灰飛虱冠蛋白的基因克隆與表達(dá)分析

摘要

灰飛虱Laodelphax"striatellus冠蛋白屬于WD40重復(fù)超家族成員，主要通過結(jié)合肌動(dòng)蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)聚合與解聚。本研究通過RTPCR克隆并獲得了灰飛虱3個(gè)冠蛋白coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因CDS區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，這3個(gè)冠蛋白分別屬于3個(gè)分支，且與褐飛虱Nilaparvata"lugens的3個(gè)冠蛋白同源性最高，氨基酸序列相似性分別為99.2%、88.2%和82.5%。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，coronin"1A在成蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲，coronin"2B在雄蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雌蟲，coronin"7在雌蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雄蟲。而3個(gè)冠蛋白基因在唾液腺中的轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于腸道。灰飛虱攜帶水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）后體內(nèi)3個(gè)冠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照，說明冠蛋白可能在灰飛虱傳播RSV過程中發(fā)揮一定作用，研究結(jié)果為深入探究冠蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

灰飛虱;"水稻條紋病毒;"冠蛋白;"轉(zhuǎn)錄水平

中圖分類號(hào)：

S"433.3;"S"435.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023077

Gene"cloning"and"expression"analysis"of"coronins"in"Laodelphax"striatellus

ZHONG"Jiayi，"LI"Li，"WANG"Xifeng，"LIU"Wenwen*

（State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"

Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China）

Abstract

The"coronins"of"Laodelphax"striatellus"are"the"members"of"WD40repeat"protein"superfamily，"which"can"regulate"the"dynamic"polymerization"and"depolymerization"of"actin"cytoskeleton."In"this"study，"we"cloned"the"coding"sequences"of"three"coronins："coronin"1A，"coronin"2B，"and"coronin"7"of"L.striatellus"by"RTPCR."Phylogenetic"analysis"showed"that"these"three"coronins"belonged"to"separate"branches，"with"the"highest"homology"observed"with"Nilaparvata"lugens，"showing"amino"acid"sequence"similarities"of"99.2%，"88.2%"and"82.5%，"respectively."Analysis"of"transcription"levels"of"coronin"genes"showed"that"transcription"level"of"coronin"1A"in"adults"was"significantly"higher"than"that"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs，"transcription"level"of"coronin"2B"in"male"adults"was"significantly"higher"than"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs"and"female"adults，"and"transcription"level"of"coronin"7"in"female"adults"was"significantly"higher"than"that"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs"and"male"adults."Moreover，"the"transcription"level"of"the"three"coronin"genes"in"the"salivary"glands"were"significantly"higher"than"those"in"the"gut."In"addition，"the"transcription"levels"of"the"three"coronin"genes"in"L."striatellus"carrying"rice"stripe"tenuivirus"（RSV）"were"significantly"higher"than"in"nonviruliferous"insects，"indicating"that"the"three"coronins"may"play"a"role"in"transmitting"RSV."This"study"have"laid"a"foundation"for"further"studies"on"the"function"of"coronins"in"virustransmission.

Key"words

Laodelphax"striatellus;"rice"stripe"tenuivirus;"coronin;"transcription"level

灰飛虱Laodelphax"striatellus（small"brown"planthopper，"SBPH）屬半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae，其除了直接取食水稻韌皮部汁液對(duì)水稻產(chǎn)生危害外，還能分泌各種化學(xué)物質(zhì)（如多種水解酶）以及間接產(chǎn)生“蜜露”導(dǎo)致水稻長勢(shì)減弱或死亡［1］。此外，灰飛虱還是多種作物病毒的傳播介體，可傳播水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）、水稻黑條矮縮病毒（rice"blackstreaked"dwarf"virus）、北方禾谷花葉病毒（northern"cereal"mosaic"virus）和大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（barley"yellow"striate"mosaic"virus）等，導(dǎo)致病毒病害的大面積暴發(fā)流行，作物產(chǎn)量嚴(yán)重降低甚至絕收，其造成的病害損失常大于直接取食危害［26］。為了解析灰飛虱的傳毒機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期以RSV的核衣殼蛋白（nucleocapsid"protein，NP）為誘餌篩選了灰飛虱的cDNA文庫并獲得了與NP互作的冠蛋白［7］。

