不同食物對異色瓢蟲蛹體及鞘翅顏色的影響

秦亞龍，"孫元星，"劉長仲，"李明凌，"郝亞楠

摘要

本研究旨在探究食物（人工飼料、豌豆蚜）對異色瓢蟲黑化突變體與野生型蛹和成蟲的黑化程度及鞘翅中類胡蘿卜素含量的影響，并分析兩個表型對食物變化的響應(yīng)差異。結(jié)果表明：食物種類對黑化突變體蛹背部黑斑數(shù)目無影響，但取食人工飼料時蛹表皮的黑化程度更高;野生型蛹背部黑斑數(shù)目及黑化程度均是人工飼料處理顯著高于豌豆蚜處理。對雌成蟲，取食人工飼料會顯著增加黑化突變體與野生型鞘翅黑斑數(shù)目及黑化程度;對雄成蟲，食物類型對黑化突變體與野生型鞘翅黑斑數(shù)目也有顯著影響，但不影響突變體的黑化程度。黑化突變體與野生型雌雄成蟲取食人工飼料后，鞘翅中類胡蘿卜素含量均低于取食豌豆蚜的處理;在取食豌豆蚜的處理中，黑化突變體雌蟲鞘翅中類胡蘿卜素含量顯著高于野生型。上述結(jié)果表明，黑化突變體自身及其響應(yīng)食物變化引起的色素沉積規(guī)律較野生型有較大差異，研究結(jié)果為進一步探究異色瓢蟲的色素沉積規(guī)律奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

異色瓢蟲;"黑化型;"黑色斑點數(shù)目;"黑化面積;"類胡蘿卜素

中圖分類號：

S"476.2

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023079

Effects"of"different"foods"on"the"color"of"pupa"and"elytra"of"Harmonia"axyridis

QIN"Yalong，"SUN"Yuanxing，"LIU"Changzhong，"LI"Mingling，"HAO"Yanan*

（College"of"Plant"Protection，"Gansu"Agricultural"University，"Gansu"Biocontrol"Engineering"Laboratory"

of"Crop"Diseases"and"Pests，"Lanzhou"730070，"China）

Abstract

The"purpose"of"this"study"was"to"explore"the"effects"of"two"different"foods"（artificial"diet"and"pea"aphid）"on"the"melanization"levels"of"pupae"and"adults"in"the"melanistic"mutant"and"the"wild"type"of"Harmonia"axyridis."In"addition，"we"sought"to"clarify"the"differences"between"these"two"phenotypes."The"content"of"carotenoid"in"the"elytra"was"also"measured."The"results"showed"that"the"melanistic"mutant，"feeding"on"either"artificial"diet"or"pea"aphid，"exhibited"a"similar"number"of"black"spots"on"the"back"of"pupae，"but"the"total"melanization"level"was"higher"in"the"artificial"diet"treatment."In"contrast，"the"wild"type"showed"significantly"more"black"spots"and"a"higher"melanization"level"in"response"to"the"artificial"diet"compared"to"the"pea"aphid"treatment."In"female"adults，"feeding"on"an"artificial"diet"significantly"increased"the"number"of"elytra"black"spots"and"the"total"melanization"level"in"both"the"melanistic"mutant"and"wild"type."In"males，"food"types"also"significantly"affected"the"number"of"elytra"black"spots"but"didn’t"affect"the"total"melanization"level"of"mutant"type."As"for"carotenoid"contents"in"the"elytra，"its"in"both"the"melanistic"mutant"and"wild"type"fed"with"an"artificial"diet"were"significantly"lower"than"those"feeding"on"pea"aphid."When"fed"with"pea"aphids，"the"carotenoid"content"in"female"melanistic"mutant"was"significantly"higher"than"that"in"the"wild"type."These"results"indicated"that"melanistic"mutant"had"a"different"pigmentation"response"to"changes"in"diet"compared"to"the"wild"type，"laying"a"solid"foundation"for"further"elucidating"the"pigmentation"mechanisms"in"H.axyridis.

