甘肅省黃芩根結線蟲病病原種類鑒定

摘要

通過形態(tài)學與分子生物學相結合的方法對引起甘肅省隴西縣黃芩根結線蟲病的病原種類進行了鑒定，并采用室內人工接種的方法測定其對黃芩的致病性。結果表明，從黃芩根系分離的根結線蟲其形態(tài)特征及測量值與北方根結線蟲Meloidogyne"hapla基本一致。該線蟲種群rDNAITS和28S"rDNA"D2/D3序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的北方根結線蟲序列相似性分別為99.60%和99.74%"（rDNAITS："JX024147;"28S"rDNA"D2/D3："MW288147）。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該線蟲群體與其他北方根結線蟲群體聚為一支，置信度在95%以上。利用北方根結線蟲特異性引物MhF/MhR擴增并測序得到457"bp的特異性片段。因此，基于形態(tài)學結合rDNAITS、28S"rDNA"D2/D3序列和特異性片段長度，將黃芩根結線蟲病病原鑒定為北方根結線蟲M.hapla。接種該線蟲后的黃芩生長緩慢，葉片黃化，40"d后須根上有明顯的根結。經(jīng)分離鑒定，致病群體為北方根結線蟲。綜上所述，甘肅省隴西縣黃芩根結線蟲病病原為北方根結線蟲M.hapla，該線蟲對黃芩具有較強的致病性，其繁殖系數(shù)為1.997。

關鍵詞

甘肅;"黃芩;"北方根結線蟲;"鑒定;"致病性

中圖分類號：

S"435.672

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023102

Identification"of"pathogens"of"rootknot"nematode"disease"of"Scutellaria"baicalensis"in"Gansu"province

CHEN"Jinghuan，"SHI"Mingming，"QIAO"Wanqiang，"ZHANG"Jie，"WU"Jin，"LI"Huixia*

（College"of"Plant"Protection，"Gansu"Agricultural"University，"Biocontrol"Engineering"Laboratory"of"Crop"

Diseases"and"Pests"in"Gansu"Province，"Lanzhou"730070，"China）

Abstract

In"this"study，"the"species"causing"root"knot"nematode"disease"on"Scutellaria"baicalensis"in"Longxi"county，"Gansu"province"was"isolated"and"identified"and"its"pathogenicity"to"S.baicalensis"was"determined"by"indoor"artificial"inoculation."The"results"showed"that"the"morphological"characteristics"and"measurements"of"the"nematode"population"from"S.baicalensis"were"basically"consistent"with"those"of"Meloidogyne"hapla."rDNAITS"and"28S"rDNA"D2/D3"sequences"showed"99.60%"and"99.74%"identity"with"M.hapla"in"NCBI，"respectively"（rDNAITS："JX024147;"28S"rDNA"D2/D3："MW288147）."The"Bayesian"phylogenetic"tree"indicated"that"this"nematode"population"clustered"with"other"M.hapla"populations"with"a"confidence"level"of"95%."A"specific"fragment"of"457"bp"in"size"was"obtained"by"amplification"with"the"M."haplaspecific"primers"MhF/MhR"and"sequencing."Based"on"morphology，"rDNAITS，"28S"rDNA"D2/D3"sequences，"and"the"specific"sequence，"the"pathogen"of"the"nematode"population"on"S.baicalensis"was"identified"as"M.hapla."After"inoculation"with"this"nematode"population，"S.baicalensis"grew"slowly"with"yellowing"leaves，"and"obvious"root"knots"were"observed"on"fibrous"roots"40"days"after"inoculation."In"conclusion，"the"pathogen"responsible"for"the"root"knot"nematode"disease"of"S.baicalensis"in"Longxi"county，"Gansu"province"is"M.hapla，"which"demonstrates"strong"pathogenicity"to"S.baicalensis"with"a"reproductive"coefficient"of"1.997.

