仙客來枯萎病病原菌產孢培養基篩選及培養條件優化

宋卓琴 賈民隆 梁崢 梁曉霞 屈璐 王玉川 段九菊 曹冬梅

摘要 為了獲得高濃度的仙客來枯萎病病原菌的孢子懸液，通過對不同營養培養基進行初篩，再以初篩營養成分進行正交試驗，得到最佳營養配比，進一步通過單因素試驗對培養基的pH和培養溫度進行篩選。結果表明，馬鈴薯、綠豆、蔗糖為仙客來枯萎病病原菌產孢培養基的最佳營養成分，最佳配比為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，培養基最佳pH為6，最佳培養溫度為30 ℃。研究結果明確了仙客來枯萎病病原菌的產孢條件，為仙客來枯萎病的感病機理、防治技術及孢子萌發抑制等研究奠定基礎，同時對指導實際生產中科學管理、綜合防治病害具有重要意義。

關鍵詞 仙客來枯萎病；病原菌；產孢培養基；培養條件

中圖分類號 S682.2+62? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）10-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.035

Optimization of? Sporulation Medium and Culture Conditions of the? Pathogen of? Cyclamen Wilt Disease

SONG Zhuo-qin，? JIA Min-long，? LIANG Zheng et al

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taiyuan，Shanxi? 030031）

Abstract In order to obtain a high concentration spore suspension of the pathogen causing Cyclamen wilt disease， different nutrient media were preliminarily screened， and then orthogonal experiments were conducted to obtain the optimal nutrient ratio based on the initial screened nutrients. Furthermore， single factor experiments were conducted to screen the pH and culture temperature of the media. The results showed that potatoes， mung beans， and sucrose were the optimal nutritional components for the sporulation culture medium of the pathogen of Cyclamen wilt disease. The optimal ratio was mung bean 5.0%， sucrose 0.5%， and potato 20%. The optimal pH of the culture medium was 6， and the optimal culture temperature was 30 ℃. Clarifying the spore production conditions of the pathogen causing Cyclamen wilt disease lays the foundation for the research on the pathogenic mechanism， prevention and control techniques， and spore germination inhibition of Cyclamen wilt disease. At the same time， it is of great significance for guiding scientific management and comprehensive prevention and control of diseases in actual production.

Key words Cyclamen wilt disease;Pathogenic bacteria;Spore producing culture medium;Cultivation conditions

基金項目 山西省農業科學院優秀青年基金項目（YCX2020YQ11）。

作者簡介 宋卓琴（1985—），女，山西屯留人，助理研究員，碩士，從事觀賞植物生理、病理研究。

*通信作者，研究員，博士，從事觀賞植物分子生物學和栽培育種研究。

收稿日期 2023-07-19

仙客來（Cyclamen persicum Mill.），是報春花科仙客來屬多年生塊莖花卉，原產于地中海東部沿岸、希臘、土耳其南部、敘利亞、塞浦路斯等地，花冠五裂片呈長橢圓形向上翻卷、扭曲，形似兔耳，亦稱兔耳花、兔子花，且品種豐富，花期長達180～240 d，深受人們的喜愛［1-4］。2022年，仙客來全國的生產量達2 000萬盆左右，是我國重要的年宵花卉。

枯萎病是仙客來主要的一個真菌病害，發病率在35%左右，病菌以菌絲體、分生孢子、厚垣孢子隨病株殘體在土壤中越冬［4-5］，其中菌絲體可在土壤中腐生存活3年，此病具有發生突然、蔓延迅速、致死率高的特點［6-7］。植株感病后表現為葉片局部或全部黃化、萎蔫，葉柄水漬化，表皮開裂，最后變褐，直到整株死亡［8-10］，嚴重影響仙客來觀賞性和商品性，隨著仙客來大范圍種植及規?；a，病害發生也逐漸加重，直接造成的損失可達2%～5%。

目前國內對仙客來病害的研究主要集中在病害的化學防治、生物防治及栽培管理等方面［4-8］，而對于仙客來枯萎病病原菌的研究很少。2019年筆者所在項目組在長子方興仙客來種植基地采集枯萎病病株，并對病原菌進行了組織分離，經初步鑒定病原菌為尖孢鐮刀菌。在此基礎上，對病原菌的生物學特性開展了一系列的研究，主要針對仙客來枯萎病病原菌的培養基及培養條件進行了研究，通過培養基的初篩，及營養成分不同配比的正交試驗，確定培養基配方，進一步優化培養條件，篩選出適宜病原菌生長的產孢培養基，從而探明仙客來枯萎病病原菌的生長特性，為仙客來枯萎病的病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

