液相色譜串聯質譜法檢測草銨膦、草甘膦及其代謝物在水和土壤中的殘留

摘要

利用超高效液相色譜串聯質譜儀（UHPLCMS/MS），結合固相萃取凈化建立了在水和土壤中同時快速測定草甘膦、草銨膦及其6種代謝物的多殘留分析方法。前處理采用Oasis"MCX和Oasis"MAX固相萃取柱提取，2%甲酸甲醇水（體積比為1∶1）洗脫，旋干后0.1%氨水定容，UHPLCMS/MS檢測。方法的線性范圍為0.02～0.5"mg/L;在水中添加水平為0.000"1"mg/L和0.001"mg/L時，草甘膦、草銨膦及其代謝物的回收率為72.8%～94.2%，RSD為2.3%～16.1%;土壤中添加水平為0.001"mg/kg和0.01"mg/kg時，草甘膦、草銨膦及其代謝物的回收率為70.6%～88.5%，RSD為3.6%～12.8%。本方法準確、靈敏、全面，適用于草甘膦、草銨膦及其代謝物在水土環境中的殘留檢測及監測。

關鍵詞

水和土壤;"草銨膦;"草甘膦;"代謝物;"UHPLCMS/MS;"殘留檢測

中圖分類號：

S"481.8

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023115

Determination"of"glufosinateammonium，"glyphosate"and"their"metabolites"in"soil"and"water"by"HPLCMS/MS

JI"Leyuan，"WANG"Pingping，"ZHU"Lizhen，nbsp;MAO"Liangang，"ZHANG"Lan，"JIANG"Hongyun，"LIU"Xingang*

（State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"

Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China）

Abstract

An"ultrahigh"performance"liquid"chromatographytandem"mass"spectrometry"（UHPLCMS/MS）"combined"with"solidphase"extraction"purification"was"used"to"establish"a"multiresidue"analysis"method"for"the"simultaneous"determination"of"glyphosate，"glufosinateammonium"and"their"six"metabolites"in"water"or"soil."Oasis"MCX"and"Oasis"MAX"solid"phase"extraction"columns"were"used"in"pretreatment，"and"then"2%"formic"acid"methanol"water"（volume"ratio"of"1∶1）"was"used"for"elution."The"eluent"collected"was"evaporated"to"dryness"by"a"rotary"evaporator"and"diluted"with"0.1%"ammonia."The"linear"range"of"the"method"was"0.02-0.5"mg/L."Under"the"spiked"level"of"0.000"1"and"0.001"mg/L"in"the""purified"water，"the"recoveries"were"72.8%-94.2%"and"the"relative"standard"deviations"were"2.3%-16.1%，"respectively."Under"the"spiked"level"of"0.001"mg/kg"and"0.01"mg/kg"in"the"soil，"the"recoveries"were"70.6%-88.5%"and"the"relative"standard"deviations"were"3.6%-12.8%，"respectively."The"method"is"accurate，"sensitive"and"comprehensive，"which"could"be"used"to"analyze"the"content"of"glyphosate，"glufosinateammonium"and"their"metabolites"in"low"concentration"samples"in"environmental"test.

Key"words

water"and"soil;"glufosinateammonium;"glyphosate;"metabolite;"UHPLCMS/MS;"residue"

analysis

草甘膦、草銨膦分別是由原美國孟山都公司和原德國赫斯特公司開發的氨基酸類除草劑。草甘膦、草銨膦因為其高效廣譜的特性，常常被用于防除各種常見雜草。隨著耐除草劑作物的大量種植，草甘膦、草銨膦的使用量呈現爆發式增長，草甘膦、草銨膦已分別成為全球第一、第二大除草劑［1］。

草銨膦的水溶性很強，易轉移到水生環境中［2］，并且在水中穩定，不易被生物降解。在土壤中，草甘膦主要被降解為氨甲基膦酸（aminomethy"lphosphonic"acid，AMPA），草銨膦可以被降解為3（甲基膦基）丙酸（3methylphosphinicopropionic"acid，MPP）和2（甲基膦基）乙酸（2methylphosphinicoacetic"acid，MPA）［3］。草甘膦和草銨膦在施用于耐除草劑作物時，分別會產生N乙酰基草甘膦、N乙酰基AMPA和N乙酰草銨膦（NAG）等代謝物［4］。根據EFSA（European"Food"Safety"Authority）報告，MPP為高流動性，MPA為高至中等流動性，并且MPP有污染脆弱地區地下水的風險。MPP和MPA在土壤中具有低到中等持久性。耐除草劑植物的代謝物NAG在土壤中的持久性很低，但是，如果種植后大部分作物留在田間，其對環境的影響就不可估計［56］。受作物種植結構調整，尤其是耐除草劑作物的大面積推廣的影響，草甘膦和草銨膦等除草劑的使用量會大幅度增長，其對環境的風險問題理應受到關注。