Key"words

Harmonia"axyridis;"melanistic"type;"number"of"black"spots;"black"area;"carotenoid

昆蟲絢麗多彩的體色與其覓食、躲避天敵、求偶和交配生殖等行為密切相關(guān)［13］。黑色素與類胡蘿卜素是形成昆蟲體色最為廣泛的兩類物質(zhì)。其中，黑色素可以通過前體物質(zhì)多巴（dopa）和多巴胺（dopamine）自身合成，且這2種前體物質(zhì)還與昆蟲免疫、表皮硬化等生理過程有著密切聯(lián)系［4］。類胡蘿卜素形成的黃色或紅色體色往往發(fā)揮擬態(tài)、警戒色與保護色等功能［5］，但不能自我從頭合成，需要從食物中獲得這類物質(zhì)或其前體［6］。

昆蟲黑色素合成過程所需氮素的最重要來源是食物［7］，因此食物成分對昆蟲體色黑化程度具有重要影響。目前，關(guān)于人工飼料中食物組分對一些昆蟲體色的影響已有研究。例如，Lee等［8］在對海灰翅夜蛾Spodoptera"littoralis的研究中發(fā)現(xiàn)，酪蛋白半人工飼料飼喂的幼蟲比玉米蛋白半人工飼料飼喂的幼蟲具有更加明顯的黑化角質(zhì)層;Lindstedt等［9］發(fā)現(xiàn)飼料中蛋白質(zhì)含量對Arctia"plantaginis體色形成和生長發(fā)育具有明顯影響。其幼蟲取食高質(zhì)量蛋白質(zhì)飼料后，雄性成蟲前翅中會產(chǎn)生更多的黑色素。此外，人工飼料在一些天敵昆蟲的室內(nèi)繁育中也發(fā)揮著重要作用，能顯著降低生產(chǎn)成本。因此，分析比較人工飼料對體色的影響對全面評價天敵品質(zhì)具有重要意義。

異色瓢蟲廣泛分布于世界各地，對蚜蟲、螨類、蚧殼蟲等重要害蟲具有很強的捕食能力［10］，在害蟲生物防治中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［11］。其鞘翅由紅（黃）色（由類胡蘿卜素沉積形成）與黑色（由黑色素沉積形成）形成豐富的斑型變化［4］。黃底型是異色瓢蟲較常見斑型，其蛹和鞘翅顏色較為相似，具有黃色或者橘色的底色并鑲嵌有0～19個大小不一的黑斑［1213］。同時，研究表明，種群中的色斑型通常受到環(huán)境因子的影響，在不同季節(jié)具有高度多態(tài)性［14］，且會隨飼養(yǎng)溫度的變化而發(fā)生變化［15］。異色瓢蟲蛹和成蟲所表現(xiàn)出的斑型多態(tài)性是其適應(yīng)環(huán)境變化的一種重要策略［14，16］。前期研究表明，異色瓢蟲幼蟲喜食富含蛋白質(zhì)的食物［17］，但食物因素在其蛹與成蟲體色形成中的作用尚不明確。

