苯醚甲環唑拌種對小麥根際微生物群落的影響

摘要

小麥莖基腐病是我國北方小麥主產區的重大病害，對小麥安全生產造成嚴重威脅。化學農藥的使用是最直接有效的防治方法，在植物病害防治中發揮重要作用。苯醚甲環唑是一種具有較高安全性的三唑類殺菌劑。本課題前期明確了苯醚甲環唑拌種對小麥莖基腐病有一定的防治效果，且促生增產，但其對小麥根際微生物的影響尚不清楚。本文研究了苯醚甲環唑拌種對莖基腐病田中小麥根際土壤微生物的影響，結果表明，苯醚甲環唑拌種處理對小麥分蘗期，拔節期和灌漿期根際微生物的alpha和beta多樣性均無顯著影響，但使分蘗期鐮孢屬的相對豐度顯著降低。微生物共現網絡分析表明，苯醚甲環唑拌種處理提高了細菌網絡的復雜性，降低了真菌網絡復雜性，使植株根際微生物網絡更接近健康植株根際的特征。該研究從根際微生物的角度為苯醚甲環唑防治小麥莖基腐病的機制研究及對土壤微生物的安全性評價提供理論依據。

關鍵詞

小麥莖基腐病;"苯醚甲環唑;"根際微生物;"鐮孢屬;"共現網絡

中圖分類號：

S"476.9

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023132

Effect"of"seedcoating"with"difenoconazole"on"microorganisms"in"the"wheat"rhizosphere

FENG"Chaohong，"LI"Lijuan，"ZHANG"Jiaojiao，"WANG"Junmei，"LI"Yahong，"LIU"Lulu，"HAN"Zihang，SHI"Ruijie，"WAN"Xinru，"XU"Fei*，"SONG"Yuli

（Institute"of"Plant"Protection，"Henan"Academy"of"Agricultural"Sciences;"Key"Laboratory"of"Crop"Integrated"Pest"Management"

in"the"Southern"Region"of"North"China，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Zhengzhou"450002，"China）

Abstract

Fusarium"crown"rot"of"wheat"（FCR）"is"an"important"disease"threatening"wheat"production"in"major"areas"of"North"China."Chemical"control"is"usually"the"most"direct"and"effective"method，"playing"an"important"role"in"controlling"plantnbsp;diseases."Difenoconazole，"a"triazole"fungicide"known"for"its"high"safety，"has"been"previously"used"to"control"FCR"by"seedcoating，"and"has"achieved"a"certain"effect，"it"also"can"promote"wheat"growth"and"production，"but"its"impact"on"wheat"rhizosphere"microorganisms"is"still"unknown."This"study"explored"its"effect"on"rhizosphere"microbes"in"FCRinfected"fields."The"results"revealed"no"significant"impact"on"alpha"and"beta"diversity"of"rhizosphere"microbes"at"tillering，"jointing"and"filling"stages"of"wheat."However，"it"significantly"reduced"the"relative"abundance"of"the"genus"Fusarium"at"the"tillering"stage."Analysis"of"microbial"cooccurrence"networks"indicated"that"seedcoating"with"difenoconazole"improved"the"complexity"of"the"bacterial"network"and"reduced"the"complexity"of"fungal"network，"thus"making"the"microbial"network"more"closer"to"the"rhizosphere"characteristics"of"healthy"plants."This"study"contributes"to"the"theoretical"understanding"of"difenoconazole’s"mechanism"in"controlling"FCR"from"the"perspective"of"rhizosphere"microorganisms"and"provides"valuable"insights"for"safety"evaluation"of"soil"microbes.

