內質網應激蛋白激酶RNA樣ER激酶（PERK）通路對肝星狀細胞激活及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響

黎鳳炎 劉澤峰 夏雨艷 王文娟 李琪 唐利瑕 張國

摘要： 目的 探討內質網應激蛋白激酶RNA樣ER激酶 （PERK） /真核生物翻譯起始因子2α （eIF2α） 信號通路對肝星狀細胞（HSC） 活化的影響。方法 收集11例肝穿刺病理提示S1～S4肝纖維化患者和9例肝血管瘤、 肝腺瘤患者術后周圍正常肝組織病理切片， 進一步行組織免疫組化檢測PERK、 eIF2α、 C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白 （CHOP） 表達情況； 使用不同濃度的內質網應激誘導劑毒胡蘿卜素 （0、 125、 250、 500、 1 000 nmol/L） 作用于人HSC-LX2， 使用qRT-PCR檢測PERK mRNA及Western Blot檢測PERK、 肌醇需要酶1（IRE1）、 激活轉錄因子6（ATF6）、 CHOP及α平滑肌肌動蛋白（α-SMA） 表達水平。使用慢病毒轉染構建PERK穩定過表達LX-2組及對照組， 并通過qRT-PCR檢測PERK、 eIF2α、 α-SMA mRNA， Western Blot檢測PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達， 免疫熒光檢測膠Ⅰ型原蛋白 （COL1A1） 表達。符合正態分布的計量資料兩組間比較采用成組t檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析， 進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗； 不符合正態分布的計數資料， 兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。結果 與正常肝組織相比， 肝纖維化患者肝組織中PERK、 eIF2α及CHOP表達升高， 差異均有統計學意義 （Z=?3. 56、 t=?5. 75、 Z=?3. 52， P值均<0. 001）。不同濃度毒胡蘿卜素作用后， 與溶媒組相比， 內質網相關蛋白PERK、 CHOP、 IRE1、 ATF6及α-SMA蛋白表達顯著升高 （P值均<0. 05）。與對照空載慢病毒組相比， PERK穩定過表達組PERK mRNA、 eIF2α mRNA、 α-SMA mRNA表達及PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達明顯升高 （P值均<0. 05）。細胞免疫熒光結果提示， PERK過表達組COL1A1表達升高 （P<0. 05）。結論 PERK過表達可誘導LX-2細胞α-SMA、 膠原蛋白COL1A1表達， 提示PERK信號通路可能是HSC活化的重要機制之一。

關鍵詞： ?內質網應激； ?真核細胞起始因子2； ?肝星狀細胞； ?膠原Ⅰ型

基金項目： ?廣西自然科學基金 （2023GXNSFBA026056）； ?廣西壯族自治區人民醫院青年基金 （QN2020-1）

Effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase pathway in endoplasmic reticulum stress on?hepatic stellate cell activation and collagen type I expression

LI Fengyan ， LIU Zefeng ， XIA Yuyan ， WANG Wenjuan ， LI Qi ， TANG Lixia ， ZHANG Guo .

（1. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Bose， Guangxi 533000， China； 2. Department of Gastroenterology， The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 3. Department of Gastroenterology， Guangxi Hospital Division of The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Nanning 530022， China）

Corresponding author： ?ZHANG Guo， ?zhangguogx@hotmail.com ?（ORCID： ?0000-0001-7755-443X）