目前，關于草甘膦的研究主要集中在母體及其代謝物AMPA，草銨膦的研究主要集中于母體和代謝產物MPP［711］，對其他代謝物的分析方法研究較少。草甘膦、草銨膦類農藥缺乏紫外生色基團，且含有膦酸基和氨基酸基兩性基團，具有極性強、水溶性大的特性［12］，并且農藥在環境介質中殘留屬于痕量水平，普通的氣相和液相色譜分析方法很難滿足分析要求，因此監測和分析這類除草劑的使用影響仍然是一項挑戰。文獻和標準中草甘膦、草銨膦及其代謝物的前處理方法多采用衍生化法，但衍生化法復雜且耗時費力。近年來，孫文閃等［910］建立了生活飲用水和土壤中的草銨膦、草甘膦和草甘膦代謝物氨甲基膦酸的檢測方法，但是缺乏對草銨膦主要代謝物的檢測。平華等［11］建立的土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物的檢測方法，定量限高且缺少對草銨膦代謝物MPA、NAG等的檢測。目前關于水土中草甘膦、草銨膦和它們的代謝物等8種化合物同時測定的方法尚未見報道，本文擬利用超高效液相色譜串聯質譜結合固相萃取凈化建立對上述化合物的分析方法，為研究其在水土環境的歸趨行為提供可靠的技術支撐。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

草甘膦標準品（純度99.40%），國家農藥質量監督檢驗中心（沈陽）;草甘膦代謝物N乙酰基草甘膦標準品（純度99.30%）、草甘膦代謝物AMPA標準品（純度98.00%）、草甘膦代謝物N乙酰基AMPA標準品（純度96.70%）均來自天津阿爾塔科技有限公司;草銨膦標準品（純度98.84%），上海葉源生物科技有限公司;草銨膦代謝物3MPPA標準品（純度99.9%），First"Standard天津阿爾塔科技有限公司;草銨膦代謝物MPA標準品（純度97.0%），加拿大TLC醫藥化工有限公司;草銨膦代謝物NAG標準品（純度92.6%），北京曼哈格生物科技有限公司。

甲醇（色譜純），默克股份兩合公司;甲酸（≥98%，色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Waters"Oasis"MAX固相萃取柱（6"mL，500"mg），Waters"Oasis"MCX固相萃取柱（6"mL，500"mg）;純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2"儀器設備

超高效液相色譜儀質譜聯用儀（SCIEX"QTRAP"4500，SCIEX公司）;0.000"01"g電子天平［BT25S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］;0.01"g電子天平（JY6002，上海衡平儀器儀表廠）;旋轉蒸發儀（RV10，德國IKA）;恒溫振蕩培養箱（HZQX100型，太倉豪誠實驗儀器制造有限公司）;高速離心機（75007211，美國Thermo）。

1.3"分析檢測方法

1.3.1"儀器方法

色譜條件：色譜柱為Metrosep"A"Supp"5色譜柱（4.0"mm×150"mm，5"μm）;柱溫箱溫度為40℃;進樣體積為50"μL;流動相為200"mmol/L碳酸氫銨含0.1%氨水的水溶液（A）和超純水（B）;流速0.600"mL/min;洗脫梯度為：0→0.5"min，10%"A;0.5→1.0"min，10%"A→40%"A;1.0→4.0"min，40%A→80%A;4.0→5.0"min，80%"A→82.5%"A;5.0→6.0"min，82.5%"A→95%A;6.0→7.0"min，95%"A;7.0→7.1"min，95%"A→10%"A;7.1→10.0"min，10%"A。

質譜條件：電離方式為電噴霧電離（ESI），負離子;離子源噴針電壓為-4"500"V;離子源溫度為600℃;氣簾氣35"L/min;離子源氣1為55"L/min;離子源氣2為45"L/min。質譜信息見表1。

