基于病菌孢子捕捉和realtime PCR技術的田間空氣中小麥白粉病菌孢子動態監測及病情估計模型研究

摘要

利用Burkard定容式孢子捕捉器結合realtime"PCR定量技術，分別對種植高抗、中感和高感白粉病小麥品種的田間空氣中白粉病菌分生孢子濃度進行監測，結果表明，realtime"PCR定量與傳統的顯微觀察計數兩種方法測得的孢子濃度呈顯著正相關（P≤0.01），且兩種病菌孢子計數方法在同一抗性品種上監測到的孢子濃度動態相近。此外，兩種方法測得的孢子濃度與各氣象因子的相關性分析結果一致，空氣中的白粉病菌孢子濃度主要與空氣相對濕度顯著正相關。在此基礎上，利用兩種方法測定的田間空氣中白粉病菌孢子濃度分別建立了基于累積孢子濃度的田間病情估計模型。分析發現，基于兩種孢子濃度測定方法建立的病情估計模型間無顯著性差異，表明realtime"PCR定量技術測定的孢子濃度在構建白粉病病情估計模型上具有一定可行性。該結果為realtime"PCR定量技術與病菌孢子捕捉技術相結合用于小麥白粉病的監測和預測提供理論依據。

關鍵詞

小麥白粉病;"病菌孢子捕捉;"實時熒光定量PCR;"病原菌監測;"病情估計模型

中圖分類號：

S"435.121.4

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023516

Dynamic"monitoring"of"aerial"conidia"and"disease"estimation"models"for"wheat"powdery"mildew"in"fields"using"pathogen"spore"traps"coupled"with"realtime"PCR"technique

WANG"Aolin1，2，"SHANG"Zhaoyue1，5，"ZHANG"Meihui1，"WANG"Gui1，"HU"Xiaoping2，"XU"Fei3，SUN"Zhenyu4，"CAO"Shiqin4，"LIU"Wei1*，"FAN"Jieru1*，"ZHOU"Yilin1*

（1."State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"Chinese"

Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China;"2."State"Key"Laboratory"for"Crop"Stress"Resistance"

and"HighEfficiency"Production，"College"of"Plant"Protection，"Northwest"A"amp;"F"University，"Yangling"712100，"China;"

3."Key"Laboratory"of"Integrated"Pest"Management"on"Crops"in"Southern"Part"of"North"China，"Ministry"of"Agriculture"

and"Rural"Affairs，"Institute"of"Plant"Protection，"Henan"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Zhengzhou"450002，"China;"

4."Institute"of"Plant"Protection，"Gansu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Lanzhou"730070，"China;"5."Key"

Laboratory"of"the"Pest"Monitoring"and"Safety"Control"of"Crops"and"Forests"of"Xinjiang"Uygur"Autonomous"

Region，"College"of"Agronomy，"Xinjiang"Agricultural"University，"Urumqi"830052，"China）

Abstract

In"this"study，"a"combination"of"realtime"PCR"assay"and"Burkard"7day"recording"spore"traps"was"used"to"monitor"airborne"Blumeria"graminis"f.sp."tritici"（Bgt）"conidia"in"the"fields"across"three"wheat"varieties"exhibiting"highly"resistant，"moderately"susceptible"and"highly"susceptible"levels."There"were"significant"correlations"（P≤0.01）"between"conidia"concentrations"obtained"by"using"a"compound"microscope"and"a"realtime"PCR"assay."The"dynamics"of"airborne"Bgt"conidia"concentrations"on"same"resistant"varieties"were"found"to"be"similar"when"determined"by"two"methods."Furthermore，"the"correlations"between"meteorological"factors"and"conidia"concentrations，"as"determined"by"the"two"methods，"were"almost"identical，"with"conidia"concentrations"mainly"exhibiting"significant"positive"correlations"with"humidity."Subsequently，"disease"estimation"models"for"wheat"powdery"mildew"between"disease"index"and"accumulated"conidia"concentration"were"constructed"using"two"methods，"respectively."Parallel"curve"analysis"showed"that"there"were"no"significant"differences"in"the"fitted"models"established"based"on"two"methods"for"measuring"accumulated"conidia"concentration."The"conidia"concentration"determined"by"the"realtime"PCR"technique"for"fitting"mildew"estimation"models"has"proven"to"be"practical"and"efficient."These"results"suggested"that"the"pathogen"spore"trap"technique"coupled"with"realtime"quantitative"PCR"offers"a"potential"tool"for"both"monitoring"and"predicting"wheat"powdery"mildew.