Key"words

Gansu;"Scutellaria"baicalensis;"Meloidogyne"hapla;"identification;"pathogenicity

黃芩Scutellaria"baicalensis"Georgi，又稱山茶根、土金茶根，為唇形科Lamiaceae黃芩屬Scutellaria"多年生草本植物［1］。黃芩以根入藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒等功效［2］。甘肅省隴西縣種植中藥材品種達40種，是我國重要的道地藥材產(chǎn)區(qū)之一，被稱為“天下藥鄉(xiāng)”和“西部藥都”［3］。

隨著市場對黃芩藥材需求量的增加，野生黃芩已不能滿足需求，黃芩人工栽培面積正逐步擴大［45］。

黃芩是隴西縣種植的重要的道地大宗中藥材品種之一，每年種植面積3"400"hm2，干貨產(chǎn)量450萬t左右［6］。由于生產(chǎn)上多年連作，導致黃芩病害的發(fā)生呈逐年遞增趨勢。國內已報道的黃芩病害主要有根腐病［7］、葉枯病和白粉病［8］以及灰霉病等［9］病害，然而對黃芩線蟲病報道較少。

根結線蟲Meloidogyne"spp.是世界上危害較大的植物病原線蟲之一，其寄主范圍極為廣泛，大多為經(jīng)濟作物，每年造成的經(jīng)濟損失多達數(shù)十億美元［1011］。根結線蟲主要侵染寄主植物的根部，造成植物的主根以及須根部位形成大小不一的根結，導致寄主植物產(chǎn)量下降、品質降低。而且根結線蟲危害植物后有利于其他病原菌的侵入，引起復合侵染，從而造成根部的壞死與腐爛［12］。據(jù)文獻記載，目前全世界已報道的根結線蟲有90多種，中國發(fā)現(xiàn)有39種［1315］。我國和世界上大部分地區(qū)90%以上的植物根結線蟲病是由南方根結線蟲Meloidogyne"incognita、北方根結線蟲M.hapla、花生根結線蟲M.arenaria和爪哇根結線蟲M.javanica等4種引起。據(jù)報道［16］，多種根結線蟲可侵染名貴中草藥，造成產(chǎn)量下降，品質降低。如南方根結線蟲可以侵染當歸Angelica"sinensis［17］，北方根結線蟲可以侵染黨參Codonopsis"pilosula［18］、西洋參Panax"quinquefolius［19］、三七P.notoginseng［20］和人參P.ginseng［21］等。

2020年10月，本課題組在調查中藥材主要病害時，發(fā)現(xiàn)甘肅省定西市隴西縣柯寨鎮(zhèn)種植區(qū)的黃芩根部具有大量肉眼可見的根結，須根上的根結較為明顯，部分田塊發(fā)病嚴重，初步判定該病為黃芩根結線蟲病。鑒于根結線蟲病對黃芩品質和產(chǎn)量可能存在潛在威脅，且不同種類的根結線蟲對不同作物或品種專化性不同，故準確鑒定病原種類、明確優(yōu)勢種，對防治根結線蟲病具有重要意義。因此，本研究擬采用形態(tài)學與分子生物學相結合的方法對黃芩根結線蟲種類進行準確鑒定，并通過室內人工接種測定其對黃芩的致病性，從而為黃芩根結線蟲病的有效防控提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"線蟲的采集與分離

2020年10月，對甘肅省隴西縣柯寨鎮(zhèn)（104°28′E，35°07′N）黃芩種植區(qū)采用五點法采樣，將帶有根結的主根、須根及根際5～15"cm土樣一同裝袋，帶回實驗室進行分離鑒定。剖開黃芩根部的根結，挑取卵囊和雌蟲。將黃芩病根剪成約2"cm小段，與根際土壤分開，采用改良的貝爾曼漏斗法［22］分離、收集雄蟲和2齡幼蟲。

1.2"線蟲的純化與擴繁

將病根表面的雜物挑取干凈，放置于無菌水中。在體視顯微鏡下，通過眼科手術刀與鑷子收集根結表面乳白色梨形雌蟲和卵囊。用0.5%"NaClO對卵囊消毒1"min，再用無菌水沖洗3～4次，置于裝有50"μL無菌水的1.5"mL離心管中。在25℃光照培養(yǎng)箱內放置72"h，即可得到2齡幼蟲。將其接種于健康的黃芩植株根部，進行純化和擴繁［19］。

1.3"形態(tài)學鑒定

分別挑取雄蟲和2齡幼蟲各20條，置于體積分數(shù)為45%的乳酸中備用。隨后挑取單條線蟲于加有一滴無菌水的載玻片上。用酒精燈外焰在載玻片另一側進行加熱，在顯微鏡下每隔3"s觀察一次，蟲體僵直不動，則表明線蟲死亡。將已死亡的線蟲置于新的載玻片上，進行形態(tài)特征觀察并拍照，參照謝輝［23］的方法測量形態(tài)值。制作雌蟲的會陰花紋時，采用眼科手術刀在顯微鏡下切掉雌蟲尾端后部約1/4。將切口向下，輕輕按壓以除去尾部的內容物，然后轉移至加有一滴純甘油的載玻片上。將其表面朝上，用眼科手術刀進行微調，使會陰花紋平整。制片后，在顯微鏡下觀察、拍照及記錄形態(tài)特征。

