瓜類褪綠黃化病毒外殼蛋白的亞細胞定位及致病作用淺析

摘要

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"CCYV）是近些年來出現的一種煙粉虱"Bemisia"tabaci傳播的植物病毒，在瓜類生產中造成了嚴重損失。為了解該病毒外殼蛋白（coat"protein，"CP）在病毒侵染寄主過程中的亞細胞定位和致病作用，本研究以CCYV山東黃瓜分離物為研究對象，構建了熒光表達載體CPYFP和異源表達載體pGRCP。浸潤熒光表達載體48"h后的本氏煙Nicotiana"benthamiana葉片在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到熒光信號在細胞質和細胞核內均有分布;浸潤異源表達載體的本氏煙植株7"d后上部葉片開始顯現花葉癥狀，13"d后頂部新葉出現嚴重皺縮和壞死斑點。以上結果表明CCYV"CP蛋白參與了病毒對寄主的侵染過程，可能是癥狀形成的致病相關因子。本研究為進一步解析該病毒的致病機理提供了初步的理論支持。

關鍵詞

瓜類褪綠黃化病毒;"外殼蛋白;"亞細胞定位;"致病性;"異源表達

中圖分類號：

S"436.42

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023139

Characterization"of"the"subcellular"localization"and"pathogenicity"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"coat"protein

GAN"Shexiang#，"YANG"Liu#，"REN"Chunmei，"MIAO"Qian，"CHENG"Zhaobang，"JI"Yinghua*

（Institute"of"Plant"Protection，"Jiangsu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanjing"210014，"China）

Abstract

Cucurbit"chlorotic"yellow"virus"（CCYV）"is"a"kindnbsp;of"plant"virus"transmitted"by"whitefly."Recently，"it"has"caused"serious"losses"in"the"production"of"Cucurbitaceae"crops."In"order"to"study"the"subcellular"localization"and"pathogenic"characteristics"of"its"coat"protein"（CP）"during"infection，"the"fluorescence"vector"CPYFP"and"the"heterologous"expression"vector"pGRCP"were"constructed"based"on"CCYV"Shandong"isolate."After"infiltrating"the"vector"CPYFP"for"48"h，"fluorescence"signal"could"be"observed"in"cytoplasm"and"nucleus"of"the"Nicotiana"benthamiana"leaves"under"the"laser"confocal"microscope."After"seven"days"of"infiltrating"the"vector"pGRCP，"the"upper"leaves"of"N.benthamiana"plants"began"to"show"mosaic"symptoms，"and"13"days"later，"the"systemic"leaves"appeared"severe"chlorotic，"crumple"and"necrotic"spots."These"results"indicated"that"CP"might"be"an"important"protein"involved"in"the"pathogenicity"of"CCYV."This"study"provided"a"preliminary"theoretical"support"for"further"understanding"the"pathogenesis"of"this"virus.

Key"words

cucurbit"chlorotic"yellows"virus;coat"protein;subcellular"localization;pathogenicity;heterologous"expression

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"CCYV）是一種由煙粉虱Bemisia"tabaci以半持久方式傳播的植物病毒，它最早于2009年在日本甜瓜上發現［1］，近些年來報道逐漸增多，在多個國家和地區均有報道［213］。我國于2010年在臺灣地區首次發現CCYV［14］，之后在新疆、海南等多個省相繼出現報道［1520］。

該病毒在田間可以自然感染黃瓜、西瓜等大多數葫蘆科作物，實驗室條件下也可以侵染杖藜（莧色藜）Chenopodium"giganteum、甜菜、藜麥、菠菜、萵苣、曼陀羅"Datura"stramonium和本氏煙等植物［1］。被感染植株在侵染早期會出現中部下部葉片褪綠黃化，而后逐漸蔓延至植株頂部，最終造成整株黃化［21］。由于該病毒嚴重影響了瓜類作物的產量和品質，導致重大損失，已逐漸成為瓜類作物生產中日益突出的問題。

