TaqMan探針雙重實時熒光定量PCR法同步檢測蘭花中的建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒

摘要

為建立一種同步定量檢測建蘭花葉病毒（cymbidium"mosaic"virus，CymMV）和齒蘭環斑病毒（odontoglossum"ringspot"virus，ORSV）的高效檢測方法，本研究根據CymMV和ORSV"CP基因高度保守區分別設計引物和探針并篩選，獲得156"bp和148"bp的靶標序列及對應的最優特異性引物探針組合，建立了基于TaqMan探針的雙重實時熒光定量PCR方法。該方法最低檢出限為1拷貝或6.2×10-3fg，最低穩定檢出限為10拷貝或6.2×10-2"fg，是RTPCR的10～100倍;構建的標準曲線線性關系良好，擴增效率分別為97.7%和100.2%，相關系數R2分別為1.000和0.999;對其他5種常見病毒均無擴增曲線，檢測特異性強;批組內與批組間重復性試驗Ct值變異系數≤0.60%，重復性和穩定性好。利用該方法和基因芯片法分別對4個種屬的66個蘭花樣品進行方法驗證，該方法相較于基因芯片法檢出率提高了53.85%（CymMV）和162.5%（ORSV）。綜上所述，本方法可同時高通量檢測CymMV和ORSV"2種病毒靶基因，結果可靠，應用前景廣闊，可為開展病毒精準鑒定、科學防控以及從源頭遏制病毒傳播提供技術支撐。

關鍵詞

建蘭花葉病毒;"齒蘭環斑病毒;"TaqMan探針;"RTqPCR;"蘭花

中圖分類號：

S"436.81

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023106

Simultaneous"detection"of"cymbidium"mosaic"virus"and"odontoglossum"ringspot"virus"by"TaqMan"duplex"realtime"fluorescence"quantitative"PCR

SUN"Aiqing1，2，"WANG"Lihua1*，"ZHANG"Yiping1，"YANG"Xiumei1，"XU"Feng1，"SU"Yan1

（1."Flower"Research"Institute，"Yunnan"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Yunnan"Key"Laboratory"for"Flower"

Breeding，"National"Engineering"Research"Center"for"Ornamental"Horticulture，"Kunming"650205，"China;"

2."Yunnan"University，"Kunming"650091，"China）

Abstract

To"establish"an"efficient"method"for"synchronous"and"quantitative"detection"of"cymbidium"mosaic"virus"（CymMV）"and"odontoglossum"ringspot"virus"（ORSV），"primers"and"probes"were"designed"and"screened"according"to"the"highly"conserved"regions"of"CymMV"and"ORSV"CP"genes."156"bp"and"148"bp"target"sequences"and"the"corresponding"optimal"specific"primers"and"probe"were"obtained，"and"the"TaqMan"duplex"realtime"fluorescent"quantitative"PCR"were"established."The"minimum"detection"limit"was"1"copy"or"6.2×10-3"fg."The"minimum"stable"detection"limit"was"10"copies"or"6.2×10-2"fg，"whose"sensitivity"is"10-100"times"as"much"as"that"of"RTPCR."The"standard"curve"showed"a"good"linear"relationship"with"the"amplification"efficiencies"of"97.7%"and"100.2%，"respectively，"and"the"correlation"coefficient"R2"of"1.000"and"0.999，"respectively."There"was"no"amplification"curve"for"the"other"five"common"viruses，"indicating"the"method"was"very"specific."The"intra"and"interassay"CVs"of"Ct"values"was"less"than"0.60%，"indicating"the"method"was"of"good"repeatability."In"addition，"66"leaves"from"four"different"orchid"genera"were"analyzed"using"the"established"method"and"gene"chip"assay，"and"the"detection"rate"of"this"method"was"53.85%（CymMV）"and"162.5%（ORSV）"higher"than"that"of"gene"chip"assay，"respectively."In"conclusion，"the"TaqMan"duplex"assay"established"in"this"study"can"detect"CymMV"and"ORSV"simultaneously"with"reliable"results，which"has"a"board"prospect"of"application"and"can"provide"technical"support"for"accurate"virus"identification，"scientific"prevention"and"control，"and"containment"of"virus"transmission"from"the"source.