黑化是生物體體色發(fā)生變異最為顯著的現(xiàn)象，廣泛發(fā)生于昆蟲中［1，18］。許多昆蟲的黑化突變體具有與野生型明顯不同的體色形成機制。例如，地中海實蠅Ceratitis"capitata蛹黑化突變品系體內(nèi)多巴胺含量高于正常品系，而β丙氨酸的含量比正常品系低，由于沒有充足的β丙氨酸和多巴胺結(jié)合，使得黑化品系中多巴胺的含量明顯高于正常品系［19］。本實驗室前期在異色瓢蟲室內(nèi)種群中發(fā)現(xiàn)了一個穩(wěn)定遺傳的黑化品系，遵循孟德爾單基因隱性遺傳規(guī)律;其各發(fā)育階段的體色較野生型明顯黑化，且鞘翅黑斑數(shù)較多（圖1）［20］。前期研究表明，異色瓢蟲黑化程度高的個體在低溫下的活動力增強，并能通過吸收紫外線輔助殺滅一些侵染的共生細菌［17，21］;同時，黑化突變體取食人工飼料后的成蟲羽化成功率顯著高于野生型，表現(xiàn)出一定的適合度優(yōu)勢［20］。因此，該突變體在生物防治中可能存在一定應(yīng)用潛力。黑化突變體自身黑化程度明顯高于野生型，那么其體色及斑型特征對食物差異的響應(yīng)與野生型相比有什么不同呢？本研究通過人工飼料與豌豆蚜2種食物飼喂黑化突變體，測定其蛹與成蟲的黑化程度差異，并與野生型進行比較，明確食物對其黑化的影響規(guī)律及在兩種表型間的差異。同時，比較成蟲鞘翅類胡蘿卜素含量的差異，以進一步明確食物對其鞘翅斑型的影響規(guī)律。

1"材料與方法

1.1"供試蟲源

本試驗所用異色瓢蟲為黃底型種群succinea。其中，黑化突變體為長期飼養(yǎng)于室內(nèi)的種群，而野生型于2021年5月采自蘭州市安寧區(qū)黃河北岸（103.70°"E，36.08°N）的黃刺玫上，并在實驗室長期飼養(yǎng)。2種表型異色瓢蟲均用綠色型豌豆蚜Acyrthosiphon"pisum飼養(yǎng)于直徑為9"cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，溫度（25±1）℃，濕度"60%～65%，光周期"L∥D=14"h∥10"h。豌豆蚜飼養(yǎng)于蠶豆幼苗上，置于溫度（22±1）℃，濕度60%～65%，光周期"L∥D=14"h∥10"h的人工氣候箱內(nèi)長期培養(yǎng)。

1.2"人工飼料配制

提前配制固體人工飼料，灌裝在2"mL離心管中并于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩ｏ暳现饕煞旨昂繀⒄諏O元星等［22］與Sun等［23］所述配方，具體見表1。

1.3"幼蟲飼養(yǎng)

將30～40頭黑化突變體和野生型異色瓢蟲1齡幼蟲，分別用豌豆蚜與人工飼料單頭飼養(yǎng)在直徑為3"cm的培養(yǎng)皿中。在豌豆蚜飼喂處理中，每天供給足夠蚜蟲并清理培養(yǎng)皿;在人工飼料飼養(yǎng)處理中，將人工飼料添加至硫酸紙上（邊長0.5"cm），培養(yǎng)皿中放入浸濕蒸餾水的棉球進行保濕，每2"d更換1次人工飼料，并及時更換培養(yǎng)皿。上述幼蟲均飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi)，溫度（25±1）℃，濕度"60%～65%，光周期L∥D=14"h∥10"h，直至腹部固定形成預(yù)蛹。

1.4"樣品收集與拍照

自預(yù)蛹期開始監(jiān)測化蛹情況，準確記錄化蛹時間，在化蛹后24"h左右使用松下DMCGH4數(shù)碼相機（快門速度：1/250;光圈：F4.0;ISO：320;白平衡：色溫3"000"K;對焦模式：手動對焦）對蛹背部進行拍照。拍照結(jié)束后，將蛹置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至羽化。收集羽化后24"h左右的成蟲，單頭裝入1.5"mL離心管中，經(jīng)液氮處理后保存于-80℃冰箱中。樣品收集完成后，在冰上用鑷子輕輕將完整鞘翅取下分裝于2個不同的離心管中，其中左鞘翅用于拍照，右鞘翅用于類胡蘿卜素濃度測定。所有拍照均在相同溫度及光照條件下完成，將所得照片導(dǎo)入圖像處理軟件Image"J，統(tǒng)計黑色斑點數(shù)目并根據(jù)黑色斑點面積所占像素比例，評價黑化程度，每個處理收集并拍照15～20頭樣品。