Abstract： Objective To investigate the effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase （PERK） /eukaryotic initiation factor 2α （eIF2α） pathway in endoplasmic reticulum stress on the activation of hepatic stellate cells （HSC） . Methods Pathological sections of normal liver tissue after surgery were collected from 11 patients with hepatic fibrosis （S1-S4） and 9 patients with hepatic hemangioma and hepatic adenoma confirmed by liver biopsy， and immunohistochemistry was used to measure the protein expression levels of PERK， eIF2α， and C/EBP homologous protein （CHOP） . Human HSC-LX2 cells were treated with different concentrations of the endoplasmic reticulum stress inducer thapsigargin （0， 125， 250， 500， and 1 000 nmol/L）， and qRT-PCR was used to measure the mRNA expression level of PERK， while Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK， inositol requiring protein 1 （IRE1）， activating transcription factor 6 （ATF6）， CHOP， and α-smooth muscle actin （α-SMA） . The method of lentivirus transfection was used to construct a PERK stable overexpression LX-2 group and a control group； qRT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of PERK， eIF2α， and α -SMA， Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK， phosphorylated eIF2α （p-eIF2α）， and α-SMA， and immunofluorescence assay was used to measure the expression of collagen type I alpha 1 （COL1A1） . The independent samples t-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups； a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. The Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups. Results Compared with normal liver tissue， the liver tissue of patients with hepatic fibrosis had significantly higher expression levels of PERK， eIF2α， and CHOP （Z=?3.56，t=?5.75， Z=?3.52， all P<0.001） . Compared with the solvent group， the groups treated with different concentrations of thapsigargin had significant increases in the expression levels of the endoplasmic reticulum-associated proteins PERK， CHOP， IRE1， ATF6， and α-SMA （all P<0.05） . Compared with the control group， the PERK stable overexpression group had significant increases in the mRNA expression levels of PERK， eIF2α， and α-SMA and the protein expression levels of PERK， p-eIF2α， and α-SMA （all P<0.05）， and immunofluorescence assay showed a significant increase in the expression level of COL1A1 in the PERK stable overexpression group （P<0.05） . Conclusion PERK overexpression can induce the expression of α-SMA and COL1A1 in LX-2 cells， suggesting that the PERK signaling pathway might be one of the important mechanisms of HSC activation.

Key words： Endoplasmic Reticulum Stress； Eukaryotic Initiation Factor-2； Hepatic Stellate Cells； Collagen Type I

Research funding： Guangxi Natural Science Foundation Project （2023GXNSFBA026056）； The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region Youth Fund project （QN2020-1）

肝纖維化是許多慢性肝病的共同表現， 各種不良因素持續刺激造成肝臟結構和功能改變， 病變持續發展將最終引起肝硬化、 肝癌等嚴重并發癥［1］ 。全球健康負擔數據［2］ 顯示， 肝硬化和其他慢性肝病仍是全球發病率和病死率的主要原因。因此， 深入研究肝纖維化的發病機制對疾病早期干預和阻斷肝纖維化進程意義重大。內質網應激是內質網蛋白質折疊能力失衡， 引起非折疊蛋白在內質網腔聚集的現象。當內質網正常功能受損時將引起內質網應激， 并通過3種不同跨膜蛋白， 即蛋白激酶RNA樣ER激酶 （protein kinase RNA-like endoplasmicreticulum kinase， PERK）， 肌醇需要蛋白1 （inositol requiringprotein1， IRE1）及激活轉錄因子 6（activating transcriptionfactor 6， ATF6）， 啟動非折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR） ［3］。近年研究［4］發現， 內質網應激參與肝纖維化發生發展及逆轉過程， 可引起肝細胞凋亡、 促進肝星狀細胞 （HSC） 活化引起肝纖維化發生發展； 另一方面內質網應激可導致HSC凋亡， 利于肝纖維化逆轉。因此， 本研究聚焦于PERK信號通路對肝纖維化影響， 通過構建內質網應激HSC-LX2細胞模型， 探討內質網應激對HSC激活及Ⅰ型膠原蛋白 （collagens type Ⅰ，COL1A1） 表達的影響； 同時通過過表達PERK蛋白， 探索內質網應激PERK信號通路在HSC活化及COL1A1表達中的作用。

1 材料與方法

1. 1 實驗細胞及主要試劑 HSC-LX2細胞由紐約西奈山醫學院Friedman教授贈送。主要試劑： 毒胡蘿卜素（Thapsigargin， Tg， Sigma公司）； 攜帶PERK的Tet-on過表達慢病毒和對照慢病毒 （上海吉凱生物科技有限公司）；免疫組化通用二步法試劑盒 （中杉金橋）； RNA快速提取試劑盒 （上海奕杉生物）； 熒光定量PCR試劑盒、 cDNA逆轉錄體系試劑盒 （TaKara生物公司）； 一抗： α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（CST 19245S）、 PERK（CST 3192S）、 IRE1（CST 3294S）、 磷酸化真核生物翻譯起始因子2α （phospho eukaryotic initiation factor 2α， p-eIF2α）、 C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP）（CST 2895S）、ATF6（CST 65880S）；COL1A1 （武漢三鷹 67288-1-lg）、 β-actin （武漢三鷹 10077-1-AP）、 α-Tublin （武漢三鷹 66031-1-lg）、 ATF-4 （武漢三鷹 10835-1-AP）； Alexa Fluor 555 （Cell Signaling公司）； 山羊抗鼠、 山羊抗兔二抗及增強化學發光試劑盒 （Affinity公司）； 聚偏二氟乙烯膜 （Millipore公司）； 高糖DMEM培養基 （Gibco）， 澳洲胎牛血清 （Gibco）， 4%組織細胞固定液、TritonX-100、 青鏈霉素 （penicillin-streptomycin， PS， Solarbio）qRT-PCR所用引物均由武漢金開瑞公司設計合成。