Key"words

Fusarium"crown"rot"of"wheat;"difenoconazole;"rhizosphere"microorganisms;"Fusarium;"cooccurrence"network

小麥莖基腐病在我國北方小麥主產區普遍發生，呈現不斷加重和蔓延趨勢，嚴重地塊造成產量損失達38.0%～63.1%，對小麥安全生產造成嚴重威脅［1］。據報道，在我國北方小麥主產區引起小麥莖基腐病的病原菌種類有假禾谷鐮刀菌Fusarium"pseudograminearum、禾谷鐮刀菌F.graminearum和黃色鐮刀菌F.culmorum，其中假禾谷鐮刀菌為優勢種群［2］。

使用化學農藥是最直接有效的防治方法，在植物病害防治中發揮了重要作用。苯醚甲環唑是一種三唑類殺菌劑，屬于甾醇脫甲基化抑制劑，具有高效、廣譜、低毒、用量低和安全性高等特點，主要用于果樹、蔬菜、小麥、馬鈴薯、豆類、瓜類等作物，對多種真菌性病害具有很好的保護和治療作用［3］。本課題組前期研究表明，苯醚甲環唑拌種對成株期小麥莖基腐病有一定的防治效果［4］，其中2019年溫縣和2020年內黃用30"g/L苯醚甲環唑懸浮種衣劑（FSC）拌種可以顯著降低小麥灌漿期的病情指數，防效分別為70.3%和28.3%，對小麥增產率分別為10.7%和9.9%。但苯醚甲環唑對小麥根際土壤微生物的影響尚不清楚。土壤微生態環境是農田養分供應和土壤健康的重要保障，對土壤微生態環境的研究目前主要包括土壤酶活性分析、土壤微生物量及根際區域微生物結構和多樣性等方面［5］。根際微生物組被稱為植物的第二基因組，對植物的生長、健康和適應性至關重要［6］。因此本文通過研究苯醚甲環唑拌種對莖基腐病田中小麥根際土壤微生物的影響，旨在為苯醚甲環唑防治小麥莖基腐病的機制研究及對土壤微生物的安全性評價提供理論依據。

1"材料與方法

1.1"田間試驗設計

試驗于2019年在河南省焦作市武德鎮溫縣徐堡村（35°01′"N，113°05′"E，海拔105.6"m）進行，小麥品種為‘矮抗58’，該品種在成株期對小麥莖基腐病表現感?。?］。30"g/L苯醚甲環唑FSC購自瑞士先正達作物保護有限公司，按照300"g/100"kg種子的劑量進行拌種，作為處理組，以不進行拌種的‘矮抗58’作為對照。按照10～12.5"kg/667"m2的播量進行播種。

1.2"接種物的培養和接種

供試接種物為強致病力假禾谷鐮刀菌菌株G14LY242，分離自河南省洛陽市小麥莖基腐病病莖，其菌絲塊在滅過菌的麥粒上培養3周后晾干備用［4］。田間接種時，將小麥種子和麥粒接種物按照質量比1∶1均勻混合后播種。

1.3"田間根際土壤采樣

在小麥分蘗期（Feekes"3，2019年3月1日）、

拔節期（Feekes"7，2019年4月11日）和

灌漿期（Feekes"11，2019年5月23日）進行采樣。戴上無菌手套將‘矮抗58’植株連根拔出，每處理3個點，每點取30株苗。試驗共設6個處理，分別標記為Dif.3（Feekes"3時期苯醚甲環唑拌種處理）、Con.3（Feekes"3時期對照）、Dif.7（Feekes"7時期苯醚甲環唑拌種處理）、Con.7（Feekes"7時期對照）、Dif.11（Feekes"11時期苯醚甲環唑拌種處理）、Con.11（Feekes"11時期對照）。抖除根系周圍的疏松土壤，使用無菌棉簽收集附著在根表面的根際薄層土壤，轉移到2"mL無菌離心管中，并在-70℃下保存［8］。送上海歐易生物醫學科技有限公司進行測序。

1.4"小麥根際微生物檢測

采用DNA"抽提試劑盒（MagPure"Soil"DNA"LQ"Kit，Magen，"廣東）提取樣本的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測DNA"的質量和濃度。以基因組DNA為模板，根據真菌和細菌測序區域，使用帶barcode的特異引物，TaKaRa公司的Tks"Gflex"DNA"Polymerase進行PCR，確保擴增效率和準確性。細菌多樣性鑒定對應區域：16S"rDNA"V3V4"區（引物343F和798R［9］）。真菌多樣性鑒定對應區域：ITS（引物"ITS1F"和"ITS2R［10］）。PCR"產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用磁珠純化，以純化產物作為二輪"PCR"模板，獲得的產物