Key"words

cymbidium"mosaic"virus"（CymMV）;"odontoglossum"ringspot"virus"（ORSV）;"TaqMan"probe;"qRTPCR;"orchid

目前世界上已知有30多種病毒可感染蘭科植物［1］，其中建蘭花葉病毒（cymbidium"mosaic"virus，CymMV）和齒蘭環斑病毒（odontoglossum"ringspot"virus，ORSV）在蘭花中最常見，分布最廣，危害最嚴重。據筆者不完全調查，在表現病毒癥狀的樣品中該2種病毒復合侵染率占90%以上，有研究表明病毒單獨侵染蘭花時，對其生長影響有限，但2種或以上病毒復合侵染時，則病癥表現嚴重，其危害程度具備1+1gt;2的復合加成特性，對觀賞價值和商品價值影響較大［23］。目前，市售針對病毒的農藥多為通過殺蟲，病毒鈍化或核酸、脂蛋白破壞，啟動植物免疫系統而增強抗病能力等原理開發的，無法有效治療和徹底清除病毒，因此開展病毒的早檢測、早發現、早隔離，及時采取防治措施，對提高產品質量、減少田間損失尤為重要。CymMV屬于馬鈴薯X病毒屬Potexvirus病毒，病毒粒子呈線狀，蘭花感染該病毒后，呈現黃化、壞死、環斑、畸形生長等癥狀［4］，主要傳播途徑有汁液感染、蚜蟲傳播和機械接觸傳染，也可隨植物種子進行傳播［56］。ORSV屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus單鏈"RNA"病毒，病毒粒子呈直桿狀，感染該病毒后癥狀有嵌紋、斑紋、黃化條紋、環斑、花色條斑等多種情況。通過傷口侵染是齒蘭環斑病毒傳播的主要途徑，因此，與病株直接接觸、使用被病株污染過的器具等都可能傳播該病毒［4］。自1983年朱本明等［7］首次發現這2種病毒后，有關該2種病毒侵染我國蘭花的報道陸續有發表。目前，檢測CymMV和ORSV的方法主要有自然接種形態學鑒定、血清學檢測、RTPCR法和實時熒光定量PCR法［810］。謝林娜等［11］于2017年利用ELISA法檢測不同蘭花品種CymMV和ORSV的帶毒率;Kim等［12］于2015年建立了同時檢測CymMV和ORSV的雙重RTPCR檢測方法;Ali等［13］于2014年建立了同時檢測CymMV、ORSV和蘭花斑點病毒（orchid"fleck"virus，OFV）的三重RTPCR檢測方法;2017年，梁芳等［14］建立了基于SYBR"Green"I的CymMV實時熒光定量檢測方法。對于特異性強、靈敏度高的TaqMan探針RTqPCR法僅聞偉剛等［15］、Eun等［16］有過報道，但聞偉剛等建立的方法僅限于單基因的檢測，耗時長且成本高;Eun等建立的同步檢測法，2個病毒檢出限僅為104"拷貝或5"fg，對于原種核心材料等的痕量檢測存在靈敏度偏低的問題。本研究根據CymMV和ORSV外殼蛋白（coat"protein，CP）基因序列高度保守區設計特異性引物探針組合，建立了基于TaqMan探針的雙重實時熒光定量PCR檢測方法，該方法具有快速高效、特異性強、靈敏度高及可定量檢測帶毒量的特點，其檢測時間及人力、財力和物力成本僅為單基因RTqPCR方法的1/3～1/2，可為痕量病毒的精準檢出、病毒病的早發現及科學防控以及從源頭遏制病毒傳播提供技術支撐。

1"材料與方法

1.1"供試材料

感染CymMV、ORSV單一病毒或2種病毒的感病植株以及健康蝴蝶蘭植株均取自云南省紅河哈尼彝族自治州開遠市，建蘭環斑病毒（cymbidium"ringspot"virus，"CymRSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber"mosaic"virus，"CMV）、煙草花葉病毒（tobacco"mosaic"virus，"TMV），香石竹斑駁病毒（carnation"mottle"virus，"CarMV）、百合斑駁病毒（lily"mottle"virus，"LMoV）單一病毒陽性凍干粉樣品購自Agdia公司，保存于本實驗室。所有樣品經RTPCR及DASELISA檢測后確定攜帶目標病毒。