對病毒基因組、編碼蛋白及其功能的研究是解析病毒侵染機理并形成防控策略的基礎前提。CCYV屬于長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus，其基因組包含2條正單鏈RNA（RNA1和RNA2）。其中RNA1全長"8"607"nt，包含4個開放閱讀框（open"reading"frame，"ORF），分別編碼甲基轉移酶（methyltransferase）和RNA解旋酶（RNA"helicase），依賴"RNA"的"RNA"聚合酶（RNA"dependent"RNA"polymerase，"RdRp），P61蛋白和P22"蛋白;RNA2全長8"041"nt，含有8個ORF，分別編碼外殼蛋白（CP）、小外殼蛋白（CPm）、70"kD"類熱激蛋白（HSP70h）、P59、P26、P9、P62、P4.9蛋白［22］。在"CCYV"上目前只有"P4.9、P22、P6等少數幾個蛋白有功能相關報道［2325］，包括CP在內的許多蛋白功能仍然缺乏研究。位于CCYV"RNA2上的cp基因長753"bp，編碼一個由250個氨基酸組成的28"kD蛋白。作為重要的結構蛋白，CP不僅僅起到包裹病毒RNA的作用，在植物病毒對寄主的侵染過程中也發揮著重要的作用。

目前對于CCYV的CP蛋白在病毒侵染寄主中的作用尚未見報道，Crinivirus"屬其他成員的CP蛋白的功能也鮮有報道。本研究以"CCYV山東黃瓜分離物作為研究對象，對其編碼的CP蛋白進行了克隆，明確了CP蛋白的亞細胞定位特征，并評估了CP蛋白的致病特征，為后續深入解析CCYV編碼的CP蛋白在病毒與寄主植物互作過程中的作用機理奠定了部分理論基礎。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

毒源樣品為感染CCYV的黃瓜葉片，于2016年采自山東壽光［18］;熒光表達載體35S∶YFP由南京農業大學陶小榮教授惠贈;大腸桿菌感受態細胞DH5α和農桿菌GV3101感受態細胞均購自南京擎科生物科技有限公司;基于馬鈴薯X病毒（potato"virus"X，"PVX）的異源病毒表達載體pGR107、陰性對照載體pGRGFP和植物材料本氏煙Nicotiana"benthamiana種子為本實驗室保存。

1.2"RNA提取和cDNA的合成

取0.2"g病葉樣品，使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（上海浦迪生物）提取RNA，之后取2"μL使用HiScript"II"Q"RT"SuperMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）試劑盒反轉錄成cDNA。提取和反轉錄均根據說明書步驟進行。

1.3"PCR擴增和克隆

根據"CCYV"已發布的外殼蛋白序列設計2對引物（表1），引物兩端分別加入了不同的酶切位點以便于后續載體構建。

擴增體系：2×phanta"PCR"mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）25"μL，上、下游引物各1"μL，模板cDNA"2"μL，超純水補足至50"μL。反應程序：95℃預變性3"min，95℃變性30"s，50℃退火30"s，72℃延伸45"s，34個循環;72℃延伸10"min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，而后在紫外燈下切取目的條帶，使用Axygen膠回收試劑盒（愛思進生物技術有限公司）回收。將回收產物連接至pEASYBlunt載體（北京全式金生物技術有限公司）后轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，經PCR篩選出的陽性克隆送至南京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4"載體的構建

選擇測序正確的克隆使用Axygen質粒提取試劑盒（愛思進生物技術有限公司）提取質粒，使用對應的限制性內切酶（寶日醫生物技術有限公司）分別酶切目的片段和空載體（熒光表達載體35S∶YFP、異源病毒表達載體pGR107），酶切體系為：10×QuickCut"Buffer"4"μL，重組質粒20"μL，限制性內切酶1.5"μL，超純水補足至40"μL。酶切后的產物使用Axygen膠回收試劑盒回收，單酶切的線性化載體去磷酸化，T4"連接酶連接目的片段與線性化的載體，連接體系為：10×T4"DNA"Ligase"Buffer"1"μL，回收產物7"μL，載體1"μL，T4"DNA"Ligase"1"μL。16℃過夜連接后轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，于含卡那霉素（50"μg/mL）的LB平板倒置培養過夜，PCR篩選陽性克隆，經測序驗證獲得重組載體。