仙客來枯萎病病原菌由長子方興仙客來生產基地的病株分離、純化獲得。采用科赫法則驗證以及分子生物學鑒定確定該病原菌為尖孢鐮刀菌，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 培養基

病原菌的活化采用PDA培養基，選取7種不同營養成分的培養基對病原菌進行培養，具體配方見表1。

1.3 培養基成分優化

分別選取馬鈴薯、綠豆、蔗糖的濃度作為3因素，每種因子設定3個水平，按正交表L9（34）（表2）組合的條件培養病原菌，每組試驗重復3次。培養方法參考“1.6”，測定方法參考“1.8”。

1.4 培養基pH的優化

在“1.3”優化獲得的培養基上分別比較培養基pH 4、5、6、7、8、9和10這7個梯度下的病原菌的生長情況及產孢情況。

1.5 培養溫度的優化

在“1.4”優化的基礎上分別比較培養溫度為15、20、25、30、35 ℃時病原菌生長情況及產孢情況。

1.6 培養方法

將病原菌在PDA培養基上活化后，用5 mm的打孔器取菌落邊緣長勢一致的菌塊接種至倒好培養基的培養皿中央，在28 ℃的無菌培養箱中進行培養。

1.7 病原菌孢子懸液制備

將培養7 d的平板用刮針刮取菌苔并用無菌水多次清洗全部移入三角瓶中，并在漩渦儀上充分振蕩3 min，制得病原菌孢子懸浮液，用于孢子量的測定。

1.8 測定項目與方法

菌落生長速率的測定采用十字劃線法，接種后第2天開始測定菌落的直徑，連續測定5 d，菌落生長速率=菌落直徑/5 d。孢子量的測定采用血球計數板計數法。

1.9 數據處理

試驗數據采用Excel 2010 和SPSS 24.0 軟件進行統計分析，采用LSD 法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同營養成分培養基培養下仙客來枯萎病病原菌的菌落生長情況及產孢情況

仙客來枯萎病病原菌在7種不同營養成分培養基長勢不同，分生孢子產孢量差異顯著。由圖1可知，生長速率最快的是馬鈴薯培養基，PDA和PSA均顯著高于其他培養基，其次是綠豆培養基，仙客來培養基生長最慢。由圖2可知，綠豆培養基的產孢量最大，達10.40×107個/mL，其次是PSA和PDA，OA培養基產孢量均處于中等，CMA、香蕉、仙客來葉片培養基產孢量相對較少。PSA培養基生長的菌絲體最濃密，其次是綠豆培養基，CMA培養基菌絲生長最稀疏（圖3）。綜合考慮，選擇綠豆、馬鈴薯、蔗糖作為營養成分進行下一步的正交試驗，篩選最佳配比。

2.2 正交試驗結果

根據產孢培養基的初篩結果，選擇綠豆、蔗糖、馬鈴薯作為3因素，并設置3水平進行正交試驗（表2），對培養基的主成分進行優化，得到最佳培養基組成。正交試驗結果見表3，由R1可以看出RB>RA>RC，因此各因素對生長速率的影響B>A>C，即培養基中蔗糖含量對病原菌的生長速率影響最大，由R2可以看出RC>RA>RB，因此各因素對分生孢子總量的影響C>A>B，即培養基中馬鈴薯含量對病原菌的產孢量影響最大。從表4可以看出，各因素對病原菌生長速率的影響均達極顯著水平，馬鈴薯含量對分生孢子總量的影響顯著，因此，通過正交試驗得出產孢培養基各因素的最佳比例為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，產孢量達13.22×107個/mL。

2.3 基于正交試驗結果的產孢培養基pH優化

以最佳培養基配方為基礎培養基，將產孢培養基的pH調至4～10分別對病原菌進行培養，結果（圖4）顯示，病原菌的適應性很強，在pH為4～10時都能生長，pH為4～6時，隨pH增大，病原菌的生長速率和產孢量均增加，當pH為6時，生長速率和產孢量均達最高，顯著高于其他處理，當pH大于6時，隨pH增大，病原菌的生長速率和產孢量逐漸降低，因此確定pH=6為病原菌的最適pH。

