線粒體解偶聯蛋白2 基因多態性及啟動子區域基因型與糖尿病腎病發病的關系

何愛琴，石彩鳳，周陽，楊俊偉，吳小梅

南京醫科大學第二附屬醫院腎臟病中心，南京 210003

糖尿病是全球性的公共衛生問題，其中90%是2型糖尿病［1］，糖尿病腎病（DKD）是其主要的微血管并發癥之一，已經成為慢性腎臟病的主要病因，顯著增加心血管死亡的風險［2］，早期識別DKD 發病的高危人群以及對危險因素進行早期干預是亟待解決的難題［3］。研究［4］顯示，DKD 受到基因及環境多種因素的影響。解偶聯蛋白2（UCP2）分布在線粒體內膜上，在人體中廣泛表達，包括白色脂肪組織、胰島、視網膜細胞和腎臟。UCP2 能通過“質子漏”作用使線粒體內膜外的質子直接進入線粒體基質，降低內膜兩側的質子電化學梯度，使氧化過程與二磷酸腺苷磷酸化解偶聯，使得三連酸腺苷合成減少，以及降低活性氧的產生。UCP2 的這種解偶聯作用涉及多種組織功能，如產熱、葡萄糖分泌、游離脂肪酸代謝以及調節自噬等［5］，敲除小鼠UCP2基因可以緩解急性腎損傷［6-7］。UCP2 被認為是代謝綜合征、胰島素抵抗、2型糖尿病和肥胖的候選基因［8-9］，其啟動子區域基因多態性會影響UCP2 的表達、胰島素釋放和敏感性。UCP2 基因存在3 個常見位點的多態性，包括啟動子區域的-866G/A 位點的基因多態性（rs659366），外顯子4中的Ala55Val位點的基因多態性（rs660339），以及3'未翻譯區域（3'UTR）中的45 bp 插入/刪除（Ins/Del）位點的基因多態性［10-13］。尤其是-866G/A 位點與UCP2 的表達密切相關，與G等位基因相比，A等位基因與UCP2 mRNA 表達增高相關［12，14］。但目前中國人群中UCP2 基因多態性與DKD 發病的關系尚不明確。本研究觀察了UCP2基因多態性，并分析UCP2 基因啟動子區域基因型與DKD發病的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取南京醫科大學第二附屬醫院收治的2型糖尿病患者180例。納入標準：①年齡18～75歲；②診斷為T2DM，符合美國糖尿病學會2020年制定的糖尿病診斷標準。排除標準：①曾接受腎臟替代治療，如腎移植、透析等；②任何感染性疾病的急性期；③肝硬化失代償期；④自主能力受損；⑤腎活檢組織病理提示存在非糖尿病腎病；⑥急性腎損傷。180例患者根據尿白蛋白/肌酐比值（ACR）和預估腎小球濾過率（eGFR）分為DKD 患者92 例［糖尿病腎病組，ACR≥30 mg/g、eGFR＜60 mL/（min·1.73 m2）］和單純糖尿病患者88 例［單純組，ACR＜30 mg/g、eGFR≥60 mL/（min·1.73 m2）］。糖尿病腎病組男性54 例、女性38例，年齡62.00（52.25，66.00）歲，BMI 24.99（23.25，28.17）kg/m2，血白蛋白43.70（38.28，47.83）g/L，糖化血紅蛋白 8.35%（6.98%，10.30%）；單純組男性49 例、女性39 例，年齡60.00（57.00，66.00）歲，BMI 24.80（22.99，26.67）kg/m2，血白蛋白42.20（37.80，45.40）g/L，糖化血紅蛋白8.60%（7.23%，9.88%）。本研究經南京醫科大學第二附屬醫院倫理委員會審核通過（批準號：2019KY097），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 UCP2基因測序 設計并合成好SNP位點的引物池，然后通過兩步PCR 的方法完成目標SNP 位點序列的擴增和兼容Illumina 測序文庫的制備。第一輪PCR 體系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，上游引物池（10 μmol/L）1 μL，下游引物池（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Ready Mix 15 μL（總體積25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。配制好反應體系后，在PCR 儀（BIO-RAD，T100TM）上執行以下反應程序：98 ℃預變性3 min，然后執行8個循環，條件是98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。緊接著執行25 個循環，條件是98 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。最后72 ℃延伸5 min。反應完成后，使用AMPure XP 磁珠純化回收PCR 產物。然后以第一輪PCR 產物為模板執行第二輪PCR 反應，以獲得測序帶分子標簽的文庫。反應體系如下：DNA模板（10 ng/ μL）2 μL，通用P7 引物（含分子標簽，10 μmol/L）1 μL；通用P5 引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL（總體積 30 μL）。配制好反應體系后，執行如下PCR 程序：98 ℃預變性5 min，然后執行5 個循環程序，94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最終72 ℃延伸5 min，完成后一直4 ℃。最終PCR 產物使用AMPure XP 磁珠純化回收。各個PCR 產物等量混合后，使用HiSeq XTen 測序儀（Illumina， San Diego， CA）進行測序。引物序列如下：rs660339：5'-CAGTGTTTGGAGCATCGAGATGACT-3'，5'-GTTTGACAGAATCATACAGGCCGAT-3'；rs659366：5'-TCCCTTCTGCTGGTGAAAACACATA-3'，5'-GGGATGAGAAAAGGCGTCAGGAGAT-3'；3'UTR：5'-TTCCTGGAACGTGGTGATGTTCGTC-3'，5'-ACCAGCACTGAGACAATGAGTAGAT-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計數資料以頻率或百分比表示，組間比較用χ2檢驗檢驗。利用二元Logistic回歸分析研究UCP2基因啟動子區域位點-866G/A 基因型與DKD 發病的關系，應用顯性和隱性模型來解釋基因型與表型之間的關系，顯性突變模型認為，只要個體的基因型中至少一個等位基因是突變的，相關表型就會表現出來，而隱性模型則更為嚴格，認為只有當個體的基因型中兩個等位基因都是突變的時候，相關表型才會顯現。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組UCP2 基因型頻率比較 糖尿病腎病組-866G/A 位點G/G 基因型頻率為33.0%、G/A 基因型頻率為40.9%、A/A 基因型頻率為26.1%，單純組分別為30.4%、56.5%、13.0%，兩組A/A 基因型頻率比較，P＜0.05；糖尿病腎病組Ala55Val位點C/C基因型頻率為31.8%、C/T基因型頻率為42.0%、T/T基因型頻率為26.1%，單純組分別為28.3%、57.6%、14.1%，兩組比較，P＞0.05。45bp INS/DEL位點DEL/DEL 基因型頻率為73.9%、DEL/INS 基因型頻率為23.9%、INS/INS基因型頻率為2.3%，單純組分別為84.8%、13.0%、2.2%，兩組比較，P＞0.05。

