自身抑制結構域中的一個保守區，是CIPK家族的保守特征之一，是CBL的結合位點[19]。高粱CIPK基因結構與其他植物中的一些CIPK基因相似。31個SbCIPK的外顯子數量從1個或2個到多個不等，不同的外顯子/內含子數量造成了不同的基因長度。這些研究結果表明，具有不同長度外顯子的SbCIPK可能發揮多種作用。此外，除了C亞族和D亞族外，A、B、E、F、G、H亞族中的SbCIPK基因是無內含子的分支。因此，推測SbCIPK的聚類可能是由高粱內含子保留和選擇性剪接機制的進化造成的。

CIPK廣泛存在于植物中，在植物應答非生物脅迫的響應中起著重要作用。Ca2+信號由非生物應激觸發，并與1種或多種新型CBL激酶有特定的相互作用。CBL/CIPK復合物可能參與多種CBL-CIPK信號通路，在植物生長和非生物脅迫耐受調控中發揮重要作用。近年來，關于擬南芥、水稻以及小麥等多種植物的研究結果表明，CIPK基因在調節植物的非生物脅迫耐受性方面至關重要。在擬南芥中，AtCBL4和AtCIPK24在質膜上結合，并激活質膜Na+/H+反轉運體AtNHX7，從而維持耐鹽離子的穩態[7]。AtCBL10-AtCIPK24主要通過靶向液泡定位的K+（Na）+/H+反轉運蛋白AtNHX1從細胞質中排除過量Na+進入液泡，以維持細胞質中Na+的穩定[8]。擬南芥CBL1/9-CIPK23復合物通過磷酸化硝酸鹽轉運蛋白1/肽轉運蛋白家族6.3調控硝酸根離子的攝取[20]。水稻中，CBL1-CIPK23的互作激活了K+轉運蛋白AKT1，增強低K+脅迫下水稻植株對K+的吸收[9]。OsCIPK23的過表達誘導了水稻抗旱相關基因的表達[21]。過表達TaCIPK23的小麥在干旱條件下存活率更高，發芽率提高，根系發育更旺盛，滲透物質積累增加，失水率降低[22]。過表達TaCIPK25的小麥表現為對Na+超敏感和Na+的過量積累，根系細胞的Na+/H+跨膜交換受到影響，表明TaCIPK25對小麥的鹽脅迫具有負向調控作用[23]。在本研究中，我們分析了高粱CIPK家族基因在多種非生物脅迫下的表達特征，其中多個SbCIPK基因受非生物脅迫誘導表達。基因表達模式的分析結果可以為基因功能的確定提供重要線索，本研究結果為進一步探究高粱SbCIPK家族基因功能奠定了基礎。

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（責任編輯：王妮）

收稿日期：2023-02-21

基金項目：亞夫科技服務項目[KF（21）3001]；山西省基礎研究計劃項目（202103021223130）；山西種業創新良種聯合攻關項目（2022N2GL-06）；山西省農業科學院雜糧分子育種平臺專項（YGC2019FZ5）；山西省科技合作交流專項（202204041101032）

作者簡介：徐鵬（1981-），男，江蘇揚中人，博士，副研究員，主要從事作物分子育種研究。（E-mail）xupengjaas@126.com

通訊作者：沈新蓮，（E-mail）xlshen68@126.com