檢測后使用磁珠純化，然后使用Qubit熒光定量儀定量。根據"PCR"產物濃度進行等量混樣，并上機測序。原始數據為FASTQ格式。數據下機后，首先使用cutadapt軟件，剪切掉raw"data序列上的引物序列，然后使用DADA2，將合格的雙端raw"data按照QIIME"2默認參數進行質量過濾，降噪，拼接及去嵌合體等質控分析，得到代表序列及"ASV（amplicon"sequence"variant）豐度表格。使用QIIME"2軟件包挑選出各個ASV的代表序列后，將所有代表序列與數據庫進行比對注釋。16S"rDNA使用Silva（version138）數據庫比對，ITS使用Unite數據庫比對。物種比對注釋使用q2featureclassifier軟件默認參數進行分析。

1.5"數據統計

對每個樣本進行隨機抽樣，統計對應的ASV數量，即觀測到的物種（observed"species）數量，將每次抽樣得到的observed"species指標與測序深度（抽樣序列數量）作圖，形成alpha多樣性指標稀釋曲線。用單因素方差分析和Duncan’s"新復極差法（α=0.05）對alpha多樣性指數進行統計分析。

用ADONIS方法分析Beta多樣性，并進行PCoA可視化，其中細菌采用BrayCurtis距離算法，真菌采用BinaryJaccard算法。將每個時期的處理（Dif）與對照（Con）進行LEfSe"（LDA"effect"size）分析，細菌和真菌的LDA"（Linear"discriminant"analysis）均設定為大于3，

得到的屬水平的生物標志物按照相對豐度從高到低排序，進行熱圖可視化分析。

用Pearson相關性分析對鐮孢屬Fusarium相對豐度、小麥莖基腐病病莖率、白穗率和病情指數間進行兩兩相關性分析。用細菌和真菌ASV絕對豐度表對每個處理（共3個時期）進行微生物共現網絡分析，具體分析方法為：采用R包ggClusterNet［11］（https：∥github.com/taowenmicro/ggCluster_decument），選取絕對豐度為前1"500的細菌ASV，絕對豐度為前500的真菌ASV，進行Spearman相關性分析，設置|r|gt;0.9，Plt;0.05，使用model"maptree"2繪制微生物網絡。

2"結果與分析

2.1"小麥根際微生物多樣性和群落結構分析

如圖1a和b所示，各組物種稀釋曲線較為平緩，說明測序深度已覆蓋大部分物種，數據量充分反映了每個樣本的物種多樣性。圖1c和d分別為細菌和真菌的Shannon指數，兩個處理中細菌Shannon指數在小麥分蘗期（Feekes"3）、拔節期（Feekes"7）和灌漿期（Feekes"11）均逐漸升高，苯醚甲環唑拌種處理的平均Shannon指數分別為8.28、8.94和9.68，"兩兩之間差異顯著（Plt;0.05）;對照處理分別為8.33、9.05和9.68，其中在Feekes"3和Feekes"7之間差異顯著，在Feekes"7和Feekes"11之間差異不顯著。苯醚甲環唑拌種處理在各個時期與對照均無顯著性差異。苯醚甲環唑拌種處理小麥根際真菌平均Shannon指數在3個時期中分別為4.94、5.30和4.48，三者之間無顯著性差異;對照處理的平均Shannon指數分別為4.98、5.30和4.03，其中在Feekes"3和Feekes"7之間差異不顯著，而在Feekes"7和Feekes"11之間差異顯著。在各個時期下處理與對照間真菌Shannon指數均無顯著性差異。此外，Simpson、Chao1和ACE等指數結果與之類似，說明苯醚甲環唑拌種處理對小麥根際土壤細菌和真菌的alpha多樣性均無顯著影響。