冠蛋白家族（coronin"family）是一類進(jìn)化上保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，是由de"Hostos等于1991年首次在盤基網(wǎng)柄菌Dictyostelium"discoideum中鑒定到的，其定位于細(xì)胞表面冠狀突起，屬于WD40重復(fù)超家族［8］。在哺乳動(dòng)物中，冠蛋白家族有7個(gè)成員，分為3大類，其中coronin"1A，"coronin"1B、coronin"1C和coronin"6屬于Ⅰ類，coronin"2A和coronin"2B屬于Ⅱ類，coronin"7屬于Ⅲ類［9］。目前包括褐飛虱Nilaparvata"lugens、煙粉虱Bemisia"tabaci和棉鈴蟲Helicoverpa"armigera在內(nèi)的多種昆蟲的冠蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫中都只檢索到了3種不同類型，分別屬于Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。有文獻(xiàn)依據(jù)的盤狀網(wǎng)柄菌中只鑒定到了coronin"7（corB）、villindin和coronin（corA）這3種冠蛋白;黑腹果蠅Drosophila"melanogaster鑒定到2種冠蛋白coronin（coro）和Pod1（coronin"7）;而秀麗蠅桿線蟲Caenorhabditis"elegans鑒定到2種冠蛋白Pod1（coronin"7）和coronin（cor1）［10］。冠蛋白參與肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)是許多生理過程的重要組成部分，如細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和囊泡的運(yùn)輸?shù)龋?1］。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)在包括癌癥和自身免疫性疾病等各種疾病的病因?qū)W中起著至關(guān)重要的作用［12］。大多數(shù)情況下，運(yùn)動(dòng)性依賴于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組，而肌動(dòng)蛋白微絲的聚合和解聚是一個(gè)高度調(diào)控的過程，受許多肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白如冠蛋白、Arp2/3復(fù)合體、ADF和絲切蛋白（cofilin）等的調(diào)節(jié)。目前對(duì)冠蛋白的研究主要是聚焦在人和哺乳動(dòng)物中，Ren等研究發(fā)現(xiàn)coronin"3促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移［13］;Rastetter等發(fā)現(xiàn)MAPK12/coronin"2通路參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［14］;Wu等研究發(fā)現(xiàn)coronin"1C的表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，而與患者預(yù)后成負(fù)相關(guān)，coronin"1C增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲活力［1516］;而乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎癌等癌癥的惡性程度也被證明與冠蛋白家族成員相關(guān)［1719］。

鑒于冠蛋白家族成員在人類疾病中發(fā)揮的重要作用和其在真核生物體內(nèi)的保守性，且其在昆蟲中的功能研究還不清楚，本研究克隆了灰飛虱冠蛋白家族3個(gè)成員coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)相關(guān)分析，構(gòu)建了與其他物種同源基因的進(jìn)化樹，并對(duì)這3個(gè)蛋白在灰飛虱不同發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)量進(jìn)行了分析，同時(shí)檢測了灰飛虱攜帶RSV后冠蛋白的表達(dá)差異，研究結(jié)果為深入探究冠蛋白在灰飛虱體內(nèi)的功能及其在傳毒過程中發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"供試蟲源

試驗(yàn)所用灰飛虱包括攜帶水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）的灰飛虱（帶毒灰飛虱）和不攜帶RSV的灰飛虱（無毒灰飛虱）種群，為本實(shí)驗(yàn)室長期保存種群，分別用‘武育粳3號(hào)’水稻飼養(yǎng)于恒溫光照培養(yǎng)箱中。飼養(yǎng)條件為：光周期為L∥D=16"h∥8"h，溫度26～28℃，相對(duì)濕度70%。每7"d更換1次水稻。每2個(gè)月利用斑點(diǎn)雜交法對(duì)攜帶RSV的灰飛虱（帶毒灰飛虱）進(jìn)行篩選，保證種群帶毒率保持在90%以上。

