基于去卵巢大鼠開展針灸治療絕經后骨質疏松癥的實驗研究進展

李自如,鄭 瓊,遲振海,熊 鵬,毛強健

(江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330000)

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是隨著年齡的增長女性絕經后,骨吸收超過骨形成,導致骨量減少、骨脆性升高、骨組織顯微結構退化,臨床表現為易發生骨折的一種代謝疾病[1-2]。以往研究表明PMOP主要是由于雌激素水平的下降導致[3-4],但近年來已有越來越多的研究發現PMOP的發病涉及骨免疫異常、慢性炎性反應、骨髓微循環障礙等多方面、多通道因素調控[5]。目前,在國內外治療PMOP方面,藥物治療仍是最常用的方法。然而,長期持續使用這些藥物往往會產生一定的毒副作用[6]。針灸作為一種高效的、無毒副作用的療法已大量應用于臨床治療PMOP,且取得較佳療效[7-9]。一項納入16項研究涉及1 585例PMOP患者在內的系統評價表明針灸治療在改善PMOP骨痛、提高臨床有效率等方面具有較好療效[10],為針灸治療PMOP提供臨床證據。

為了深入了解針灸治療PMOP機制,越來越多的學者采用動物模型進行實驗研究。通過動物實驗進行PMOP研究時,合理選擇實驗動物極其重要,去卵巢大鼠是美國食品與藥品管理局和世界衛生組織推薦PMOP的模型,這種模型已被廣泛應用于研究絕經后婦女發生PMOP的病理過程,并已得到公認[11]。切除雙側卵巢的大鼠體內雌激素分泌水平、骨代謝情況與絕經后婦女相似,骨轉換率高,主要導致松質骨骨量減少,具有價格低廉、重復性較好的優點[12]。本文梳理了近年來基于去卵巢大鼠為模型開展的針灸治療PMOP的實驗研究,總結了學者們從多個角度探討出的實驗結論,為針灸治療PMOP向臨床應用轉化提供實驗證據。

1 針灸對去卵巢大鼠相關骨細胞信號轉導通路的影響

1.1針灸對去卵巢大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響 Wnt信號轉導途徑是一種復雜的信號傳遞系統,涉及多條下游通路。其主要由外源性配體蛋白Wnt和細胞膜上的蛋白質受體結合激活,并引起一系列的細胞反應。其中Wnt/β-catenin信號通路是該系統中的核心通路,對骨代謝具有至關重要的作用。該信號通路中各種因子的水平變化會直接影響成骨細胞的生成和分化,加速骨祖細胞產生并抑制其成脂分化的過程,導致破骨細胞凋亡,從而促進骨量增加[13-14]。β-catenin是一種多功能的蛋白質,可調節細胞-細胞黏附和基因轉錄的協調,游離的β-catenin可從細胞膜移行細胞核,在Wnt信號傳導途徑中充當細胞內信號轉導物,被認為是Wnt信號通路被激活的標志[15]。當細胞質中的β-catenin累積一定量時則移行細胞核,與T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)結合,促進下游靶基因的轉錄,進一步提高成骨細胞的數量和分化程度[16-18]。Dickkopf相關蛋白1(dickkopf-related protein 1,DKK1) 是介導骨形成的關鍵蛋白質之一,表現為抑制間充質干細胞和成骨細胞的正常功能,同時促進成骨細胞凋亡[19]。

實驗研究顯示,通過對去卵巢大鼠腎腧穴施以針刺刺激后,可明顯下調細胞因子DKK1的表達水平,從而影響Wnt/β-catenin信號通路的調控機制,進而發揮調節骨代謝的作用,減緩骨質下降[20]。Wnt3a蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的起始因子,當Wnt3a蛋白激活時,與細胞膜上的跨膜受體LRP5/6,Frizzle蛋白結合,阻止胞質內的β-catenin降解[21]。王亞軍等[22]用電針去卵巢大鼠腎俞、脾俞、三陰交、足三里,電針強度為斷續波,2 Hz,1.0 mA,每天1次,每次15 min,20 d為1個療程,共治療3個療程,結果表明電針可顯著升高去卵巢大鼠Wnt3a和β-catenin 基因及蛋白表達水平。