黑化程度=（蛹或鞘翅上黑斑面積所占像素/蛹或鞘翅面積所占像素）×100%。

1.5"鞘翅中類胡蘿卜素含量測定

使用百萬分之一天平（Sartorius"MSA"3.6P000DM，"Gottingen，"Germany）稱取β胡蘿卜素標準品（上海源葉生物，純度98%以上）100"μg，加入1"mL無水乙醇，制成100"μg/mL"的母液，隨后逐級稀釋成50、25、10、5、1"μg/mL與0.1"μg/mL"的溶液，在475"nm波長處測定其吸光度并制成標準曲線（圖2）。

將3只鞘翅放入一個離心管內(nèi)，作為1個重復(fù)，每處理至少設(shè)置4個重復(fù)。對鞘翅進行稱重（精確至0.001"mg）后在每個離心管中加入0.5"mL氯仿，并放入超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）中超聲30"min，隨后將離心管放置在冰上轉(zhuǎn)移至通風(fēng)避光處提取12"h。類胡蘿卜素提取完成后，將離心管放入真空離心濃縮儀（Hitachi"Koki，"Japan）內(nèi)將提取溶劑完全揮發(fā)，隨后加入0.5"mL的無水乙醇，置于超聲清洗器內(nèi)超聲5"min充分溶解提取的類胡蘿卜素。將類胡蘿卜素溶液放入高速冷凍離心機（ScanSpeed"40，"Scanvac，"Ballerup，"Germany）內(nèi)12"000"r/min離心5"min，吸取上清液0.2"mL移至96孔酶標板內(nèi)，使用全波長酶標儀（BioStack"ready，"USA）在475"nm處測定其吸光度，使用無水乙醇作為對照。根據(jù)β胡蘿卜素的標準曲線計算各樣品中類胡蘿卜素含量。

1.6"數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS"26.0軟件進行分析，蛹和鞘翅黑斑數(shù)目、黑化程度、鞘翅類胡蘿卜素含量均先進行方差同質(zhì)性檢驗，然后采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性比較（α=0.05），并使用Excel作圖。

2"結(jié)果與分析

2.1"蛹期黑化分析

黑化突變體取食人工飼料與豌豆蚜后，其蛹背部黑斑數(shù)目無顯著差異（t=1.964，df=9，P=0.081）;野生型取食兩種不同食物后，人工飼料處理中的黑斑數(shù)（11.7個）顯著多于豌豆蚜處理（9.7個）（t=5.407，df=37，P=0.008）。當(dāng)取食人工飼料時，2種表型的黑斑數(shù)無顯著差異（t=2.396，df=31，P"=0.053）;而二者取食豌豆蚜?xí)r，黑化突變體蛹背部的黑斑數(shù)（11.4個）顯著高于野生型（9.7個）（t=2.975，df=15，P=0.009）（圖3）。

黑化突變體取食人工飼料后，其蛹背部的黑化程度（54.32%）顯著高于取食豌豆蚜的處理（38.89%）（t=4.738，df=54，Plt;0.000"1）;野生型取食人工飼料后蛹背部的黑化程度（25.34%）也顯著高于豌豆蚜的處理（18.86%）（t=6.133，df=59，Plt;0.000"1）。無論取食人工飼料還是豌豆蚜，黑化突變體蛹背部的黑化程度均顯著高于野生型（人工飼料：t=18.071，df=66，Plt;0.000"1;豌豆蚜：t=7.649，df=11，Plt;0.000"1）（圖4）。

2.2"成蟲鞘翅黑化分析

對雌成蟲來說，黑化突變體取食人工飼料后鞘翅黑斑數(shù)目（19.0個）顯著高于取食豌豆蚜（18.4個）（t=5.555，df=18，Plt;0.000"1）;在野生型中，取食人工飼料鞘翅黑斑數(shù)目（19.0個）顯著高于取食豌豆蚜（1.4個）（t=42.282，df=12，Plt;0.000"1）。當(dāng)取食人工飼料時，2種表型間的鞘翅黑斑數(shù)無顯著差異（t=2.396，df=36，P=0.053）;取食豌豆蚜?xí)r，黑化突變體的黑斑數(shù)顯著高于野生型（t=39.328，df=14，Plt;0.000"1）（圖5a）。