1.2"主要試劑

AllInOne"FirstStrand"cDNA"Synthesis"Mix"for"qPCR"（AE341）購自北京全式金公司;Total"RNA"extraction"reagent"（R401）"和2×Phanta"Max"Master"Mix"（P525）"購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit"（11139ES60）和qPCR"SYBR"Green"Master"Mix（11184ES08）購自上海翌圣生物科技股份有限公司;pTOPOTA/Blunt"Simple"Cloning"Kit（CV2201）和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（DR01）購自北京艾德萊生物科技有限公司;大腸桿菌DH5α菌株（SAC21）購自北京金沙生物公司;快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105）購自北京生化科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3"序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)

在NCBI上檢索得到褐飛虱冠蛋白家族3個(gè)成員（coronin"1A：LOC111059043;coronin"2B：LOC111048487;coronin"7：LOC111045201）的CDS序列。與本地灰飛虱轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行BLAST比對(duì)，拼接后得到灰飛虱coronin"1A，coronin"2B和coronin"7的部分序列。根據(jù)CDS區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)引物克隆3個(gè)冠蛋白基因，克隆后進(jìn)行測序分析，再根據(jù)測序得到的正確序列設(shè)計(jì)相應(yīng)基因的qPCR引物（表1）。

1.4"灰飛虱樣品收集

不同組織樣品：取30頭灰飛虱置于離心管中并插入冰中，為1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。待灰飛虱凍暈后，在體視顯微鏡（明美光電技術(shù)有限公司，型號(hào)MZ101）下解剖唾液腺和腸道，并置于PBS溶液中，離心后去掉PBS溶液收集唾液腺和腸道組織;解剖完唾液腺和腸道后在剩余組織中加入3"μL"超純水，使蟲體內(nèi)血淋巴釋放出來，用移液器轉(zhuǎn)移到離心管中。將收集的唾液腺、腸道和血淋巴放入液氮或-80℃保存。

不同發(fā)育階段樣品：取灰飛虱2齡、4齡若蟲，雌、雄成蟲各30頭，每10頭1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。放入液氮或-80℃保存。

帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱樣品：取帶毒率90%以上的灰飛虱和無毒灰飛虱各30頭，每10頭1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。放入液氮或-80℃保存。

1.5"總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzol試劑分別提取灰飛虱不同組織、不同發(fā)育階段、帶毒灰飛虱和無毒灰飛虱的總RNA。用NanoDrop"1000測定總RNA濃度，確保總RNA的質(zhì)量良好后，用1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，此cDNA用于后續(xù)基因克隆的模板，另用AllInOne"FirstStrand"cDNA"Synthesis"Mix"for"qPCR將1"μg"總RNA反轉(zhuǎn)錄成短鏈cDNA，用于后續(xù)熒光定量PCR。

1.6"冠蛋白基因的克隆

以1.5中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50"μL）：2×Phanta"Max"Master"Mix"25"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各2"μL，模板cDNA"2"μL，超純水"19"μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3"min;95℃變性15"s，退火15"s（溫度根據(jù)引物設(shè)定），72℃延伸（30～60"s/kb），35個(gè)循環(huán);72℃延伸5"min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化回收目的條帶，然后將回收產(chǎn)物連接到pTOPO克隆載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆于600"μL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200"r/min培養(yǎng)4"h，PCR驗(yàn)證后，將陽性克隆菌液送至華大基因進(jìn)行測序，將測序正確的質(zhì)粒提取DNA保存于-20℃。

1.7"序列拼接及生物信息學(xué)分析

利用SnapGene軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接及翻譯。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)（TMHMM"Server"2."0，https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）和信號(hào)肽（SignalP"4.1"Server，https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP4.1/）預(yù)測;用ProtParam（https：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn);利用SWISSMODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測;在NCBI（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進(jìn)行Blastp序列比對(duì)，檢索其他物種的冠蛋白基因序列，利用EMBOSS"Needle"（https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）對(duì)序列相似性進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA"X軟件構(gòu)建不同物種冠蛋白基于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8"實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以1.5中合成的用于qPCR的cDNA為模板，反應(yīng)體系（20"μL）為：qPCR"SYBR"Green"Master"Mix"10"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.4"μL，cDNA"2"μL，超純水"7.2"μL。反應(yīng)條件為：95℃"2"min；95℃"10"s，60℃"30"s，40個(gè)循環(huán)。以actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法對(duì)各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算分析。