1.4"分子生物學鑒定

參照王江嶺等［24］的方法提取線蟲的DNA。以提取的DNA樣本為模板，參照Vrain等［25］和Subbotin等［26］已報道的通用引物、PCR反應體系和反應條件，分別擴增線蟲的rDNAITS和28S"rDNA"D2/D3區(qū)基因片段。北方根結線蟲特異性引物選用MhF/MhR［20］，進行擴增驗證。將擴增所得的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，PCR擴增用到的引物序列見表1。

對測序結果進行BLAST比對分析后，從GenBank分別下載和所測序列相似性較高的rDNAITS和28S"rDNA"D2/D3序列。以禾谷孢囊線蟲Heterodera"avenae序列（登錄號：KX573052）作為外群，利用MAFFT"version"5軟件進行序列比對后用Gblock"0.91b進行保守區(qū)的選擇，利用AIC在MrModeltest"version"2.3上運行選擇出最佳模型，使用MrBayes"3.1.2軟件構建貝葉斯系統(tǒng)進化樹。采用Boostrap值檢驗分支聚類的可靠性，最后顯示置信度＞50%的系統(tǒng)發(fā)育樹，再用FigTree"v.1.4.3軟件進行查看、編輯和美化。

1.5"線蟲群體對黃芩的致病性測定

將健康的黃芩苗種植在盛有滅菌土的花盆中（直徑20"cm），每盆種植2株，共種植10盆。種植14"d后，選擇長勢一致的健壯植株進行致病性測定。將純化、擴繁的北方根結線蟲配制成1"000條/mL的2齡幼蟲懸浮液，將其接種在健康黃芩植株根際，每盆2"mL，共接種5盆作為重復，以無菌水處理作為對照，共3盆。接種40"d后，觀察黃芩的癥狀，記錄發(fā)病情況。參照段玉璽等［27］的方法，對發(fā)病黃芩根組織進行染色，統(tǒng)計根結線蟲各蟲態(tài)的數(shù)量。同時統(tǒng)計盆栽土壤中的線蟲，并與根組織中的數(shù)量求和后，計算繁殖系數(shù)：

繁殖系數(shù)=最終線蟲總量/最初線蟲量。

1.6"數(shù)據(jù)處理

使用Excel"2016和SPSS"24.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理分析。

2"結果與分析

2.1"黃芩根結線蟲病癥狀

黃芩被根結線蟲侵染后，其地上部表現(xiàn)為葉片黃化、萎蔫，植株矮小，類似缺水缺肥營養(yǎng)不良所導致的癥狀。根部膨大形成大小不等的根結，且多形成在須根上。危害嚴重時，根結呈念珠狀，后期小根結聯(lián)合在一起形成較大根結（圖1a）。在黃芩生長后期，根部有大量乳白色至淺褐色卵囊暴露在根結表面（圖1b）。

2.2"形態(tài)學鑒定結果

黃芩上分離到的根結線蟲雄蟲、2齡幼蟲和雌蟲的形態(tài)測量值與已報道的北方根結線蟲測量值比較見表2，顯微觀察的形態(tài)特征見圖2。

1）"n：線蟲數(shù)量;L：蟲體長度;a：體長/體寬;W：蟲體寬度;St：口針長度;MB：頭端至中食道球中央的距離;DGO：背食道腺開口到口針基球的距離;Spic：交合刺長;EP：排泄孔到頭端距離;c：體長/尾長;c′：尾長/肛門處體寬;Tail：尾長;—：無數(shù)據(jù)。所有測量值單位為μm，括號里為測量值的范圍。

n："Number"of"specimens;"L："Body"length;"a："Body"length"divided"by"the"maximum"body"width;"W："Maximum"body"width;"St："Style"length;"MB："Distance"from"anterior"end"to"the"centre"of"median"oesophageal"bulb"valve;"DGO："Dorsal"gland"orifice"to"stylet;"Spic："Spicule"length;"EP："Distancenbsp;from"excretory"pore"to"anterior"end;"c："Body"length"divided"by"tail"length;"c′：""Tail"length"divided"by"body"width"at"anus;"Tail："Tail"length;"—："No"data."All"measurements"are"given"in"units"of"μm."The"range"of"measured"values"are"in"brackets.