1.5"浸潤煙草與觀察分析

把構建好的載體質粒通過凍融法分別轉化至農桿菌GV3101，于含卡那霉素（50"μg/mL）和利福平（50"μg/mL）的LB平板倒置培養2"d，挑取單菌落進行PCR檢測，將正確的克隆轉接至含有同樣濃度的卡那霉素和利福平的LB液體培養基中擴繁培養至OD600為0.8～1.2，4"000"g離心5"min富集菌體，加入浸潤液（ddH2O"100"mL，1"mmol/L"MgCl2"200"μL，1"mmol/L"MES"1"mL，200"mmol/L乙酰丁香酮10"μL）重新懸浮菌體，并將OD600調至0.5，28℃靜置3"h后用無菌注射器浸潤3～5葉齡健康本氏煙的葉片。

浸潤熒光表達載體后的煙草置于25°C，光周期L∥D=16"h∥8"h的條件下培養。48"h后，剪下浸潤葉片分為3份，其中1份制作玻片，于激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM710）488"nm激發光下進行亞細胞定位觀察，DAPI染核和觀察方法參照范小燕等［26］"的方法。另外2份樣品于液氮中研磨后，1份提取總RNA，反轉錄合成cDNA，利用表1引物進行PCR檢測。另1份樣品參照范小燕等［26］的方法提取總蛋白，進行Western"blot檢測，在全自動熒光/化學發光成像儀（Tanon"5200）下顯色觀察結果。將浸潤異源表達載體的植株，分別于浸潤后7、13"d觀察癥狀并拍照，同時采集植株系統葉片（頂部新生葉片，非浸潤葉）提取RNA進行RTPCR檢測。CCYV"cp檢測引物見表1，PVX檢測引物見表2。定量PCR檢測使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix熒光定量檢測試劑盒（Q71102），按說明書步驟在BIORAD"CFX"Opus"96"熒光定量PCR儀上進行。

1.6"生物信息分析

序列比對分析使用NCBI網站的BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和ClustalX軟件，蛋白質分子量和等電點分析使用在線工具ExPASy的ProtParam"tool（https：∥web.expasy.org/protparam/），信號肽分析使用在線軟件SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），跨膜結構域分析使用在線軟件TMHMM（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。

2"結果與分析

2.1"CCYV"cp基因的克隆與分析

提取病樣RNA，使用表1引物經RTPCR擴增得到與目的基因片段大小基本吻合的片段。將目的條帶切膠回收并克隆至pEASYBlunt載體進行測序，比對結果表明所克隆序列為CCYV"cp基因。基因全長753"bp，編碼一個由250個氨基酸組成的28.7"kD蛋白，理論等電點5.92，經SignalP和TMHMM預測無信號肽和跨膜結構域。該蛋白的氨基酸序列與已報道序列比對結果顯示，作為病毒重要的結構蛋白，CCYV的外殼蛋白在不同分離物之間十分保守。本研究中的CCYV山東黃瓜分離物序列與參與比對的大部分分離物的CP氨基酸序列完全一致（圖1），推測重要保守位點的變化很有可能會改變病毒的侵染特性甚至喪失活性。

2.2"CP的亞細胞定位特征分析

擴增到的cp基因連接到35S∶YFP載體上構建成熒光表達載體CPYFP，轉化農桿菌GV3101后浸潤本氏煙葉片，在浸潤48"h時取浸潤區葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果表明，在本氏煙表皮細胞的細胞質和細胞核內均能觀察到強烈的綠色熒光信號，初步認為CPYFP在細胞質和細胞核內均有分布（圖2a）。將樣品細胞核經DAPI染色后再次進行觀察，發現"CPYFP"與"DAPI染色區域相互重疊（圖2b），進一步證明"CPYFP"具有細胞核分布的特征。