主要試劑：植物RNA提取試劑盒、熒光定量反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、膠回收試劑盒、克隆所需載體pMD19T"Vector、大腸桿菌感受態細胞、質粒提取試劑盒和基于TaqMan"的實時熒光定量PCR試劑盒均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，CymMV+ORSV基因芯片試劑盒購自巨合生物科技股份有限公司，DASELISA試劑盒購自Agdia公司。

1.2"引物、探針設計與篩選

下載GenBank中NP054029.1、AB693982.1、AM236030.1、MG774930.1等10條CymMV"CP基因片段序列和MN057680.1、HQ644131.1、MG821323.1、EU683879.1、MN027920.1等15條ORSV外殼蛋白基因片段序列，應用DNAMAN軟件進行同源性分析比對，在序列的高度保守區采用Primer"Premier"5.0軟件分別設計CymMV和ORSV的3對特異性引物和3條探針。為保證引物特異性，將其在NCBI中進行PrimerBLAST比對，引物合成后通過RTPCR進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，選擇產生明亮且單一條帶的1對引物進行TB"Green染料法驗證，后分別篩選出熔解曲線好且擴增效率高的最優引物對和對應探針（表1），其中CymMVProbe和ORSVProbe的熒光基團分別設計為FAM和HEX，淬滅集團均為BHQ1。引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3"RNA"提取及反轉錄"cDNA"合成

利用植物總RNA提取試劑盒分別對只攜帶有CymMV和ORSV病毒的蝴蝶蘭葉片進行總RNA提取，提取的RNA樣本可直接用于反轉錄或-80℃保存備用，RNA反轉錄按照PrimeScript"RT"reagent"Kit"with"gDNA"Eraser的操作說明進行，獲得cDNA于-20℃保存備用。

1.4"病毒質粒標準品制備

以CymMV和ORSV的cDNA為模板，分別利用表1中的特異性引物對進行PCR擴增，PCR反應體系為：10×Ex"Taq"Buffer"2.5"μL，dNTP"Mixture"2.5"μL，Ex"Taq"0.25"μL，10"μmol/L上、下游引物各"0.5"μL，cDNA"2"μL，RNase"Free"ddH2O"16.75"μL。反應程序：95℃"5"min;94℃"30"s，58℃"30"s，72℃"1"min，35"個循環;72℃"10"min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序驗證。PCR產物純化回收后分別克隆至pMDTM"19T載體，轉化至DH5α感受態細胞，篩選并提取陽性克隆的質粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將構建好的CymMV和ORSV的質粒分別用Hind"III酶切線性化，取5"μL酶切產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行膠回收，利用NanoDrop分光光度儀測定膠回收產物的濃度，根據公式將質粒標準品濃度換算成拷貝數，即質?？截悢?質粒濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023/（660×重組質粒堿基數），計算得出CymMV重組質?？截悢禐?.5×1010拷貝/μL，ORSV重組質?？截悢禐?7.7×109拷貝/μL，將CymMV和ORSV質粒濃度均稀釋為5×109拷貝/μL，等體積混合并用EASY"Dilution以10倍濃度梯度依次稀釋至5×10-1拷貝/μL，稀釋的混合質粒用于雙重實時熒光定量檢測質粒標準品。

1.5"實時熒光定量"PCR"檢測體系的優化

按照Premix"Ex"TaqTM"（Probe"qPCR）試劑盒說明書配制25"μL實時熒光定量PCR反應體系：Premix"Ex"Taq"（2×）12.5"μL，模板2.0"μL，上、下游引物各0.5"μL，探針1.0"μL，"RNase"free"ddH2O"8.5"μL;反應條件為95℃"30"s;95℃"5"s，"60℃"30"s，40個循環。在不同退火溫度（58、59、60℃）、引物終濃度（1、10、20、50"μmol/L）及探針終濃度（1、10、20、50"μmol/L）條件下進行實時熒光定量PCR反應體系和條件的優化。在2個病毒反應體系單獨優化的基礎上通過對雙重實時熒光定量PCR的退火溫度、引物濃度和探針濃度等微調進行優化，根據擴增反應的Ct值和擴增曲線的RFU值確定最佳的雙重實時熒光定量PCR反應體系及反應條件。