PCoA分析結果表明（圖1e，f），不同生長時期對微生物的beta多樣性影響要大于拌種處理的影響。各個時期下處理與對照樣品的細菌和真菌群落均相似且聚類，而3個時期樣品彼此分離，說明苯醚甲環唑拌種處理對小麥根際細菌和真菌的beta多樣性無顯著影響。其中細菌PC1和PC2對數據方差的解釋比例分別為39.98%和16.48%，真菌PC1和PC2對數據方差的解釋比例分別為13.13%和10.09%。

所有樣品中細菌群體共鑒定出33個門，76個綱，195個目，298個科，580個屬。相對豐度位于前十的屬分別為馬賽菌屬Massilia、黃桿菌屬Flavobacterium、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、類諾卡氏屬Nocardioides、溶桿菌屬Lysobacter、假節桿菌屬Pseudarthrobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、原小單胞菌屬Promicromonospora、德沃斯氏菌屬Devosia和土地桿菌屬Pedobacter（圖1g）。其中馬賽菌屬、黃桿菌屬、溶桿菌屬、假節桿菌屬、假單胞菌屬和土地桿菌屬的相對豐度隨著小麥生長逐漸降低，類諾卡氏屬和原小單胞菌屬的相對豐度則是先升高后降低，即在拔節期（Feekes"7）最高，在灌漿期（Feekes"11）相對豐度降低。鞘氨醇單胞菌屬和德沃斯氏菌屬的相對豐度隨著小麥生長逐漸上升。

真菌群體中共鑒定出9個門，24個綱，65個目，104個科，151個屬。相對豐度位于前十的屬分別為鐮孢屬Fusarium、小畫線殼屬Monographella、被孢霉屬Mortierella、枝頂孢屬Acremonium、油壺菌屬Olpidium、絲膜菌屬Cortinarius、帚枝霉屬Sarocladium、亡革菌屬Thanatephorus、枝孢屬Cladosporium和青霉屬Penicillium（圖1h）。鐮孢屬、帚枝霉屬和枝孢屬的相對豐度隨小麥生長逐漸升高，其中引起小麥莖基腐病的鐮孢屬在分蘗期（Feekes"3）的相對豐度分別為1.02%（Dif）和4.39%（Con），在拔節期（Feekes"7）分別為6.69%（Dif）和10.85%（Con），在灌漿期（Feekes"11）相對豐度最高，分別達18.37%（Dif）和39.44%（Con）。

對照組中被孢霉屬、油壺菌屬、絲膜菌屬和青霉屬從分蘗期（Feekes"3）到灌漿期（Feekes"11）相對豐度逐步降低，枝頂孢屬相對豐度先降低后升高，而小畫線殼屬、亡革菌屬相對豐度先升高后降低，即在拔節期（Feekes"7）最高。