髓間充質干細胞( bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)是骨髓中含量最豐富的細胞,對骨穩態維持有重要作用[23]。BMSCs還具有分化為多種干細胞的潛能,如成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等[24]。Wnt/β-catenin信號通路作為經典Wnt轉導途徑,與BMSCs的增殖和成骨分化、成骨細胞和破骨細胞的增殖分化及功能密切相關[25]。姚長風等[26]研究發現,艾灸去卵巢大鼠三陰交、關元穴可上調BMSC中Wnt3a、LRP5/6、β-catenin mRNA的表達,調控Wnt/β-catenin信號轉導通路,抑制Dkk1的表達,升高骨鈣素水平,促使BMSCs轉化為成骨細胞,恢復骨代謝平衡。

1.2針灸對去卵巢大鼠OPG/RANK/RANKL信號通路的影響 破骨細胞是PMOP發生發展的關鍵細胞,而OPG/RANK/RANKL信號通路在破骨細胞的產生分化過程中發揮重要作用。骨保護素(OPG)主要由成骨細胞產生,且隨著細胞的分化成熟進一步增加,對破骨細胞有直接負向調控作用[27]。RANKL是TNF家族Ⅱ型同源三聚體蛋白,實驗研究發現, RANKL表達增多,會增加骨組織的吸收,導致骨組織的密度降低及其他PMOP的表現[28]。RANK是一種Ⅰ型同源三聚體跨膜蛋白,是RANKL的受體激活劑[29]。OPG/RANK/RANKL信號通路對骨破壞機制的影響主要是通過RANKL與RANK結合,從而誘導破骨前體細胞接收信號分子并促進其向破骨細胞分化成熟[30]。OPG可與RANKL相結合,從而減少RANK與RANKL結合,延緩破骨細胞的分化,維持骨代謝平衡[31]。去卵巢會導致大鼠OPG水平下降, RANKL蛋白表達下降、RANK蛋白表達量升高,電針干預可上調去卵巢大鼠OPG的表達,提高去卵巢大鼠RANKL、抑制RANK的表達[32-33]。 然而,在一些學者的研究中,卵巢切除對RANKL表達的影響并不具備一致性,這種不一致性可能與樣本選取、檢測部位、檢測方法等因素有關[34]。尹秦等[35]研究發現去卵巢大鼠下丘腦及股骨遠端組織中,OPG的表達水平呈下降趨勢,而RANKL的表達水平則呈上升趨勢。這一結果提示下丘腦在股骨組織的RANKL/OPG信號通路表達方面發揮著協同調控的作用。針刺干預后,大鼠下丘腦及股骨組織中OPG mRNA和蛋白表達量均有顯著升高,而RANKL mRNA和蛋白表達量則明顯下降,說明針灸可調節OPG/RANKL信號通路表達,促進骨吸收作用,提高骨密度。

1.3針灸對去卵巢大鼠TGF-β/Smad信號通路的影響 轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 是一種由結構相似的多功能細胞因子組成的超家族,在骨代謝過程中發揮著重要作用。TGF-β能夠介導骨形成和骨吸收之間的偶聯,并增強成骨細胞的數量和活性,同時刺激其增殖和分化,調控骨重建的過程,并維持骨代謝平衡[36]。研究發現PMOP患者的骨小梁內TGF-β水平下降,補充外源性TGF-β可弱化破骨細胞作用,促進骨形成[37]。TGF-β1是TGF-β超家族的多肽成員,能夠調控細胞生長、增殖、分化和凋亡。Smad蛋白家族是TGF-β家族受體下游的信號轉導分子,能夠通過與細胞核內其他轉錄因子結合或直接調控DNA轉錄而介導TGF-β的信號轉導[38]。研究結果表明,大鼠去除卵巢后股骨遠端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ的表達含量發生了明顯變化。然而,在進行了針刺干預后,這些指標在骨組織中趨向于好轉。因此,可以推測針刺能夠調節大鼠TGF-β1/Smad4信號通路的表達[39]。骨形態發生蛋白-2(BMP-2)是TGF-β超家族成員之一,可促進多種細胞的生長、分化和抑制細胞的凋亡。鮑圣涌等[40]發現電針治療可上調去卵巢大鼠TGF-β1、BMP-2的蛋白表達水平,這一作用機制可能與同配體結合后啟動Smads信號轉導蛋白、激活TGF-β1/Smads、BMP-2/Smads信號轉導通路、促進成骨細胞增殖分化有關。秦瑋等[41]研究認為電針命門穴可調節去卵巢模型大鼠下丘腦BMP-2及Smad1/5的表達。