1.9"數(shù)據(jù)分析

利用IBM"SPSS"Statistics"26對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，3種冠蛋白基因在不同發(fā)育階段和不同組織之間的差異顯著性分析采用單因素方差分析（Oneway"ANOVA）和最小顯著性差異法（least"significant"difference，LSD），在無毒灰飛虱和帶毒灰飛虱之間的差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為0.05和0.01。

2"結(jié)果與分析

2.1"冠蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析

基于灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序最終得到灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7基因的CDS區(qū)序列，長度分別為1"506、1"749"bp和3"213"bp，分別編碼501、582個(gè)和1"070個(gè)氨基酸。預(yù)測的蛋白分子量分別為55.88、65.67"kD和116.81"kD，等電點(diǎn)分別為6.00、8.58和6.15，均無跨膜結(jié)構(gòu)，也無信號(hào)肽。利用EMBOSS"Needle對(duì)氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱N.lugens"coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為99.2%、88.2%、82.5%，與人Hama"sapiens的coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為68.2%、61.7%、53.7%，說明3個(gè)冠蛋白在不同物種間具有高度的保守性。

冠蛋白家族成員具有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域（含有保守的色氨酸天冬氨酸基序，長度約為40"aa），此結(jié)構(gòu)域包含5～7個(gè)WD40重復(fù)序列，在空間上折疊成一個(gè)具有5～7個(gè)葉片的β螺旋槳結(jié)構(gòu)。利用SWISSMODEL對(duì)灰飛虱3個(gè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，其中coronin"1A和coronin"2B含有N端由WD40重復(fù)序列形成的“螺旋槳”結(jié)構(gòu)及C端形成的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，而coronin"7是長鏈蛋白，空間結(jié)構(gòu)上包含2個(gè)由WD40重復(fù)序列形成的“螺旋槳”，但其缺少C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2"冠蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取與灰飛虱冠蛋白家族序列同源性較高的7種昆蟲，褐飛虱、棉鈴蟲、煙粉虱、茶翅蝽"Halyomorpha"halys、意大利蜜蜂"Apis"mellifera、米象"Sitophilus"oryzae、致倦庫蚊Culex"quinquefasciatus，再加上人和小家鼠Mus"musculus冠蛋白家族的7個(gè)成員，利用MEGA"X，采用鄰接法（neighbourjoining"method）構(gòu)建冠蛋白基于氨基酸序列在不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，冠蛋白家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別聚成一支，說明3類蛋白在不同物種間保守性強(qiáng)。灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7親緣關(guān)系最近（圖2）。

2.3"冠蛋白基因的時(shí)空表達(dá)分析

qPCR檢測結(jié)果表明，3個(gè)冠蛋白基因在灰飛虱的各發(fā)育階段和不同組織中都有轉(zhuǎn)錄。coronin"1A在成蟲（雄蟲和雌蟲）中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲;coronin"2B在雄蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雌蟲;而coronin"7在雌蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雄蟲（圖3）。

coronin"1A在灰飛虱血淋巴中的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是唾液腺，腸道中最低;coronin"2B在唾液腺中的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是血淋巴和腸道;而coronin"7在唾液腺和血淋巴中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于腸道（圖4）。說明這3個(gè)冠蛋白基因在灰飛虱體內(nèi)具有組織特異性，它們發(fā)揮的功能可能也不一樣。

2.4"帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱冠蛋白基因表達(dá)差異

為探究冠蛋白家族3個(gè)蛋白是否在灰飛虱傳播水稻條紋病毒（RSV）中發(fā)揮一定功能，我們檢測了帶毒灰飛虱和無毒灰飛虱體內(nèi)冠蛋白基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶毒灰飛虱體內(nèi)3個(gè)冠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于無毒灰飛虱（圖5），這說明病毒侵染灰飛虱后會(huì)顯著上調(diào)冠蛋白基因的表達(dá)，表明它們可能在灰飛虱傳播RSV時(shí)發(fā)揮一定作用。