2.2"LEfSe分析苯醚甲環唑拌種處理對小麥根際微生物的影響

對苯醚甲環唑拌種處理組和對照

組小麥分蘗期（Feekes"3）、拔節期（Feekes"7）、灌漿期（Feekes"11）根際微生物群落相對豐度的差異性

進行LeEfSe分析，LDA值設定為大于3。圖2a，2b分別展示了細菌和真菌屬水平生物標志物（用*號表示）及其在各個處理中的相對豐度（用顏色表示）。細菌和真菌的屬水平生物標志物主要集中在Feekes"3和Feekes"7，說明苯醚甲環唑拌種處理對小麥根際微生物的影響主要在小麥生長前期。細菌群落中（圖2a），在分蘗期，對照組的細菌標志物德沃斯氏菌屬Devosia、土生單胞菌屬Terrimonas、氣微菌屬Aeromicrobium和Polycyclovorans屬（Con.3）的相對豐度顯著高于苯醚甲環唑拌處理組（Dif.3），而苯醚甲環唑拌種處理的細菌標志物Adhaeribacter、Flavisolibacter和Pontibacter屬（Dif.3）相對豐度顯著高于對照（Con.3）。在拔節期，苯醚甲環唑拌種處理的細菌標志物土生單胞菌屬Terrimonas和假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas（Dif.7）的相對豐度顯著高于對照（Con.7）。真菌群落中（圖2b），在分蘗期，對照組的真菌標志物鐮孢屬Fusarium、絲膜菌屬Cortinarius和曲霉屬Aspergillus（Con.3）的相對豐度顯著高于苯醚甲環唑拌種處理（Dif.3），而苯醚甲環唑拌種處理的真菌標志物Paramyrothecium屬（Dif.3）相對豐度顯著高于對照（Con.3）。在拔節期，苯醚甲環唑拌種處理的真菌標志物被孢霉屬Mortierella、Alogomyces、Phaeoacremonium和粉菌屬Powellomyces（Dif.7）的相對豐度顯著高于對照（Con.7），而對照組的真菌標志物平臍蠕孢屬Bipolaris、Papiliotrema和普魯蘭久浩酵母菌屬Guehomyces"（Con.7）的相對豐度顯著高于拌種處理。在灌漿期，苯醚甲環唑拌種處理的真菌標志物曲霉屬Aspergillus（Dif.11）相對豐度顯著高于對照（Con.11）；而對照組的真菌標志物，盾殼霉屬Coniothyrium（Con.11）的相對豐度顯著高于拌種處理（Dif.11）。苯醚甲環唑拌種處理使鐮孢屬Fusarium的相對豐度降低，其中分蘗期（Feekes"3）顯著低于對照。

2.3"根際鐮孢屬相對豐度與小麥莖基腐病病情相關性分析

對分蘗期根際鐮孢屬相對豐度、拔節期病莖率分別與拔節、灌漿期病莖率，灌漿期病情指數和灌漿期白穗率進行了Pearson相關性分析。結果表明：分蘗期根際鐮孢屬相對豐度與灌漿期病莖率呈極顯著正相關（r=0.98，Plt;0.001），與灌漿期病情指數呈顯著正相關（r=0.92，Plt;0.01）。拔節期病莖率與灌漿期白穗率呈顯著正相關（r=0.84，Plt;0.05）（表1）。表明，苯醚甲環唑拌種處理對小麥莖基腐病的防治效果可能是通過降低分蘗期根際鐮孢屬的相對豐度而達到的。

2.4"小麥根際細菌和真菌共現網絡分析

采用ggClusterNet包進行細菌和真菌微生物共現網絡分析（圖3，表2），細菌選取絕對豐度為前1"500的ASV，真菌選取絕對豐度為前500的ASV，節點顏色代表門種類名，節點大小代表節點度，黃色邊代表正相關，藍色邊代表負相關。結果表明，"細菌網

絡中，苯醚甲環唑拌種處理的節點數和邊數分別為1"026和3"860，其中正邊數為3"405，負邊數為455;

對照的節點數和邊數分別為1"089和3"108，正邊數為2"827，負邊數為281。苯醚甲環唑拌種處理的負邊比例（11.79%）高于對照（9.04%），連接度（0.007"3）和平均度（7.52）均高于對照，平均路徑長度（5.24）和直徑（17.12）均低于對照，平均聚類系數（0.646"4）略低于對照（0.664"6）。

真菌網絡中，苯醚甲環唑拌種處理的節點數和邊數分別為383和1"801，正邊數為1"752，負邊數為49;對照的節點數為402，邊數為2"631。苯醚甲環唑拌種處理的負邊比例（2.72%）高于對照（1.60%），連接度（0.024"6）、平均度（9.40）、平均路徑長度（1.99）和直徑（8.37）均低于對照，平均聚類系數（0.879"9）略高于對照（0.854"5）。苯醚甲環唑拌種處理提高了細菌網絡的負邊比例、平均度和連接度等，網絡的復雜性較高，而真菌網絡的平均度和連接度等參數與對照相比較低，網絡的復雜性較低，這些網絡特征與前人報道的健康植株根際細菌網絡復雜性高于發病植株、而真菌網絡復雜性低于發病植株的特征相似。