對雄成蟲來說，黑化突變體取食人工飼料時，其鞘翅黑斑數(shù)目（19.0個）顯著高于取食豌豆蚜（18.3個）（t=5.745，df=11，Plt;0.000"1）;野生型取食人工飼料時，其鞘翅黑斑數(shù)目（16.3個）顯著高于取食豌豆蚜（2.9個）（t=18.925，df=23，Plt;0.000"1）。當(dāng)取食人工飼料或豌豆蚜?xí)r，黑化突變體鞘翅黑斑數(shù)目均顯著高于野生型（人工飼料：t=4.281，df=11，P=0.001;豌豆蚜：t=36.064，df=14，Plt;0.000"1）（圖5b）。

對雌成蟲，黑化突變體取食人工飼料時的鞘翅黑化程度（48.79%）顯著高于取食豌豆蚜的處理（36.73%）（t=7.143，df=37，Plt;0.000"1）;野生型取食人工飼料時的鞘翅黑化程度（31.54%）也顯著高于取食豌豆蚜的處理（25.78%）（t=4.286，df=46，Plt;0.000"1）。無論取食人工飼料還是豌豆蚜，黑化突變體的鞘翅黑化程度均顯著高于野生型（人工飼料：t=16.720，df=62，Plt;0.000"1;豌豆蚜：t=7.399，df=27，Plt;0.000"1）（圖6a）。

對雄成蟲，黑化突變體取食兩種食物后的鞘翅黑化程度無顯著差異（t=-0.122，df=30，P=0.903）;野生型取食人工飼料時的鞘翅黑化程度（15.79%）顯著高于取食豌豆蚜的處理（1.73%）（t=11.226，df=33，Plt;0.000"1）。無論取食人工飼料還是豌豆蚜，黑化突變體的鞘翅黑化程度均顯著高于野生型（人工飼料：t=22.602，df=23，Plt;0.000"1;豌豆蚜：t=43.699，df=8，Plt;0.000"1）（圖6b）。

2.3"成蟲鞘翅類胡蘿卜素含量

對雌成蟲，黑化突變體取食人工飼料時鞘翅中類胡蘿卜素含量（0.23"μg/mg）顯著低于取食豌豆蚜的處理（5.28"μg/mg）（t=-20.919，df=6，Plt;0.000"1）;野生型取食人工飼料時鞘翅中類胡蘿卜素含量（0.23"μg/mg）顯著低于取食豌豆蚜的處理（4.60"μg/mg）（t=-21.871，df=6，Plt;0.000"1）。當(dāng)取食人工飼料時，2種表型的鞘翅中類胡蘿卜素含量無顯著差異（t=0.052，df=4，P=0.961）;但取食豌豆蚜?xí)r，黑化突變體的鞘翅中類胡蘿卜素濃度顯著高于野生型（t=2.956，df=8，P=0.018）（圖7a）。

對雄成蟲，黑化突變體取食人工飼料時的鞘翅中類胡蘿卜素含量（0.19"μg/mg）顯著低于取食豌豆蚜的處理（5.04"μg/mg）（t=-11.603，df=6，Plt;0.000"1）;野生型取食人工飼料時鞘翅中類胡蘿卜素含量（0.17"μg/mg）顯著低于取食豌豆蚜的處理（4.64"μg/mg）（t=-12.798，df=6，Plt;0.000"1）。無論取食人工飼料還是豌豆蚜，2種表型的鞘翅中類胡蘿卜素含量均無顯著差異（人工飼料："t=0.329，df=4，P=0.759;豌豆蚜："t=0.980，df=8，P=0.356）（圖7b）。