1. 2 方法

1. 2. 1 患者分組及組織取樣 收集廣西壯族自治區人民醫院既往診斷為慢性病毒性肝炎且病理診斷為肝纖維化的患者， 排除HIV或酗酒、 由于其他原因引起的肝損傷及合并肝癌患者。根據慢性肝炎分級分期標準對患者肝纖維化程度進行分級分期。本研究共收集11例慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者的病理切片， 其中G2S1患者3例， G3S3患者4例， G3S4患者2例， G4S4 2例。此外， 收集了9例行手術切除肝血管瘤或肝腺瘤周圍的正常肝組織病理切片。

1. 2. 2 免疫組化 將肝組織經過福爾馬林固定、 乙醇脫水、 石蠟包埋、 切片、 烘烤 （68 ℃ 120 min）、 二甲苯脫蠟、 100%～70%梯度乙醇水化、 抗原修復 （檸檬酸鹽高壓修復4 min）、 封閉、 孵育一抗 （4 ℃過夜）、 孵育二抗、 DAB染色5 min、 蘇木素復染5 min、 乙醇脫水后使用中性樹脂膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照， 結果由2位研究者在未知切片信息的情況下進行， 每張切片隨機選取5個高倍視野 （×200）， 排除非特異性染色后進行評分； 結合細胞著色比例及染色顏色強度進行評分： 細胞著色比例<5%為0分； 5%～25%為1分； 26%～50%為2分； 51%～75%為3分； 76%～100%為4分。陽性強度按照如下方式進行打分： 無色記為0分， 淺黃色記1分， 棕黃色記2分， 棕褐色記3分； 將上述2個評分乘積作為該視野得分； 計算2位研究者評出每個視野的平均分， 若評分接近取平均值為最終得分， 若評分相差較遠， 則請第3位研究者進行評分， 再計算平均值。最終獲得3分以上者判斷為陽性表達。

1. 2. 3 HSC-LX2細胞的分組及干預 細胞常規復蘇后， 用含10%胎牛血清+1%PS的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2的培養箱中進行細胞培養。將對數生長期的LX2細胞分5組接種在6孔培養板； 待細胞貼壁生長后， 按溶媒對照組， Tg 125 nmol/L、 Tg 250 nmol/L、 Tg 500 nmol/L、Tg 1 000 nmol/L組加入藥物干預24 h。

1. 2. 4 慢病毒構建及轉染 將生長良好的LX2細胞培養于6孔板， 接種密度為3×105/孔， 當細胞生長至匯合度30%～40%時感染慢病毒， 同時將培養基更換為不含血清和雙抗的DMEM高糖培養基， 培養8～16 h后， 更換成完全培養基， 同時設置對照空載慢病毒 （NC） 組。48 h后加入嘌呤霉素進行篩選， 獲得穩定株后， 根據Tet-on載體要求， 加入多西環素 （終濃度為0. 6 ?g/mL） 誘導48 h。隨后提取總蛋白及RNA行qRT-PCR及蛋白免疫印跡法 （Western Blot） 驗證。

1. 2. 5 Western Blot實驗 細胞鋪板干預24 h結束后，應用高效RIPA裂解液提取總蛋白， 用BCA法測定蛋白濃度， 經SDS-PAGE電泳分離蛋白質， 經轉膜后將分離后的條帶轉至聚偏二氟乙烯膜上， 用快速封閉液 （碧云天公司） 室溫下封閉15 min， TBST洗膜3次， 每次5 min，4 ℃下孵育一抗過夜。TBST洗膜3次， 每次10 min， 37 ℃孵育二抗1 h， TBST洗膜3次， 每次10 min， 應用雙色紅外激光成像系統掃描， 以β-actin或α-Tublin為內參計算目標蛋白相對表達量。