Key"words

wheat"powdery"mildew;"pathogen"spore"trap;"realtime"quantitative"PCR;"monitoring"of"pathogen;"disease"estimation"model

小麥白粉病是由Blumeria"graminis"f.sp."tritici（Bgt）引起的典型氣傳多循環病害，在我國發生范圍廣，危害面積大［12］。尤其是近年來生產上種植的小麥多為感病品種，且栽培上實行高肥水管理，使白粉病在我國常年維持高位發生狀態，年平均發病面積約600萬hm2［3］。田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的數量是影響該病害流行的重要驅動因素，掌握空氣中病原菌數量動態對該病害的監測和預警具有重要意義［45］。利用病菌孢子捕捉器可以實現對田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子濃度的連續監測，在此基礎上，結合環境條件、寄主抗性水平和病害調查數據等，能夠進一步分析影響白粉病菌分生孢子濃度動態變化的因素及其與病害發生強度之間的關系［67］。研究發現，當周累積孢子濃度和一周前累積孢子濃度與病情指數均存在顯著的對數關系［810］;且無論在高感還是中感白粉病的小麥品種上，當周累積孢子濃度與病情指數均存在顯著的對數關系［1112］。閆征遠等［13］進一步根據不同年度和不同品種上田間孢子濃度的監測結果及其與病害發生之間的關系建立了基于不同時段累積孢子濃度的白粉病病情估計模型。

目前，在小麥白粉病菌孢子捕捉與監測研究中，前人均利用傳統的顯微觀察計數來獲取并換算得到孢子濃度數據［813］。該方法費時費力，并且需要具有一定真菌分類學基礎的人員對目標病原菌孢子進行區分和識別，在觀察計數的過程中會受到土壤、粉塵顆粒、花粉和其他非靶標病原菌孢子等微粒的影響和干擾，易造成誤判［1416］。實時熒光定量PCR技術可較好地解決上述問題［17］。Cao等［18］利用Zeng等［19］設計的引物和Zheng等［20］開發的realtime"定量PCR"體系，建立了一套用來定量測定病菌孢子捕捉器采集樣本中小麥白粉病菌孢子數量的方法，通過特異性引物擴增小麥白粉病菌孢子的基因組DNA，對小麥白粉病菌孢子的擴增具有特異性，因此可極大提高孢子計數的準確性和讀出效率。本研究在2020年小麥生長季，利用Burkard7d定容式孢子捕捉器，在小麥白粉病不同抗性品種的田間試驗區內，進行空氣中白粉病菌孢子的連續捕捉和監測，采用傳統顯微觀察計數和realtime"PCR方法對孢子捕捉帶上的白粉病菌孢子定量，并分析兩種不同方法測得的孢子數量之間的相關性。在此基礎上，分析基于兩種孢子計數方法的田間孢子動態及其與氣象因子和田間病情的關系，擬合基于不同時段累積孢子濃度的田間病情估計模型，并對基于兩種計數方法建立的田間病情估計模型進行比較。旨在為利用realtime"PCR定量技術聯合孢子捕捉技術監測和預測小麥白粉病奠定基礎。

1"材料與方法

1.1"試驗材料與儀器

供試的不同抗白粉病品種分別為‘保豐104’（高抗品種）、‘石4185’（中感品種）、‘京雙16’（高感品種）。供試菌株為小麥白粉菌混合菌株，由E09、E15、E21、E23（2）和E31等5個當前的優勢小種混合而成。小麥品種和混合菌株均由中國農業科學院植物保護研究所小麥白粉病實驗室提供。

病菌孢子捕捉器為Burkard7d定容式孢子捕捉器（Burkard制造有限公司，英國），運行周期為7"d，吸氣速率為10"L/min，能夠對田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子進行連續監測。氣象數據收集裝置為Dynamet科研級自動氣象站（Dynamax公司，美國），距離試驗地約50"m，數據通過CR1000采集器獲取，包括逐小時的溫度、相對濕度、降水量、太陽輻射、風速和大氣壓強等。用奧林巴斯顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）進行顯微觀察計數。采用QuantStudio"6"Flex實時熒光定量PCR系統（賽默飛世爾科技有限公司，中國）進行realtime"PCR定量測定孢子數量。

1.2"試驗方法

1.2.1"試驗設計及田間病害接種誘發

試驗地位于中國農業科學院植物保護研究所廊坊中試基地（39.5°N，116.6°E）。小麥于2019年10月9日播種，共設置3個不同抗性品種種植區，品種分別為‘京雙16’‘石4185’和‘保豐104’，每個品種種植區面積10"m×50"m=500"m2，按照120"kg/hm2的種植密度進行播種，行距為25"cm。