2 針灸對去卵巢大鼠激素的影響

2.1針灸對去卵巢大鼠性激素的影響 女性絕經后雌激素迅速下降是PMOP發生發展的主要原因。研究認為,雌激素可以通過調節胰島素生長因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素等因子的表達,從而增強成骨細胞活性、減少成骨細胞凋亡,還可以穩定免疫系統、抑制細胞因子的炎癥狀態來減少對破骨細胞的刺激[42]。通過以上途徑,雌激素可以達到刺激骨形成、緩解骨吸收、降低骨量流失、保持骨密度等作用。實驗研究顯示,去卵巢后大鼠的內分泌環境發生變化,這種變化與人類絕經期激素水平變化相吻合[43]。具體而言,去卵巢大鼠血清中卵泡刺激激素(FSH)水平呈上升趨勢,而雌二醇(E2)水平則呈下降趨勢,經針刺及穴位注射干預后大鼠血清FSH水平下降、E2水平升高。也有研究選取腎俞穴針刺,于去卵巢大鼠11周齡開始,每周進行3次針刺,直至26周齡,檢測發現去卵巢大鼠血清E2明顯升高,且提升了假手術大鼠的血漿睪酮水平[44]。胡靖等[45]采用麥粒灸干預去卵巢大鼠,發現麥粒灸治療后去卵巢大鼠腰椎骨密度和血清E2的水平上升,血清堿性磷酸酶的水平降低。BMSCs是E2的特異性靶細胞,研究發現大鼠在去除卵巢后,其BMSCs中核受體-雌激素受體(estrogen receptor,ER)mRNA的表達下調明顯,艾灸干預后ERαmRNA上調,并推測骨髓間充質干細胞中ERαmRNA表達的相對上調和血液中E2濃度增加有密切關系,可能直接對BMSCs的成骨轉化產生影響[46]。

2.2針灸對去卵巢大鼠其他激素的影響 生長激素(GH)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)是兩種重要的內分泌因子,對骨代謝具有調控作用。GH能夠直接刺激成骨細胞的增殖和分化,同時也可以促進破骨細胞的分化,從而對骨重吸收產生影響[47]。然而,GH的大部分作用,如促進骨骼生長等,需要IGF-1的介導。兩者之間的平衡是促進骨量增加的一個重要條件。此外,在機體內,GH會被肝臟合成并釋放IGF-1。這表明GH和IGF-1在骨代謝過程中緊密相關,二者的協同作用對于骨健康至關重要[48-49]。研究表明,電針聯合滋腎強骨湯可改善去卵巢大鼠骨組織和血清中GH/IGF-1系統的動態平衡,增強去卵巢大鼠的骨密度[50]。瘦素(leptin,LP)是調節體重與進食的重要激素, 與瘦素受體(OB-R)結合時對骨代謝具有調節作用[51]。研究發現電針腎俞、足三里、關元、三陰交能夠抑制去卵巢后大鼠血清及下丘腦中LP及、OB-R含量的升高,降低其骨形成中樞抑制作用,并認為LP在外周以促進骨代謝為主[52]。

3 針灸對去卵巢大鼠基因表觀遺傳修飾的影響

近年來,表觀遺傳學是PMOP發病機制的研究熱點之一。表觀遺傳修飾是指在基因序列不變的情況下,通過改變DNA和組蛋白等結構上的化學修飾,對基因表達進行調控的過程。其范圍涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、微小RNA等多個方面。前期研究表明,表觀遺傳因素對骨細胞的分化和活性有很大的影響,并與PMOP的發病相關[53]。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方式,它通過改變DNA分子的化學結構,從而對基因表達進行調控。這種修飾在生物體中廣泛存在,包括在哺乳動物體內。DNA甲基化會發生在CpG二核苷酸上,同時也涉及多個甲基轉移酶及相關輔助蛋白[54]。Runx2作為一種重要的轉錄因子,能夠對骨骼發育過程中的多個關鍵基因進行調節。這些基因包括骨鈣、骨橋蛋白、骨唾液蛋白以及Ⅰ型膠原等成骨細胞表型相關基因[55-56]。研究發現,切除卵巢后大鼠骨組織中DNA甲基化水平增高,特別是在Runx2啟動子區域。這種高甲基化狀態抑制了Runx2的轉錄和表達,從而降低了骨組織中多種成骨細胞表型相關基因,如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原等的表達水平[57]。Fan等[58]采用電針去卵巢大鼠關元穴發現電針可提高Runx2的表達水平,激活ALP,提升BGP水平,從而促進BMSCs的增殖和向成骨細胞方向分化,增加骨密度。另有研究表明,電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runx2啟動子甲基化水平,上調Runx2的表達,促進成骨細胞表型基因表達,從而增加骨密度[59]。