1. 2. 6 細胞免疫熒光 將生長良好的PERK過表達及空載病毒組細胞接種于裝有蓋玻片的6孔板內， 完全貼壁后， 用4%組織細胞固定液固定15 min后PBS洗3次，0. 5% TritonX-100通透30 min， PBS洗3次， 10%山羊血清封閉30 min， 4 ℃下孵育一抗過夜。PBST洗3次， 熒光二抗避光37 ℃孵育1 h， PBST洗3次， 加入DAPI復染， PBST洗2次， 熒光猝滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1. 2. 7 qRT-PCR 細胞鋪板干預24 h后， 按RNA快速提取試劑盒說明書提取細胞總RNA， 按逆轉錄試劑盒說明書步驟將RNA轉錄成cDNA， 然后以cDNA為模板進行 qRT-PCR， 反應體系 TB Green ? Premix Ex Taq ? Ⅱ 10 ?L， 上下引物各0. 8 ?L， dH2O 6 ?L， cDNA 2 ?L。反應程序： 95 ℃預變性30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s， 擴增40個循環。引物序列見表1。以β-actin為內參， 應用2-△△Ct法計算目標因子的相對表達量。

1. 3 統計學方法 采用SPSS 24. 0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x ˉ±s表示， 兩組間比較采用成組t檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗； 不符合正態分布的計量資料以 M（P25～P75）表示， 兩組間比較采用 MannWhitney U秩和檢驗。P<0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 肝組織中內質網應激PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白的表達 肝纖維化患者肝組織病理切片中PERK、 eIF2α、CHOP細胞著色比例及染色強度得分均大于非肝纖維化患者 （P值均<0. 001）。與非肝纖維化肝組織相比， 肝纖維化患者肝組織樣本中內質網應激PERK通路相關蛋白PERK、 eIF2α及CHOP在纖維化擴大的匯管區HSC細胞漿表達異常升高， 差異有統計學意義 （P<0. 001）（表2， 圖1）， 提示內質網應激可能參與肝纖維化過程。

2. 2 Tg誘導內質網應激作用下HSC-LX2中內質網相關蛋白表達情況 不同濃度Tg在不同時間點干預后， LX-2細胞形態變化不明顯， 但LX-2細胞生長速度明顯被抑制， 且作用時間越長， Tg濃度越大， 細胞被抑制越明顯 （圖2a）。Tg誘導內質網應激后行qRT-PCR檢測， 結果顯示，相較于空白組 （0 nmol/L）， 250、 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導下跨膜蛋白PERK表達升高， 差異均有統計學意義 （P值均<0. 05）（圖2b）。Western Blot結果顯示， 不同濃度Tg誘導下IRE1、 PERK、 CHOP表達均升高， 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導下ATF6表達升高， 差異均有統計學意義 （P值均<0. 05）， 提示Tg誘導LX2細胞內質網應激模型構建成功 （圖2c、 d）。

2. 3 Tg誘導內質網應激下HSC-LX2中α-SMA表達情況qRT-PCR結果顯示， 相較于空白組， 不同濃度的Tg誘導下α-SMA表達水平升高， 差異均有統計學意義 （P值均<0. 01）（圖3a）。Western Blot結果顯示， 不同濃度Tg刺激后LX2細胞α-SMA表達水平升高， 差異有統計學意義 （P<0. 05）（圖3b）， 提示內質網應激參與LX2細胞活化過程。

2. 4 PERK信號通路對HSC-LX2細胞活化的影響 過表達PERK慢病毒轉染LX2細胞后， 光學顯微鏡觀察LX2細胞形態發生微小改變， 無細胞區較對照組增加 （圖4a）； qRT-PCR結果顯示， PERK過表達 （PERK OE） 組中PERK和eIF2αmRNA表達明顯升高 （圖4b、 c）； 進一步行Western Blot實驗結果提示， PERK OE組中PERK及p-eIF2α表達升高 （P<0. 05）（圖4d）， 提示PERK信號通路被激活。細胞免疫熒光結果提示， 與 NC 組相比， 過表達PERK組COL1A1表達升高 （P<0. 05）（圖5a）； qRT-PCR及Western Blot結果提示， PERK信號通路激活后LX2活化指標α-SMA的mRNA和蛋白表達升高（P<0. 05）（圖5b、 c）。提示激活PERK相關通路能促進LX2細胞的活化及增加COL1A1表達。