為確保田間充分發病，于2020年3月18日將提前在溫室中繁殖好的帶有小麥白粉菌混合菌株的盆栽苗，移栽于田間各種植區，每10行移栽1盆。在整個田間試驗期間，各種植區內無其他病蟲害發生，田間除草為人工拔除。

1.2.2"田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的捕捉

4月中旬，于每個品種種植區的中心布設病菌孢子捕捉器各1臺，3臺病菌孢子捕捉器的吸氣口距離地面均為60"cm。每7"d（10：00）更換捕捉器的‘鼓’并獲取‘鼓’上的捕捉帶。

將捕捉帶按先后順序截成7個長為48"mm的小段，每小段相當于1"d的空氣樣本。將48"mm長的捕捉帶置于載玻片上，在顯微鏡400倍視野下識別并計數，統計所有觀察視野下的總孢子量即為每日孢子捕獲量。

在顯微觀察計數后，根據Cao等［18］的方法對田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子數量進行realtime"PCR定量測定，然后轉換成每天每立方米空氣中白粉菌孢子的濃度（C），計算公式為：

C=N×1"00010×60×24，

式中：N代表利用顯微觀察或realtime"PCR方法測得的白粉菌分生孢子日捕獲量；1"000為空氣體積升與立方米之間的單位換算；10為吸氣速率（L/min）;60和24分別表示60"min和24"h。

1.2.3"田間病害調查

每周換‘鼓’的同時，對小麥白粉病的發病情況進行調查。人工接種條件下，田間白粉病均勻發生，調查時以孢子捕捉器為中心均勻取樣，共選取12個調查點，每點調查20莖，分級標準參照改進后的“0～9”級法［21］，計算病情指數（disease"index，"DI）。

DI=0×n0+1×n1+…+9×n99×（n0+n1+…+n9）×100，

式中：n0、n1…n9分別代表不同發病級別的調查莖數。

1.3"數據分析

1.3.1"數據轉換

采用BoxCox變換［22］將孢子計數數據正態化并消除其異方差性。在RStudio（4.2.0）中利用car程序包的powerTransform函數通過獲取λ的最大似然估計來正態化變量Xλ，其中X為孢子計數的原始數據，Xλ為正態化后的孢子計數數據。

1.3.2"氣象數據的處理

日平均氣象數據（10：00至次日10：00）包括日平均空氣溫度（T）、日平均空氣濕度（RH）、日平均太陽輻射率（SR）、日平均氣壓（VPD）、日平均風速（WS）以及日累積降水量（RF），均根據氣象站導出的逐小時數據計算得到。

在此基礎上，計算周平均氣象數據。

1.3.3"不同時段累積孢子濃度統計

“累積孢子濃度（A）”為病害調查日期前所有孢子的累積濃度;“一周前累積孢子濃度（B）”為病害調查當周前累積孢子濃度;“前一周累積孢子濃度（C）”為病害調查當周的前一周內的累積孢子濃度;“當周累積孢子濃度（D）”為病害調查當周內的累積孢子濃度，計算公式為：

A=∑Ni=1Ci;"B=∑N-7i=1Ci;"

C=∑N-7i=N-14Ci;"D=∑Ni=N-7Ci;

式中，以開始運行孢子捕捉器的當日為第1天，病害調查日為第N天，第i天田間空氣中小麥白粉菌分生孢子濃度為Ci;病害調查日的前第7天為N-7，病害調查日的前第14天為N-14。

1.3.4"數據統計分析

田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的日捕獲量（經BoxCox轉換）與氣象變量之間的相關性分析在RStudio中利用基礎函數cor完成，計算Pearson相關性系數并進行統計學檢驗。

基于顯微觀察和realtime"定量PCR兩種方法測定的孢子濃度間的線性相關分析、不同時段累積孢子濃度與田間白粉病病情指數的線性或非線性回歸模型擬合，均利用RStudio中的lm函數或nls函數實現。

模型的比較分析通過RStudio中lme4包的lmer函數和Stats包的anova函數完成。

2"結果與分析

2.1"病情進展曲線

圖1顯示了不同抗性小麥品種試驗區的白粉病病情進展曲線，其中，中感品種和高感品種試驗區內的病害發展情況基本相似，在5月19日左右之前幾乎呈線性增長趨勢，特別是在4月28日至5月5日期間，兩個感病品種的病情指數分別增長了2倍和5倍，5月19日后病情發展逐漸變慢，直到6月9日分別達到79.88和91.33;高抗品種試驗區內白粉病發展較慢，田間病情始終維持在較低水平，最后一次調查時病情指數為19.17。