雄蟲蟲體蠕蟲形（圖2a），體長（1"071.29±32.99）"μm"（839.84～1"449.94"μm），口針長（19.19±0.41）"μm"（16.05～22.68"μm），背食道腺開口到口針基部球的距離（3.15±0.09）"μm"（2.54～3.97"μm）（圖2b）。尾部鈍圓，殺死后稍向腹面彎曲，交合刺成對，針狀，長（22.56±1.43）"μm"（19.26～26.43"μm）（圖2c）。

2齡幼蟲蟲體細長，兩端稍尖細（圖2d）。體長（375.13±5.76）"μm"（314.38～424.53"μm），唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達，長（10.54±0.30）"μm"（9.21～12.72"μm）（圖2e），口針基部球明顯，呈圓形。背食道腺開口到口針基部球的距離（3.17±0.51）"μm"（2.53～4.60"μm），排泄孔至頭端的距離（67.66±1.64）"μm"（59.76～72.24"μm）。尾長（43.71±0.83）"μm"（35.59～48.32"μm），尾部透明區(qū)清晰（圖2f）。

雌蟲蟲體乳白色，檸檬形或梨形（圖2g），體長（585.86±28.39）"μm"（439.87～854.32"μm），體寬（386.54±12.27）"μm"（303.71～465.35"μm），蟲體前端突出如頸，后端呈圓球形。口針長（11.60±0.28）"μm"（9.42～12.97"μm），背食道腺開口到口針基部球的距離（3.42±0.14）"μm"（2.67～4.38"μm）（圖2h）。中食道球發(fā)達，近圓形，頭端到中食道球中央的距離（65.79±1.33）"μm"（59.34～77.57"μm）。會陰花紋（圖2i）整體呈卵圓形，背弓略平緩，有刻點。這些形態(tài)特征均與北方根結線蟲［28］相符，均在誤差范圍之內。因此，初步將黃芩根結線蟲病的病原鑒定為北方根結線蟲M.hapla。

2.3"分子生物學鑒定

經(jīng)擴增和測序，獲得該線蟲群體的rDNAITS和28S"rDNA"D2/D3序列，大小分別為771"bp和754"bp，GenBank登錄號分別為OP763779和OP765241。經(jīng)BLAST比對分析，這2個序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中北方根結線蟲的序列的相似性分別為99.60%和99.74%（GenBank登錄號：JX024147和MW288147）。

顯示，本研究獲得的北方根結線蟲序列與其他北方

根結線蟲均聚為一支，置信度在95%以上。進一步表明，本研究中引起黃芩根結線蟲病的病原為北方根結線蟲M.hapla。

2.4"特異性引物驗證

經(jīng)特異性引物擴增，得到了1條457"bp的特異性片段，與預期的北方根結線蟲的特異性片段大小一致，而對照樣品沒有此條帶（圖5）。綜上所述，根據(jù)常規(guī)的形態(tài)學特征結合rDNAITS、28S"rDNA"D2/D3區(qū)序列分析和特異性片段擴增結果，將引起黃芩上的根結線蟲鑒定為北方根結線蟲M.hapla。

2.5"根結線蟲群體對黃芩的致病性

接種后40"d，觀察到盆栽植株地上部生長緩慢且葉片黃化，并且根結線蟲侵入黃芩根部，須根上有明顯的根結。對根組織染色結果表明，

線蟲已成功侵染（圖6）。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，每盆黃芩中線蟲平均數(shù)量約為3"994條，繁殖系數(shù)為1.997。