2.2 UCP2 基因啟動子區域位點-866G/A 基因型與DKD 發生的關系 在-866G/A 隱性模型中，A/A 基因型是DKD 發生的風險因素，相比于G/A 和G/G，A/A 基因型發生DKD 的風險增高2.359 倍［2.359（1.091～5.099），P=0.029］；當矯正性別、年齡后，A/A 基因型發生DKD 的風險增高2.491 倍［2.491（1.142～5.437），P=0.022］；當進一步矯正性別、年齡、糖尿病病程、糖化血紅蛋白、尿酸、總膽固醇后，A/A 基因型發生DKD 的風險增高2.491 倍［2.489（1.004～6.172），P=0.049］。在-866G/A 顯性模型中，相比于G/G 基因型，G/A 和A/A 基因型發生DKD的風險無統計學差異。

3 討論

糖尿病人群中約40%的患者合并DKD，DKD 已經成為慢性腎臟病乃至終末期腎臟病的主要病因，并且更為嚴重的是，DKD 顯著增加心血管死亡風險，預計到2040 年DKD 將成為全球第5 大常見死因［15］。由于存在尿蛋白波動甚至恢復正常、GFR 快速下降及無蛋白尿型DKD 等臨床表型，依據尿蛋白和eGFR診斷DKD的可靠性已備受爭議［16］。近年來，人們已經發現一些DKD 診斷的生物標志物，比如TNF受體、小管損傷標志物等，但是由于缺乏大規模臨床驗證，其應用仍受到制約。目前，DKD的治療主要包括控制血壓、血糖等，特異性針對DKD的治療有限，且只能延緩而不能逆轉腎功能進展。早期識別DKD 的高風險人群是改善DKD 預后的重要步驟。DKD 的發病機制復雜，多種因素與DKD 的發生和進展相關。研究［17］發現，不論是T1D 還是T2DM，DKD的發生均具有家族聚集性。其中遺傳因素與DKD的發生關系密切，因此，研究特定蛋白的基因多態性是識別DKD發病高風險人群的重要手段。

UCP2是重要的能量代謝的相關蛋白，其可以減少活性氧的產生，被認為是參與代謝疾病重要的分子。我們實驗室前期研究［18］發現，口服UCP2 抑制劑京尼平可減少葡萄糖誘導的白蛋白通過足細胞單層的滲漏，從而阻止C57BL/6J 小鼠DKD 的進展，認為UCP2 是參與DKD 發生及進展的重要蛋白。UCP2基因于1997年被首次發現［19］，其位于大鼠1號染色體、小鼠7號染色體和人類11號染色體上［20］，人類UCP2 基因包括8 個外顯子和7 個內含子。UCP2啟動子區域的基因多態性可以改變UCP2 的蛋白表達。截至目前為止，UCP2基因中大多數已確定的多態性都顯示出低頻率，因此尚未得到深入的研究。本研究發現，UCP2 啟動子區域3 個常見基因多態性位點中只有-866G/A 位點與DKD 的發生有關，在調整混雜因素后，-866G/A 位點A/A 基因型發生DKD的風險增高2.489 倍。既往研究［21］已經發現，-866G/A 多態性具有明確的功能，通過改變轉錄因子的結合位點影響基因的表達，與氧化應激標志物水平升高有關。我們猜想，可能是由于-866G/A 基因位點參與調節UCP2 的蛋白表達，因此其與DKD發病的關系更為密切，遺憾的是本研究中僅僅關注了UCP2 基因多態性與DKD 發生的關系，后續需要進一步的研究闡明UCP2 基因多態性與腎臟UCP2表達的關系。盡管目前沒有證據表明Ins/Del 多態性對UCP2 表達具有功能性影響，但它位于基因的3'非翻譯區，該區域是microRNA 連接的主要位點，而microRNA 是基因表達的主要調節因子，Ins/Del多態性可能會改變某些microRNA 的連接位點從而影響基因表達［22］。而Ala55Val 多態性導致保守氨基酸變化，但沒有跡象表明它會導致蛋白質功能變化。本研究并未發現UCP2 啟動子區域的另外兩個位點的基因多態性與DKD 的相關關系，這與之前的研究結果也是一致的，可能是位點的突變并未影響UCP2的蛋白表達或者功能。

總之，UCP2 基因-866 G/A 基因位點多態性與DKD 的發病顯著相關，攜帶A/A 基因型的的糖尿病患者發生DKD 的風險顯著增加，這一發現為針對糖尿病患者的早期干預提供了重要依據。需要進一步研究闡明UCP2 基因多態性與腎臟UCP2 表達的關系，推動DKD診治的精準化和個體化管理。