1.6"特異性檢測

用優化好的反應體系和反應條件對CymMV和ORSV雙重檢測體系進行特異性檢測，以含有2種病毒的質粒稀釋品為陽性對照，RNase"Free"ddH2O為陰性對照，已確定攜帶有CymMV和ORSV"2種病毒，只攜帶有CymMV、ORSV、CymRSV、CMV、TMV、CarMV、LMoV單一病毒的cDNA樣品進行CymMV和ORSV雙重實時熒光定量PCR特異性檢測。

1.7"實時熒光定量"PCR"標準曲線的建立

選取5×101～5×108拷貝/μL的8個稀釋梯度的混合質粒標準品為模板，RNase"Free"ddH2O為陰性對照，每個梯度設3個重復，采用優化后的反應條件進行擴增，獲得擴增動力學曲線。以標準品起始拷貝數的常用對數（lgC）為橫坐標，以循環閾值（Ct值）為縱坐標，制作標準線性回歸方程（標準曲線）。根據實時熒光定量PCR標準曲線的相關系數、斜率、擴增效率等驗證該方法的有效性。

1.8"靈敏度檢測

以5×10-1～5×108拷貝/μL"10個梯度的混合質粒標準品為模板，RNase"Free"ddH2O為陰性對照，每個梯度設3個重復，用優化后的雙重實時熒光定量PCR方法進行檢測，檢驗其靈敏度。并利用上述梯度溶液進行PCR擴增及凝膠電泳檢測，分析和比較2種方法的靈敏度。

1.9"重復性試驗

選取濃度為5×102、5×103、5×105、5×106、5×107拷貝/μL"5個濃度的混合質粒標準品作為模板，利用建立的TaqMan實時熒光定量PCR體系進行擴增，每個梯度設置3個重復（批組內），同時設置RNase"Free"ddH2O為陰性對照，并在不同時間分次開展3次重復性試驗（批組間），分別計算批組內、批組間的平均Ct值、標準偏差（standard"deviation，SD）和變異系數（coefficient"of"variation，CV），變異系數計算公式為：變異系數（CV）＝標準差（SD）/均數×100%。

1.10"田間抽檢樣品檢測應用

從云南省紅河哈尼彝族自治州開遠市隨機采集夢香蘭、文心蘭、紫香蘭、蝴蝶蘭等不同種屬的66株樣品，分別將這66株蘭花樣品提取總RNA并反轉錄為cDNA，RNase"Free"ddH2O為陰性對照，混合質粒標準品為陽性對照，采用已建立的CymMV、ORSV雙重"TaqMan探針熒光定量PCR方法對其進行檢測，并同時采用基因芯片法按照蘭花病毒檢測芯片試劑盒說明書對其進行復測驗證，比較2種方法的檢測結果，評價其田間檢測實用性。

2"結果與分析

2.1"構建CymMV、ORSV質粒標準品

分別用CymMVF/R和ORSVF/R對構建的CymMV、ORSV"CP基因靶標序列重組陽性質粒進行PCR擴增。結果顯示，目的片段分別為156"bp和148"bp，與預期大小相符。陽性質粒測序結果與靶標序列相似性為100%，表明重組質粒構建成功。

2.2"雙重實時熒光定量PCR體系的優化

通過優化單病毒熒光定量體系，選擇熒光強度高，擴增效率（E）接近100%、相關系數（R2）接近1的體系，獲得CymMV的最優反應條件為：引物濃度20"μmol/L，探針濃度10"μmol/L，退火溫度58℃;ORSV的最佳反應條件為：引物濃度10"μmol/L，探針濃度10"μmol/L，退火溫度60℃。經優化（圖1），雙重TaqMan實時熒光定量PCR的最佳反應體系（25"μL）："Premix"Ex"Taq（2×）混合液12.5"μL，CymMV上、下游引物各0.6"μL，探針1.2"μL，ORSV"上、下游引物各0.5"μL，探針1.0"μL，模板為重組質粒標準品等體積混合物2"μL，RNase"Free"ddH2O"6.1"μL。擴增程序為：95℃"30"s;95℃"5"s，60℃"30"s，40個循環，同時收集熒光信號。