2.2"田間空氣中白粉菌分生孢子濃度變化

Realtime定量PCR與傳統顯微觀察計數測定的孢子濃度具有相近的變化動態，總體趨勢表現為在生長季隨病情加重孢子濃度逐漸升高然后達到峰值，在生長季結束或即將結束時下降（圖2）。

利用兩種方法測得的中感品種和高抗品種試驗區內的白粉病菌孢子濃度均低于高感品種，但無論是realtime"定量PCR還是常規顯微觀察均在高感品種上于5月3日和5月5日監測到兩個明顯的孢子濃度峰，在中感品種和高抗品種上分別于5月4日和5月21日監測到一個明顯的孢子濃度峰（圖2）。不同抗性品種的3個種植區，利用兩種方法測得的田間空氣中白粉病菌孢子濃度均極顯著線性相關（圖3），R2分別為0.86、0.58和0.86（P≤0.01），數據合并后R2為0.87（P≤0.01）（圖4）。

在空氣中白粉病菌分生孢子濃度較低的情況下，realtime定量PCR測得的孢子濃度大多低于顯微鏡觀察的結果;然而在濃度相對較高的情況下，3個不同抗性品種一致表現為realtime定量PCR法測定的結果高于顯微觀察，尤其當出現孢子濃度峰時（圖2）。

2.3"田間空氣中白粉菌分生孢子濃度與氣象因子的關系

對不同抗性品種，利用realtime定量PCR和傳統顯微觀察兩種方法測得的孢子濃度與氣象因子的相關性分析結果均一致，與日平均溫度不存在明顯的線性相關;與日平均大氣壓強負相關，且在高抗品種上顯著負相關;與日平均太陽輻射和日平均風速負相關，且在高感品種和中感品種上顯著負相關;與日平均空氣相對濕度顯著正相關;但與日降水量無顯著相關性（表1，圖5）。

2.4"基于田間孢子濃度的白粉病病情估計模型

利用不同抗性品種不同時段，基于realtime定量PCR和顯微觀察兩種方法測得的累積孢子濃度分別與田間病情實際調查結果擬合線性回歸方程，發現兩種方法得到的累積孢子濃度與病情之間的關系結果一致，表現為：3個品種病害調查日期前孢子的累積濃度和調查當周前累積孢子濃度與病情均存在極顯著的線性關系;病情調查當周內孢子的累積濃度和病情調查當周的前一周內孢子的累積濃度與病情均不存在顯著的線性關系（表2，表3）。

進一步分析結果表明，利用兩種方法建立的基于病害調查日期前孢子累積濃度的病情估計模型，截距均無顯著性差異（Pgt;0.05），斜率大多無顯著性差異;而基于病害調查當周前累積孢子濃度建立的病情估計模型，斜率和截距均無顯著性差異（Pgt;0.05）（表4）。

3"結論與討論

Realtime定量PCR方法應用于病菌孢子捕捉器的孢子計數已有研究報道，該方法最大特點是對靶標病原菌的特異性強，克服了傳統顯微觀察計數法中形態相似或相近孢子難以區分的缺陷，不僅能夠準確定量空氣中靶標病原菌孢子的濃度，而且較傳統顯微觀察計數法節省時間，極大地提高了工作效率［2328］。Cao等［18］利用realtime定量PCR連續3年測定了高感品種‘京雙16’田間空氣中白粉病菌分生孢子的濃度，發現與顯微觀察計數法測定的孢子濃度顯著相關。本研究得到了與前人一致的結果，并在小麥不同抗性品種上得到了進一步的驗證。不同抗性品種上，雖然白粉病菌分生孢子捕獲的絕對數量存在一定差異，但realtime定量PCR能準確地反映各品種上孢子濃度的動態變化趨勢，且均與傳統顯微觀察所測結果極顯著線性相關。

本研究還發現，當孢子濃度監測結果相對較高時，realtime定量PCR測得的孢子量往往高于顯微觀察;當監測的孢子濃度相對較低時，則相反。導致這種差異的原因較為復雜［18］，如孢子捕捉帶未洗脫充分、或在DNA提取的收集上清步驟中存在損耗等。

本研究利用realtime定量PCR測定的不同抗性品種不同時段田間空氣中小麥白粉病菌累積孢子濃度，建立了白粉病的病情估計模型，具有一定可行性，且與利用傳統顯微觀察法建立的病情估計模型無顯著性差異，提供了一種除顯微觀察外獲取建模數據的備選或可替代方法。當然，目前使用的顯微觀察計數仍將是試驗條件有限的基層農技推廣部門的首選;但隨著realtime定量PCR檢測技術的普及和推廣，該技術也將得到廣泛應用，從而進一步推動病菌孢子捕捉技術在小麥白粉病監測預測上的應用。

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