3 討論

肝纖維化是繼發于各種慢性肝損傷的組織修復反應， 持續的肝纖維化可引起肝細胞功能障礙、 門靜脈高壓等一系列嚴重并發癥［5］ 。肝纖維化的本質主要是肝內細胞外基質 （ECM） 過度沉積， 而ECM主要由活化的HSC產生［6］。當肝損傷或體外培養時， HSC被激活分化為肌成纖維細胞， 肌成纖維細胞的大量增殖使ECM生成增加， 加之其降解失衡， 最終發展為肝纖維化［7］。而ECM相關成分α-SMA、 COL1A1和Ⅲ型膠原蛋白也隨著纖維化程度加深而表達升高［8］。因此， α-SMA 及COL1A1均可作為HSC的活化標志物。

內質網是生物細胞的重要細胞器， 廣泛參與蛋白質合成、 脂質合成轉運及Ca2+平衡的維持等重要生物學過程中。當細胞受到缺氧、 損傷、 炎癥等有害刺激時， 內質網功能紊亂誘導內質網應激發生。內質網應激誘導劑Tg是SERCA （sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase） 泵特異性抑制劑， 可抑制內質網Ca2+-ATP酶， 阻止內質網從細胞質中重吸收Ca2+， 導致內質網中Ca2+的消耗， 從而抑制鈣依賴性分子伴侶， 導致錯誤折疊蛋白質的累加， 繼而導致內質網應激。目前常用UPR判斷內質網應激的發生［9-10］ 。本研究采用Tg誘導LX2細胞建立內質網應激細胞模型， 探討內質網應激與HSC活化之間的潛在關系。結果表明， 從125～1 000 nmol/L不同濃度Tg刺激下均可明顯增加內質網應激相關蛋白PERK/CHOP、 IRE1、 ATF6表達升高， 3條UPR通路激活， 表明Tg誘導內質網應激細胞模型構建成功。LX2細胞活化標志物α-SMA表達升高， 提示內質網應激可能參與LX2細胞的活化過程。

PERK相關通路是UPR的經典途徑， 內質網應激時，PERK被葡萄糖調節蛋白78釋放并激活， 隨后催化eIF2α，使其發生磷酸化， 抑制翻譯的啟動及抑制蛋白合成， 促進CHOP的轉錄和表達［11］ 。研究［12］ 發現， 相較于輕度肝纖維化組織， 嚴重肝纖維化組織中PERK磷酸化水平升高；在小鼠肝纖維化模型中的PERK磷酸化增加與HSC激活標記的表達升高呈正相關［13］ ； 小分子多肽激素鳶尾素可通過抑制原代HSC內PERK/eIF2α/CHOP途徑抑制異質核磷酸化A1的降解緩解肝纖維化 ［14］ 。本研究發現， 相較于非肝纖維化患者， 肝纖維化患者PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白表達升高， 提示PERK通路可能參與肝纖維化發生。為進一步驗證， 本研究采用慢病毒干擾技術構建PERK過表達的LX2細胞株， 結果顯示， 相較于空載病毒組， PERK過表達組PERK、 p-eIF2α表達水平升高， PERK通路被激活， 同時HSC活化標志物α-SMA及COL1A1表達水平升高， 提示PERK介導的信號通路參與HSC活化過程及增加Ⅰ型膠原蛋白表達。

本研究存在一定不足， 未針對Tg誘導的內質網應激進一步干預觀察， 也缺少動物模型上相應表型的進一步驗證。綜上所述， 本研究通過對比肝纖維化患者與非肝纖維化患者病理切片免疫組化結果， 構建LX2內質網應激模型以及構建PERK過表達LX2細胞株， 初步探討內質網應激PERK信號通路在HSC活化及Ⅰ型膠原蛋白表達中的影響， 為探索肝纖維化發病機制及臨床尋找逆轉肝纖維的治療靶點提供新思路。

倫理學聲明： 本研究方案于2022年8月12日經廣西壯族自治區人民醫院倫理委員會審批， 批號： KY-KJT-2023-310。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明： 黎鳳炎負責設計論文框架， 實驗實施， 收集數據， 資料分析， 撰寫論文； 劉澤峰參與課題設計， 資料分析； 夏雨艷參與實驗實施， 收集數據； 王文娟參與資料分析； 李琪、 唐利瑕參與統計分析； 張國負責研究選題， 指導文章撰寫及修改。黎鳳炎、 劉澤峰對本文貢獻等同， 同為第一作者。

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收稿日期：2023-10-12； 錄用日期：2023-11-30

本文編輯：邢翔宇