2.4 培養溫度的優化

以最佳培養基配方為基礎培養基，進行培養溫度的優化。由圖5可知，培養溫度在15～30 ℃，病原菌的生長速率和產孢量均呈上升趨勢，培養溫度為30 ℃時，生長速率和產孢量均達到最大值，顯著高于其他培養溫度，生長速率達11.61 mm/d，產孢量達13.85×107個/mL，培養溫度高于30 ℃后，病原菌的生長速率和產孢量迅速下降，35 ℃時最低，顯著低于其他培養溫度。因此，病原菌的最佳培養溫度為30 ℃。

3 結論與討論

對真菌的致病性、耐藥性及抗真菌藥物的研究中，快速大量獲取孢子懸浮液是這些研究的前提條件［11］。對枯萎病及其病原菌產孢條件的研究較多，但自然界中各種作物枯萎病病原真菌的種類很多，致病性、產生色素、產孢條件以及產孢特點等有所差異［12］。張茂星等［13］設置不同硝/銨配比的

氮源、不同pH來培養香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌，并探明其最適生長條件?？灯贾サ龋?4］研究了不同培養基對其菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響，明確尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的最適生長條件。該研究是以導致仙客來產生枯萎病的病原菌為研究對象，對其產孢培養基及培養條件進行研究。

該研究首先進行了初始培養基成分的篩選，研究PDA、PSA、CMA、綠豆培養基、香蕉培養基、仙客來培養基、OA 7種不同營養成分的培養基，病原菌生長及產孢量，結果表明生長速率最快的是馬鈴薯培養基，其次是綠豆培養基，產孢量最多的是綠豆培養基，達10.40×107個/mL，其次是馬鈴薯培養基，這與楊冬靜等［15］的研究結果相似，馬鈴薯蔗糖培養基培養病原菌產孢量高，且大小均勻、形態整齊，綠豆培養基中孢子形態多樣，更適用于對病原菌孢子的觀察，而仙客來培養基可能由于在加熱滅菌過程中破壞了其中的生長因子，反而不適宜病原菌生長。因此選出馬鈴薯、綠豆、蔗糖作為初始培養基主要營養成分。

正交試驗法因其高效、經濟的優點，廣泛用于菌株培養條件的優化［16-17］。該研究根據產孢培養基的初篩結果，選擇綠豆、蔗糖、馬鈴薯作為3因素，并設置3水平，進行正交試驗，對培養基的主成分進行優化，得到最佳培養基組成，結果表明營養成分配比為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，產孢量達到最高為13.22×107個/mL，此培養基培養的病原菌既可以獲得最大孢子量，用于后續的病害防治、發病機理研究等，還可以滿足對各種形態孢子的觀察，對于病原菌的進一步鑒定非常有意義。

pH不僅可以影響細胞膜和溶液中物質的帶電性，還可以影響菌株產酶活性，進而影響菌株對培養基中營養成分的吸收，通過單因素試驗對初始培養基的pH及培養溫度進行優化，確定其生長的最佳環境條件，對指導生產中環境的控制具有重要意義。該研究結果表明仙客來枯萎病病原菌的適應性很強，在pH為4～10都能生長，pH 6為病原菌的最適pH，這與秦涵淳等［18-19］的研究結果相似。溫度作為影響微生物生長代謝的重要因素，在菌株發酵條件優化過程中至關重要［20］，菌種不同，可耐受的溫度不同，該研究通過單因素試驗結果表明培養溫度30 ℃為病原菌的最適產孢溫度，這與文增葉等［12］研究的三七根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的生物學特性研究結果相似。

在仙客來盆花的實際生產中，基質pH要求控制在5.5～7.0，溫度控制在15～30 ℃，夏季高溫的情況下溫度控制在25～30 ℃，這正好是病原菌最適生長的環境條件，很好地解釋了夏季高溫條件下仙客來枯萎病易發生的重要原因，該研究結果對于指導實際生產，如何從栽培管理的角度科學防治仙客來枯萎病的發生具有重要意義。但對于仙客來枯萎病的防治還需要深入研究，下一步將開展抑菌方面的研究。

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