3"結(jié)論與討論

冠蛋白在高等真核生物中具有多種作用，已知它們是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白之一，并參與多種重要的細(xì)胞功能［10］。冠蛋白與Factin的相互作用調(diào)節(jié)Factin的表達(dá)和定位［2021］。惡性瘧原蟲Plasmodium"falciparum的冠蛋白在其繁殖后期高表達(dá)，促進(jìn)Factin在質(zhì)膜上的定位［22］。因此，冠蛋白通過與蛋白質(zhì)互作在Factin定位方面具有重要作用。目前已有較多研究發(fā)現(xiàn)冠蛋白與人類疾病相關(guān)，其可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，影響癌癥預(yù)后等［23］，但其在昆蟲上的研究報(bào)道較少。NCBI數(shù)據(jù)庫中灰飛虱冠蛋白均未注釋。本研究利用RTPCR技術(shù)克隆獲得了灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因，其中"coronin"1A與coronin"2B和coronin"7的氨基酸序列相似性分別為57.9%和23.2%;coronin"2B與coronin"7的相似性只有22.2%，說明3個(gè)蛋白之間的相似性較低，但3個(gè)蛋白在空間上都形成一個(gè)“螺旋槳”結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是冠蛋白與其他蛋白互作的平臺(tái)［10］。灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的氨基酸序列相似性分別為99.2%、88.2%、82.5%，與人coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為68.2%、61.7%、53.7%，且在對(duì)灰飛虱與其他物種的冠蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)，冠蛋白的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別聚成一支，這說明冠蛋白家族成員在不同物種間高度保守。

目前對(duì)昆蟲中冠蛋白的功能研究較少，但在哺乳動(dòng)物中冠蛋白的研究已取得了很大進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)coronin"1A參與了吞噬作用，coronin"1A與NADPH氧化酶（PHOX）復(fù)合體的成分結(jié)合，該復(fù)合體聚集在吞噬小體表面，產(chǎn)生可以殺死體內(nèi)病原體的超氧化物［24］。Humphries等發(fā)現(xiàn)，冠蛋白通過其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與Arp2/3復(fù)合體結(jié)合，將其招募到肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的兩側(cè)，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲成核;而在沒有細(xì)絲存在的情況下，冠蛋白抑制Arp2/3復(fù)合體的成核活性［25］。Cai等提出coronin"1B可以通過引導(dǎo)磷酸酶SSH1L定位到片狀脂膜，去磷酸化激活絲切蛋白（cofilin），從而增強(qiáng)cofilin活性來調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚［26］。有證據(jù)表明，冠蛋白可以區(qū)別Factin的核苷酸狀態(tài)，coronin"1B對(duì)ATPFactin的親和力遠(yuǎn)高于對(duì)ADPFactin的親和力［27］，ATPFactin存在于肌動(dòng)蛋白細(xì)絲聚合的正端，而ADPFactin存在于解聚末端。冠蛋白是如何調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲動(dòng)態(tài)變化的過程是復(fù)雜的，目前的研究也不夠完整，但很明顯，冠蛋白在肌動(dòng)蛋白細(xì)絲的兩端，分別參與了其聚合與解聚。

帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱相比，coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升，而實(shí)驗(yàn)室前期利用RSV"的核衣殼蛋白NP為誘餌篩選灰飛虱的cDNA文庫時(shí)，僅篩選到coronin"1A與NP互作［7］。由于coronin"1A是保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架有著保守的調(diào)節(jié)作用，推測coronin"1A可能是通過與RSV"NP的互作在灰飛虱傳播RSV中發(fā)揮重要作用，且這個(gè)過程中可能有肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的參與。coronin"2B和coronin"7在RSV侵染后轉(zhuǎn)錄水平也顯著上升，這可能是因?yàn)閏oronin"2B和coronin"7并不是通過直接與RSV"NP互作而是通過其他路徑發(fā)揮功能，后續(xù)可以從coronin"2B和coronin"7與病毒其他蛋白的互作入手進(jìn)行研究。

通過本研究，我們克隆了灰飛虱冠蛋白家族3個(gè)成員coronin"1A、coronin"2B和coronin"7，它們?cè)诨绎w虱不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異，且在唾液腺的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于腸道，也明確了灰飛虱攜帶RSV后會(huì)引起3個(gè)冠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平上升，這為下一步探索這3個(gè)冠蛋白在灰飛虱傳播RSV中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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