2.3"雙重實時熒光定量PCR特異性檢測

采用建立的CymMV、ORSV雙重TaqMan探針熒光定量PCR方法對陽性質粒、已知同時攜帶CymMV+ORSV的樣品、分別攜帶CymMV、ORSV、CymRSV、CMV、TMV、CarMV及LMoV單病毒的樣品進行檢測，以RNase"Free"ddH2O為陰性對照，結果如圖2所示，陽性質粒、同時攜帶CymMV+ORSV的待測樣品在FAM和HEX熒光信號下均有擴增曲線，攜帶CymMV或ORSV單一病毒的樣品只在各自熒光信號下有擴增曲線，且Ct值在20～28之間，陰性對照和其余樣品均未出現擴增曲線，表明本試驗建立的雙重實時熒光定量PCR體系具有良好的特異性。

2.4"標準曲線的建立

以5×101～5×108"拷貝/μL"8個梯度的混合質粒標準品為模板，以2.1獲得的最佳優化條件進行雙重實時熒光定量PCR擴增，得到擴增曲線和標準曲線（圖3）。CymMV的標準曲線為y=-3.379x+41.079，R2為1.000，擴增效率為97.7%;ORSV的標準曲線為y=-3.316x+40.781，R2為0.999，擴增效率為100.2%。結果顯示所建立的雙重實時熒光定量PCR體系的熒光曲線與病毒濃度之間相關性好，準確性高。

2.5"靈敏度檢測

利用所建立的雙重實時熒光定量PCR檢測體系對10個濃度梯度的陽性質粒標準品開展靈敏度檢測（5×10-1～5×108拷貝/μL），結果表明，CymMV和ORSV的最低檢出限均為1拷貝，最低穩定檢出限均為10拷貝（圖4），通過換算得出最低檢出濃度和最低穩定檢出濃度分別為6.2×10-3fg和6.2×10-2"fg。利用同批試驗樣品進行CymMV、ORSV的RTPCR檢測，該2種病毒的檢出限均為100拷貝即6.2×10-1fg（圖5），表明本試驗所開發的雙重實時熒光定量PCR檢測體系的檢測靈敏度較傳統RTPCR提高了10～100倍。

2.6"重復性試驗

以5×102、5×103、5×105、5×106、5×107拷貝/μL"5個濃度的混合陽性質粒為模板，進行雙重實時熒光定量PCR檢測，分別驗證該方法批組內和批組間的重復性和穩定性。如表2所示，同一濃度3個重復的組內Ct值及組間Ct值的標準差為0.014～0.124，變異系數CV為0.06%～0.60%，變異系數在允許范圍內，說明本試驗建立的雙重實時熒光定量PCR檢測技術具有較高的可靠性和準確性。

2.7"田間抽樣檢測結果

采用本試驗所建立的雙重實時熒光定量PCR檢測法和基因芯片法對蝴蝶蘭、紫香蘭、文心蘭和石斛蘭等66個抽檢樣品進行了CymMV和ORSV感染狀況檢測?；蛐酒z測結果中CymMV和ORSV的陽性率分別為19.70%（13/66）、12.12%（8/66），雙重實時熒光定量檢測結果中CymMV和ORSV的陽性率分別為30.30%"（20/66）、31.82%"（21/66）。從2種方法CymMV/ORSV的檢測結果來看，基因芯片法2個病毒檢出為陽性的13個和8個樣品，本研究所建立的方法檢出結果同樣為陽性;基因芯片法檢出為陰性的53個和58個樣品中，利用本研究建立的方法有7個和13個樣品檢出結果為陽性，其余46個和45個樣品為陰性。結果表明本試驗所建的檢測方法靈敏度高且結果可靠，檢測敏感性比基因芯片法提高53.85%（CymMV）和162.5%（ORSV），可以用于批量樣品的CymMV和ORSV定量高效檢測，特別在脫毒原原種、原種等核心種源的早期病毒監測應用前景廣闊。