1.3.2"前處理方法

取300"mL純凈水于500"mL玻璃瓶中，全部載入MAX"SPE小柱，并用10"mL純凈水沖洗玻璃瓶，棄去濾液，用5"mL甲醇淋洗SPE小柱，棄去淋洗液;再用15"mL"2%甲酸甲醇水（體積比為1∶1）洗脫SPE小柱，收集洗脫液并將其45℃旋轉蒸發至干，1"mL"0.1%氨水定容，0.22"μm濾膜過濾，待測。

取40"g（精確至0.01"g）土樣于250"mL三角瓶中，加入80"mL純凈水，在恒溫振蕩器上振蕩60"min后，轉移至100"mL離心管中;置于臺式高速離心機以4"000"r/min速度離心5"min，取上清液60"mL，全部載入SPE小柱（MCX串聯MAX），棄去濾液后用5"mL甲醇淋洗MAX"SPE小柱，棄去淋洗液;再用15"mL"2%甲酸甲醇水（體積比為1∶1）洗脫SPE小柱，收集洗脫液并將其45℃旋轉蒸發至干，1"mL"0.1%氨水定容，0.22"μm濾膜過濾，待測。

1.3.3"標準曲線配制及標準曲線繪制

準確稱取各標準品，并用超純水定容，配制成質量濃度為100"mg/L的標準儲備液。然后分別取1"mL上述標準儲備液用超純水定容至10"mL容量瓶中，配制成濃度為10"mg/L的草甘膦、草銨膦及其代謝物的混合標準溶液。

溶劑標準曲線：取10"mg/L草甘膦、草銨膦及其代謝物的混合標準溶液，用超純水或水土基質空白提取液稀釋為0.5、0.3、0.1、0.05、0.03、0.02"mg/L的系列標準溶液，按1.3.1條件進行測定。分別以草甘膦、草銨膦及其代謝物的質量濃度（mg/L）為橫坐標、相應的峰面積（μVs）為縱坐標作圖，繪制標準曲線。

1.3.4"基質效應

基質往往會產生基質增強或抑制的效應，從而影響分析結果的精密度和準確性。此外，基質效應可受不同類型的基質、農藥和各種樣品處理程序的影響［13］。按照濃度相同的基質標準溶液和溶劑標準溶液的峰面積比值的方法對目標農藥及其代謝產物在水土中的基質效應進行評價。

1.3.5"添加回收試驗

在供試純凈水和土壤中進行加標回收試驗，純凈水中草甘膦、草銨膦及其代謝物添加水平分別為0.000"1"mg/L和0.001"mg/L，土壤中添加水平分別為0.001"mg/kg和0.01"mg/kg，每個濃度水平各設5個重復，同時設不加藥的空白對照，按上述儀器條件和樣品前處理方法進行分析檢測，計算添加回收率及相對標準偏差（RSD）。

2"結果與分析

2.1"線性范圍、定量限

純凈水和土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物的線性結果見表2，相關系數均大于0.990。結果表明，草甘膦、草銨膦及其代謝物在0.02～0.5"mg/L區間內，線性關系良好。方法的定量限低、靈敏度高。

2.2"基質效應評價

純凈水和土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物的基質效應結果如表2所示，水中的基質效應為2.4%～8.4%;土壤中的基質效應為5.7%～42.0%。綜合考慮，本試驗使用基質標準溶液進行定量分析，以減少基質效應的影響。

2.3"準確度和精密度

準確度用回收率表示，精密度用相對標準偏差（RSD）表示。加標回收率試驗結果見表3。在純凈水和土壤中分別添加2個水平的7種物質的標準混合溶液，平行測定5次，以基質標為基準計算回收率。純凈水中添加水平為0.000"1"mg/L和0.001"mg/L時，草甘膦、草銨膦及其代謝物的回收率為72.8%～94.2%，RSD為2.3%～16.1%;土壤中添加水平為0.001"mg/kg和0.01"mg/kg時，草甘膦、草銨膦及其代謝物的回收率為70.6%～88.5%，RSD為3.6%～12.8%。表明該方法準確度好，精密度高。