3"結(jié)論與討論

異色瓢蟲黑化突變體與野生型取食人工飼料后的蛹體及雌成蟲鞘翅黑化程度均顯著升高。昆蟲表皮黑化的產(chǎn)生首先強烈依賴于從食物中所攝取的蛋白質(zhì)的量［8，24］。此外，食物中的其他非主要營養(yǎng)成分也可能會對昆蟲的體色造成重要影響。例如，李瑾潔［25］發(fā)現(xiàn)天然食物中的葉綠素含量及含水量對斜紋夜蛾Spodoptera"litura幼蟲體色具有顯著影響。本研究中飼喂人工飼料引起的黑化程度升高可能受食物中蛋白含量及其他因子的影響，需要通過進一步生理測定來明確。黑化程度升高對提升異色瓢蟲在低溫下的適合度具有重要意義，其通過黑斑吸收太陽輻射能增強活力并能輔助殺死一些共生細菌［17，21］。本研究結(jié)果表明，利用人工飼料飼養(yǎng)異色瓢蟲對于提高其在某些環(huán)境中的適應(yīng)能力可能具有重要意義。此外，前期研究表明，黑化突變體取食該人工飼料后成蟲羽化率顯著高于野生型［22］，因此黑化突變體表現(xiàn)出對人工飼料的良好適應(yīng)能力。

本研究還發(fā)現(xiàn)黑化突變體與野生型對不同食物具有不同的響應(yīng)特點。黑化突變體取食兩種食物后蛹背部黑色斑點數(shù)目無變化，而野生型取食人工飼料后的黑斑數(shù)目顯著高于取食豌豆蚜的處理;黑化突變體雄蟲取食兩種食物后的鞘翅黑化程度無顯著差異，而野生型雄蟲取食人工飼料后的黑化程度顯著升高。由表型觀察發(fā)現(xiàn)黑化突變體的蛹及鞘翅較野生型具有不同的黑斑特征，表明二者的黑化機制可能存在差異，由此說明食物對具有不同黑化代謝機制個體的影響不同。已有研究表明，天冬氨酸β丙氨酸NBAD（aspartateβalanineNβalanyldopamine）途徑在異色瓢蟲蛹期能夠調(diào)控黑斑大小和數(shù)量。其中，HaADC是該調(diào)節(jié)途徑中的關(guān)鍵酶，其表達量的下調(diào)會引起黑斑數(shù)目增加和黑化程度增強［14］。在后續(xù)研究中，需進一步測定相關(guān)基因的表達量差異以明確食物對兩種表型個體黑化的差異影響機制。

此外，黑化突變體與野生型取食兩種食物后的鞘翅中類胡蘿卜素含量也具有明顯差異。取食人工飼料后，二者鞘翅中類胡蘿卜素含量均顯著低于取食豌豆蚜的處理。蚜蟲體內(nèi)含有多種類胡蘿卜素［26］，被異色瓢蟲取食經(jīng)體內(nèi)代謝后在鞘翅中沉積，而本研究所用人工飼料中的類胡蘿卜素含量可能較低。黑化突變體雌蟲取食豌豆蚜后鞘翅中類胡蘿卜素含量顯著高于野生型，而取食人工飼料后類胡蘿卜素含量在兩個表型間無顯著差異，表明兩個表型異色瓢蟲雌蟲對食物中類胡蘿卜素的攝取及利用機制可能存在差異。異色瓢蟲鞘翅由黑斑（黑色素）與黃底（類胡蘿卜素）鑲嵌組合形成，Alexander等［12］研究發(fā)現(xiàn)其鞘翅有限區(qū)域中顯示較大的黑色素區(qū)域，則類胡蘿卜素區(qū)域?qū)⒖s小。因此，鞘翅類胡蘿卜素的沉積可能與黑化間存在一定關(guān)聯(lián)。Li等［27］發(fā)現(xiàn)異色瓢蟲鞘翅中具有近30種類胡蘿卜素，那么2種表型取食不同食物后的具體類胡蘿卜素種類及其含量變化與差異分析需要通過進一步測定進行明確。

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