組蛋白是一類結構和功能多樣的小分子堿性蛋白,作為DNA纏繞的線軸參與構成染色質。除了組成染色體的結構基礎外,組蛋白還能通過其尾部氨基酸殘基上的化學修飾來調控基因表達。組蛋白末端常見的化學修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。組蛋白的修飾方式和程度會受到一系列結構和功能相關的蛋白質因子的調控。一些具有特定功能的蛋白質因子,如染色體去乙酰化酶和組蛋白甲基轉移酶等,通過與細胞核內的特定位點相互作用,來調節組蛋白修飾的狀態,以達到對基因表達的調控[60]。組蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase2,HDAC2)通過調控組蛋白的乙酰化狀態對骨代謝產生一定的影響[61]。 相關研究表明,電針療法可以促進成骨細胞增殖和分化,從而有助于改善骨質疏松癥。具體機制可能電針治療抑制HDAC2的表達,使得乙酰化組蛋白H3表達水平升高,這進一步上調了Runx2基因及蛋白的表達,并促進了下游的成骨基因ALP的表達[62]。

此外,PMOP與鈣調節激素(降鈣素、甲狀旁腺激素)、鈣離子轉運、免疫細胞因子有關。研究表明,電針能增強參與鈣離子吸收跨細胞途徑的TRPV5,PMCAlb的mRNA和蛋白表達以及細胞旁途徑ZO-1,occludin的mRNA和蛋白表達,提高去卵巢大鼠的骨密度[63]。

4 小 結

以往的研究中,針灸治療PMOP主要集中在激素和骨形態學方面。然而,近年來學者們開始從不同的角度出發,包括信號通路、細胞因子以及基因表觀遺傳等多個領域,探討該病的發病機制。這種多角度的探索方式有利于更深入地了解該疾病,從而為針灸治療的實驗研究提供更加豐富的證據支持。

盡管研究已經在不斷進展,但是目前仍存在一些問題。例如:在激素方面,研究主要集中在性激素上,缺乏對于鈣調節激素的研究,而鈣調節激素是PMOP發病的關鍵。因此,為了更好地理解該疾病,未來需要加強相關研究,包括鈣激素相關受體、調節基因、調節信號通路等。

當前,針灸干預手段主要采用毫針針刺和電針,但是關于刺激參數的研究較少。完善刺激強度、時間、頻率等方面的研究,有助于我們更好地理解針灸對于PMOP的影響。此外,盡管少量實驗采用艾灸干預,但是針灸治療手段非常豐富,未來可以選用如熱敏灸、穴位貼敷等多種干預手段進行研究。

在選穴方面,中醫理論認為PMOP屬于“骨痿”范疇,而腎主骨和脾腎虛是其發生的根本機制[64]。因此,基于這一原則,可以選擇補益脾腎穴位如腎俞、脾腎、太溪、命門以及三陰交等進行研究,并驗證穴位特異性,或者通過多穴配伍方式觀察聯合效果,最終促進實驗研究向臨床轉化。

綜上所述,去卵巢大鼠的病程演變和病理變化與PMOP患者十分相似。基于去卵巢大鼠開展的針灸治療PMOP的研究結果顯示,針灸可以多靶點、多途徑干預PMOP。然而,目前仍存在一些問題,例如今后的相關實驗應該基于臨床進行,豐富干預手段,針對選穴、刺激參數、干預時長等方面開展標準化的針灸干預PMOP研究,以確定高效的規范化治療方案;PMOP有明顯的時間性,與絕經關系密切,因此可利用針灸具有預處理的機制特點,將針灸治未病應用到PMOP的研究中,探索針灸提早介入PMOP的療效;針灸發揮作用具有多層面、多靶點、多通路的特性,還應加強相關信號通道、受體途徑以及基因修飾等機制的研究。總之,針灸治療PMOP的實驗研究面臨著多個挑戰和機遇,需要我們以更加全面、深入的方式來理解該疾病及其治療方法。未來的研究方向應包括但不限于從激素到其他關鍵因素的研究,優化干預手段并系統評估效果,探索治未病的新思路,并加強對于針灸在分子機制層面上的解釋與研究。通過深入研究,我們相信將會有更多的突破和進展,為針灸干預PMOP提供更加有效和可靠的證據。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。