對浸潤處理后的葉片提取RNA，使用引物CPbF和CPbR（表1）進行RTPCR"檢測，產物大小約750"bp，而對照組（浸潤35S∶YFP空載體）無擴增條帶（圖2c）。同時提取浸潤葉片總蛋白，經過Western"blot檢測結果顯示浸潤CPYFP的葉片檢測到一條大小約56"kD的特異性條帶，與CPYFP融合蛋白大小一致，而浸潤35S∶YFP的樣品中檢測到一條大小約27"kD的條帶，與YFP大小一致（圖2d）。RTPCR和Western"blot結果表明CPYFP在本氏煙葉片中進行了正常轉錄和表達，同時也證實了在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的熒光信號是由CPYFP在煙草葉片中表達產生的。

2.3"CP致病性分析

將擴增到的cp基因連接到pGR107載體上，構建成基于PVX病毒改造的表達載體pGRCP，轉化農桿菌"GV3101"后浸潤本氏煙葉片。以浸潤空載體和插入gfp基因的載體為對照。在浸潤7"d后，兩種對照組上部葉片出現輕微花葉，類似PVX感染后的癥狀;浸潤pGRCP的本氏煙上部葉片出現花葉和卷曲皺縮。繼續觀察至第13"天，對照組煙草沒有明顯變化，而浸潤pGRCP的植株系統葉片（頂部非浸潤葉）出現較嚴重的卷曲、皺縮和壞死斑（圖3a）。此時對接種植株體內的PVX及CCYV的CP表達情況進行了檢測，RTPCR結果發現所有接種植株體內均檢測到了PVX，而CCYV的cp基因僅在接種pGRCP的植株中有檢測到，對照組未檢測到（圖3b）。qPCR結果顯示，在所有接種植株中PVX的表達量無顯著差異（圖3c）。

上述結果說明CCYV的CP蛋白能顯著增強PVX的致病性，暗示了CP"可能是一個參與病毒侵染時癥狀形成的致病相關因子。

3"結論與討論

研究病毒編碼蛋白的功能，可以解析病毒的侵染機制并為該病毒的防治提供理論依據。當病毒感染宿主細胞后，病毒編碼的蛋白在細胞內存在的位置正是其發揮侵染功能和進行自我復制的場所和基礎，因此研究病毒編碼蛋白的亞細胞分布不僅有益于闡釋蛋白的作用方式，對后續解析蛋白功能也起著積極的推動作用。CCYV是近些年來才被發現的1種粉虱傳病毒，自進入中國以來傳播迅速、發生嚴重，給葫蘆科作物的生產造成了損失。本研究以CCYV山東黃瓜分離物為對象，利用激光共聚焦顯微鏡對其CP蛋白在本氏煙中的亞細胞定位進行了觀察研究，結果顯示CP蛋白在細胞質和細胞核內均有分布。分子量相對較小的蛋白有可能直接通過彌散的方式入核，但CP的分子量相對較大（28.7"kD），序列分析也沒有明顯的核定位信號，因此其入核機理尚不清楚。目前在CCYV編碼蛋白中，除P4.9和P6外，其余蛋白的定位特征均未見報道。Wei等［23］研究P4.9時，報道其主要分布于細胞質和細胞核;涂麗琴等［25］研究報道P6蛋白也分布于細胞質和細胞核。

許多病毒蛋白在感染進入宿主細胞后會在細胞質、細胞核等位置進一步發揮功能。有些蛋白本身就具有一定的致病性，會導致宿主出現黃化、花葉、壞死等癥狀，而有些蛋白可能只是協助其他蛋白發揮作用。本文為了明確CCYV"CP蛋白在侵染寄主植物時是否具有致病性或參與寄主感病后癥狀的形成，利用PVX異源病毒表達系統進行了初步研究，發現CCYV編碼的CP蛋白會誘導寄主植物出現比PVX感染更加嚴重的癥狀，甚至到后期還出現了壞死斑，這說明CCYV的CP蛋白能增強PVX的致病性，暗示它可能是直接參與病毒致病的關鍵因子。但CP蛋白在細胞核及細胞質中是如何行使功能最終導致寄主植物出現感病癥狀的還有待于進一步研究。

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（責任編輯：田"喆）