3"結論與討論

病毒病俗稱“龍頭病”，一旦感染很難徹底治愈，被稱為植物的癌癥，每年我國各類農作物由于感染病毒病造成了不同程度的減產甚至絕收，如何防控病毒病成為當今的世界級難題。隨著全球花卉種質資源交換頻率的增加，植物材料攜帶病毒入侵的風險也逐漸增加。目前對病毒的檢測方法主要有電鏡法、酶聯免疫吸附法、分子生物學方法等。電鏡法費時，設備昂貴，且要求檢測者對病毒形態學特征有非常專業的了解，知識結構層次較高;ELISA法周期性長，靈敏度為ng級水平，從操作及成本考慮適用于大批量樣品的篩檢和監測，但對于痕量病毒的檢測，其檢出率較為受限，如脫毒組培苗等的病毒早期診斷，該方法的敏感度和準確度難以達到要求;RTPCR等分子生物學方法相比ELISA法，在植物病毒的檢測中靈敏度大大提升，且特異性強，靈敏度達fg級，但在PCR過程中存在非靶基因非特異性擴增而出現假陽性的風險，且僅為定性檢測。基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR檢測技術不僅實現了由RTPCR定性到定量的飛躍，而且一定程度上彌補了RTPCR在假陽性、高效性、特異性、靈敏度等方面的缺陷［17］，在脫毒原原種等核心材料的病毒早期診斷及痕量病原菌的高效檢測等方面應用效果顯著，目前已廣泛應用于細菌［18］、真菌［19］、病毒［20］、植原體［21］和線蟲［22］等領域的檢測。

CymMV和ORSV是侵染蘭科植物最重要的兩種檢疫性植物病毒［23］，據宋海超等［24］的報道，此2種病毒能廣泛侵染蘭科的多種植物，侵染種類達到20多種且危害較為嚴重。因此，建立能同時檢測2種病毒的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法非常重要。本研究通過RTPCR和TB"Green法篩選高特異性的最優引物探針組合，并在單基因病毒檢測引物、探針濃度及退火溫度優化的基礎上，對雙重檢測體系的關鍵因子進行了再次優化，獲得了雙重同步檢測的最佳反應體系和反應條件。特異性擴增曲線顯示，CymRSV、CMV、TMV、CarMV、LMoV和陰性對照均無擴增曲線，陽性對照及攜帶CymMV、ORSV單一病毒或2種病毒的樣品都有其對應目標序列擴增，再次證實了本方法引物探針的特異性。本試驗建立的CymMV、ORSV同步檢測體系擴增效率高，具有實用性、準確性強等優點，批組內及批組間的變異系數均小于0.65%，說明本方法重復性好、穩定性高。靈敏度試驗結果表明，CymMV、ORSV最低檢出限為1拷貝或6.2×10-3fg，最低穩定檢出限為10拷貝或6.2×10-2"fg，比RTPCR方法提高了10～100倍，比Eun等［16］的檢出限提高了103～104倍，說明本研究建立的雙重實時熒光定量PCR法具有較強的檢測靈敏度，可獲得較高的檢出率和準確率，66個田間抽檢樣品的檢測應用結果也說明本研究建立的技術體系相比基因芯片法檢出率大幅度提高。此外，為進一步驗證本研究的準確性，本試驗還對該66個田間抽檢樣品開展了CymMV、ORSV病毒的DASELISA檢測，結果顯示Ct值小于23的樣品，DASELISA檢測結果也為陽性;Ct值大于23的樣品，DASELISA檢測結果為陰性，這也進一步證實本研究建立的方法的高靈敏性。

綜上所述，本研究建立的TaqMan雙重實時熒光定量檢測法可同時定量、高效、特異、靈敏地檢測CymMV和ORSV，有利于實現帶毒苗木/盆花的早發現、早隔離、早預防，從而提高蘭花產品質量和企業經濟效益，助力蘭花種業健康發展。

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