3"結論與討論

目前，國內外研究者大都采用形態(tài)學結合分子生物學方法對根結線蟲進行鑒定，擺脫了單純依靠雌蟲會陰花紋特征鑒定根結線蟲種類的局限性，從而提高了鑒定結果的準確性和可靠性。本研究中，形態(tài)學特征觀察發(fā)現(xiàn)黃芩根結線蟲群體的會陰花紋尾區(qū)有明顯的刻點結構，與謝輝［23］描述的北方根結線蟲會陰花紋特征一致，且雄蟲與2齡幼蟲測量值均與Whitehead［28］所描述的北方根結線蟲測量值相符，且雄蟲的體長、口針長度、背食道開口到口針基球的距離都在誤差范圍內。根據(jù)形態(tài)學鑒定結果，初步將寄生黃芩的根結線蟲鑒定為北方根結線蟲M.hapla。但傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定對研究者在操作技能與研究經(jīng)驗等方面都有較高要求，且根結線蟲雌蟲會陰花紋存在一定程度的種內變異，從而對鑒定結果的精確性造成一定影響［29］。一些不常見的根結線蟲，如德氏根結線蟲M.deconincki、濟南根結線蟲M.jinanensis和隱蔽根結線蟲M.mersa，其會陰花紋也具有刻點結構［30］。因此，需要采用分子生物學方法進一步鑒定。

本研究采用rDNAITS、28S"rDNA"D2/D3序列通用引物進行PCR擴增，獲得2條大小分別為771"bp和754"bp序列片段。與石明明等［18］和楊艷梅等［31］采用相同引物擴增的北方根結線蟲序列大小基本一致，且與石明明等［18］擴增到的北方根結線蟲序列相似度高達99%以上。構建系統(tǒng)發(fā)育樹后進一步明確了黃芩根結線蟲病的病原為北方根結線蟲，鑒定結果準確、可靠。本研究同時采用北方根結線蟲特異性引物MhF/MhR擴增，得到了1條大小為457"bp的特異性片段，與楊佩文等［32］的結果一致。再次證實了寄生黃芩的根結線蟲種類為北方根結線蟲。

北方根結線蟲是危害最為嚴重的根結線蟲之一，主要通過侵染寄主植物的根組織，造成植物的根系形成大小不一的根結，影響寄主植物的生長發(fā)育，嚴重時導致寄主植物根部壞死與腐爛，而且根結線蟲危害植物后更有利于其他病原菌的侵入，極易引起復合侵染［21］，造成更大的經(jīng)濟損失。在中國大部分地區(qū)，比如云南［33］、四川［34］、河北［35］、遼寧［36］、福建［37］、江蘇［38］等地都有北方根結線蟲發(fā)生危害的報道。2007年，常瑾等［8］報道在陜西省北方根結線蟲可以侵染黃芩，但沒有形態(tài)學特征描述和分子生物學特征分析，也沒有對寄主的致病性進行測定。本研究通過室內人工接種的方法，測定了北方根結線蟲對黃芩的致病性。研究結果表明，北方根結線蟲接種黃芩40"d后，其繁殖系數(shù)為1.997，說明了該線蟲種群對黃芩具有較強的致病性。

黃芩作為甘肅省隴西縣重要的經(jīng)濟作物，其根部具有藥用價值，而根結線蟲主要為害寄主植物的根組織，嚴重影響黃芩的質量和品質。因根結線蟲侵染黃芩后植株地上部癥狀大多表現(xiàn)為葉片黃化、萎蔫以及植株矮小，農(nóng)戶多認為是缺水缺肥營養(yǎng)不良所致，進而進行灌水施肥，使得危害更加嚴重。因此，對黃芩根結線蟲病的防治首先要加強宣傳，讓農(nóng)戶了解根結線蟲造成的危害以及癥狀。其次黃芩為多年生植物，種植方式主要為移栽幼苗，而前期調查發(fā)現(xiàn)部分育苗地已發(fā)生根結線蟲病。在種苗調運時，應檢測幼苗是否攜帶根結線蟲;并在移栽前應進行土壤處理，如使用腐熟的有機肥作為底肥，抑制土壤中卵的孵化。必要時建議種植戶將黃芩與小麥、玉米等作物輪作，形成對線蟲生長、發(fā)育不利的環(huán)境。在黃芩生長后期，可以采用微生物菌劑防治根結線蟲，如淡紫紫孢菌Purpureocillium"lilacinum［39］、厚孢輪枝孢和木霉［40］等，這類微生物不僅可以寄生在根結線蟲卵和幼蟲體內使其死亡，而且還可以改善根際周圍微生物種類，進而達到防治的目的。本研究所收集樣本僅局限于甘肅省隴西縣柯寨鎮(zhèn)的黃芩種植區(qū)，要全面準確地掌握該病在甘肅省的發(fā)生情況及危害程度，還需進一步展開深入調查和研究。

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（責任編輯：田"喆）