3"結論與討論

苯醚甲環唑通過抑制病原菌中麥角甾醇的生物合成，導致病原菌不能正常生長，也可抑制病原菌形成孢子，其具有內吸性，施藥后不僅能被植物迅速吸收并長時間殘留在植株體內［12］，而且在環境中也有不同程度殘留［1314］。苯醚甲環唑大量殘留能顯著降低土壤中微生物活性，影響土壤生態環境［15］，其對哺乳動物細胞器和細胞生成也有潛在的毒性作用［1617］。土壤中苯醚甲環唑殘留受到土壤性質、種植作物及處理方法和取樣時間的影響。處理濃度越高，苯醚甲環唑在土壤中消解速度越緩慢、持留期越長［18］。對蘋果樹進行苯醚甲環唑噴霧處理后，其在雜草和蘋果葉片上殘留量較多，而在土壤中的殘留量很低且沒有累積現象［19］。同樣的結果在苯醚甲環唑拌種玉米上也有發現，即苯醚·噻蟲嗪混劑拌種玉米后不同生長時期的土壤中均未檢出苯醚甲環唑［5］。苯醚甲環唑在土壤中殘留量的差異可能對土壤微生物產生不同的影響。本研究結果發現，苯醚甲環唑處理導致的細菌和真菌物種的差異主要集中在小麥分蘗期和拔節期，對灌漿期物種的影響較小，這可能跟苯醚甲環唑在土壤中殘留的持效期有關系。

研究者報道了不同處理和土壤類型下苯醚甲環唑對土壤微生物群落的影響。許天衡［18］的研究表明，不同濃度苯醚甲環唑處理對土壤中細菌群落影響較小，而對真菌的群落組成結構有明顯影響。王飛菲等［20］的研究表明，苯醚甲環唑溶液（2.5"mg/kg和5.0"mg/kg）處理土壤對細菌和放線菌數量有短暫的抑制或刺激作用，對土壤真菌數量有顯著的抑制作用。劉亞冬等［21］的研究表明，噻蟲嗪和苯醚甲環唑混劑拌種玉米能抑制根際和非根際土壤可培養細菌的數目增長，對根際土可培養細菌的抑制作用隨著玉米生長逐漸減弱。本研究主要探討苯醚甲環唑拌種后對小麥不同生育期根際土壤微生物的影響，結果表明，苯醚甲環唑拌種對小麥分蘗期、拔節期和灌漿期對根際土壤細菌和真菌的alpha和beta多樣性均無顯著影響，但顯著降低了分蘗期（Feekes"3）真菌鐮孢屬的相對豐度。小麥莖基腐病主要是由鐮孢屬真菌引起的病害，本研究發現，分蘗期鐮孢屬相對豐度與灌漿期病莖率和病情指數均呈顯著正相關，因此苯醚甲環唑拌種可能是通過降低分蘗期根際鐮孢屬的相對豐度而達到對小麥莖基腐病的防治效果。

微生物共現相互作用網絡為揭示微生物群在應對生物脅迫方面提供了有效的途徑［22］。Gao等［23］研究了紅辣椒枯萎?。‵usarium"wilt"disease，"FWD）健康和發病植株的根際微生物共現網絡，表明健康植株細菌網絡與發病植株相比復雜性更高（節點數、邊數、負邊比例、平均度、網絡密度等均較高），而真菌網絡則相反。網絡中的合作關系（正相關性）可能引起了物種與正反饋回路的耦合，物種容易出現依賴性，從而降低系統穩定性;而競爭（負相關性）激活了負反饋回路，提高生態系統的穩定性［21］。Yuan等［22］以尖鐮孢為研究對象，探究了基于大數據整合預測枯萎病的發生，分析了發生枯萎病的土壤微生物群落特征，通過網絡分析表明，45個細菌特征OTU健康網絡節點、連接數、平均度、中心緊密度均較高，而40個真菌特征OTU發病網絡中節點和連接數較多。本試驗中苯醚甲環唑拌種處理下細菌和真菌網絡更接近于這些前人報道的健康植株根際的微生物網絡特征，表明苯醚甲環唑拌種處理對小麥莖基腐病防治有一定效果，可能是提高了小麥根際土壤微生物網絡的健康程度。

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（責任編輯：楊明麗）