3"結論與討論

本研究利用超高效液相色譜串聯質譜儀，結合固相萃取凈化，參照NY/T"31512017《農藥登記"土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南》［14］，建立了在水和土壤中快速同時檢測草甘膦、草銨膦及其代謝物共8種化合物的檢測方法。該方法的靈敏度、準確度和精密度、再現性等均滿足農藥殘留分析要求。草甘膦、草銨膦及其代謝物在水中的平均回收率為72.8%～94.2%，相對標準偏差為2.3%～16.1%;草甘膦、草銨膦及其代謝物在土壤中的平均回收率為70.6%～88.5%，相對標準偏差為3.6%～12.8%。草甘膦、草銨膦及其代謝物在水中的定量限均為0.000"1"mg/L，在土壤中的定量限均為0.001"mg/kg。與已建立的方法相比，該方法首次將草銨膦代謝物MPA、NAG和草甘膦代謝物N乙酰基草甘膦、N乙酰基AMPA等納入監測，為草甘膦和草銨膦在環境中的安全風險評估提供了技術方法和數據支持。

參考文獻

［1］"楊益軍，"張波."2021年全球氨基酸類除草劑發展概況和趨勢綜述［J］."世界農藥，"2021，"43（4）："1934.

［2］"MOON"J"M，"CHUN"B"J."Serial"ammonia"measurement"in"patients"poisoned"with"glufosinate"ammonium"herbicide"［J］."Human"amp;"Experimental"Toxicology，"2016，"35（5）："554561.

［3］"ZHANG"Yun，"WANG"Kai，"WU"Junxue，"et"al."Field"dissipation"and"storage"stability"of"glufosinate"ammonium"and"its"metabolites"in"soil"［J/OL］."International"Journal"of"Analytical"Chemistry，"2014："256091."DOI："10.1155/2014/256091.

［4］"王琳權，"王寬，"李如男，"等."我國轉基因耐除草劑作物現狀及目標除草劑登記管理要求［J］."現代農藥，"2022，"21（3）："610.

［5］"AUTHORITY"E"F"S."Conclusion"regarding"the"peer"review"of"the"pesticide"risk"assessment"of"the"active"substance"glufosinate"［J］."EFSA"Journal，"2005，"27：181.

［6］"AUTHORITY"E"F"S."Conclusion"on"the"peer"review"of"the"pesticide"risk"assessment"of"the"active"substance"glyphosate"［J/OL］."EFSA"Journal，"2015，"13（11）："4302."DOI："10.2903/j.efsa.2015.4302.

［7］"張月，"呂岱竹，"韓丙軍，"等."超高效液相色譜串聯質譜法測定咖啡鮮果中草銨膦及其代謝產物殘留［J］."農藥學學報，"2014，"16（6）："734739.

［8］"WANG"Kuan，"GENG"Yue，"DONG"Zhe，"et"al."Simultaneous"determination"of"glyphosate，"glufosinate"ammonium"and"their"metabolites"in"maize"and"soybean"by"ultraperformance"liquid"chromatography"with"tandem"mass"spectrometry"［J］."Analytical"Methods，"2022，"14（39）："38503858.

［9］"孫文閃，"周婷婷，"諸駿杰，"等."超高效液相色譜串聯質譜法快速測定生活飲用水中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留［J］."食品安全質量檢測學報，"2020，"11（6）："17221727.

［10］孫文閃，"諸駿杰，"鐘寒輝，"等."固相萃取凈化超高效液相色譜三重四極桿質譜法測定土壤中草銨膦、草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸［J］."理化檢驗（化學分冊），"2021，"57（4）："322326.

［11］平華，"趙芳，"李成，"等."高效液相色譜串聯質譜法快速同時測定土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物［J］."色譜，"2022，"40（3）："273280.

［12］DELMA"D"L，"MICHLIG"N，"GAGGIOTTI"M，"et"al."Determination"of"glyphosate，"AMPA"and"glufosinate"in"dairy"farm"water"from"Argentina"using"a"simplified"UHPLCMS/MS"method"［J］."Science"of"the"Total"Environment，"2018，"645："3443.

［13］靳雅楠，"魏昭，"賈紅霞，"等."農藥殘留檢測中基質效應的研究［J］."食品安全導刊，"2022（28）："172174.

［14］中華人民共和國農業部."農藥登記"土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南［S］."北京："中國農業出版社，"2017.

（責任編輯：田"喆）