北京地區(qū)侵染茄子的番茄斑萎病毒分子鑒定與分析

摘要

調(diào)查發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)一溫室栽培茄子Solanum"melongena"L.出現(xiàn)嚴(yán)重病毒病。利用基于小RNA的高通量測(cè)序技術(shù)和RTPCR方法，明確了引起茄子病害的病毒種類為番茄斑萎病毒，將其命名為TSWVeggplant分離物。進(jìn)一步克隆了該病毒的基因組全長（S"RNA、M"RNA、L"RNA），并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，該分離物的S"RNA與美國分離物親緣關(guān)系較近，M"RNA與中國分離物親緣關(guān)系較近，而L"RNA與韓國分離物親緣關(guān)系較近。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的TSWV分離物與國內(nèi)已發(fā)生報(bào)道的分離物不同，該分離物是否存在不同分離物之間基因組的重組需要進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞

番茄斑萎病毒;"茄子;"高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：

S"436.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023040

Molecular"identification"and"analysis"of"tomato"spotted"wilt"virus"on"eggplant"in"Beijing

TIAN"Wen1，2，"QIU"Yanhong1*，"QIN"Wentao3，"ZHANG"Haijun1，"WANG"Dexin1，"LI"Longfei4，JIA"Zhiyang4，"XU"Xiulan1*

（1."Vegetable"Research"Institute，"Beijing"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Beijing"100097，"China;"

2."Institute"of"Microbiology，"Chinese"Academy"of"Sciences，"Beijing"100101，"China;"3."Institute"of"Plant"

Protection，"Beijing"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Beijing"100097，"China;"4."Jingyan"

Yinong"（Beijing）"Seed"SciTech"Co."Ltd.，"Beijing"100097，"China）

Abstract

In"this"study，"serious"viral"disease"was"found"on"Solanum"melongena"L."in"a"greenhouse"in"Beijing."With"highthroughput"sequencing"technology"based"on"small"RNAs"and"RTPCR"methods，"it"was"confirmed"that"the"eggplants"were"infected"by"tomato"spotted"wilt"virus"and"named"as"TSWVeggplant"isolate."Complete"genome"sequence"of"the"TSWV"S"RNA，"M"RNA，"L"RNA"was"further"cloned"and"the"phylogenetic"tree"was"also"constructed."The"results"showed"that"the"S"RNA"of"TSWVeggplant"was"closely"related"with"isolates"from"America，"M"RNA"was"closely"related"with"isolates"from"China，"while"L"RNA"was"closely"related"with"isolates"from"Korea."So"the"TSWV"isolate"in"this"study"was"different"from"isolates"reported"in"China"and"whether"the"genome"of"the"isolate"was"recombined"from"different"isolates"was"needed"to"be"further"studied.

Key"words

tomato"spotted"wilt"virus;"eggplant;"highthroughput"sequencing

茄子Solanum"melongena"L.屬茄科Solanaceae，是我國重要的蔬菜作物，在全國各地區(qū)均有種植，也是我國北方設(shè)施栽培的主要蔬菜之一［1］。近來，茄子病毒病發(fā)生嚴(yán)重，多種病毒可侵染茄子［2］，如番茄褪綠病毒（tomato"chlorosis"virus，ToCV），可引起茄子葉片出現(xiàn)褪綠黃化癥狀［3］，煙草輕型綠花葉病毒（tobacco"mild"green"mosaic"virus，TMGMV）和番茄斑駁花葉病毒（tomato"mottle"mosaic"virus，ToMMV）共同侵染引起茄子花瓣深紫色斑駁癥狀［4］。

番茄斑萎病毒（tomato"spotted"wilt"virus，TSWV）屬于番茄斑萎病毒科Tospoviridae，正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus，基因組由3條單鏈RNA組成，包含L"RNA（8.9"kb）、M"RNA（4.8"kb）、S"RNA（2.9"kb）［56］。其中，L"RNA的互補(bǔ)鏈編碼依賴于RNA的RNA聚合酶RdRP;M"RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSm，其互補(bǔ)鏈編碼兩個(gè)重要的糖蛋白Gn和Gc;S"RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs，其互補(bǔ)鏈編碼核衣殼蛋白N［7］。其中，核衣殼蛋白N的氨基酸序列是正番茄斑萎病毒屬的重要分類依據(jù)，通常氨基酸同源性在90%以上為同種病毒［56］。TSWV寄主范圍廣泛，可侵染1"090多種植物［8］，是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一種全球性重要病毒，也是世界十大嚴(yán)重危害性植物病毒之一［9］。

近幾年，北京地區(qū)番茄斑萎病毒發(fā)生嚴(yán)重，在番茄［10］、辣椒［1011］、萵苣［12］、水芹［13］以及菊花［14］上均有發(fā)生。2021年，北京市海淀區(qū)一溫室內(nèi)的茄子上出現(xiàn)疑似病毒侵染癥狀。本研究利用基于小RNA的高通量測(cè)序技術(shù)以及RTPCR方法鑒定了危害茄子的病毒種類;并進(jìn)一步對(duì)該病毒的基因組序列進(jìn)行了分析。本研究為有效防控茄子病害提供理論基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

2021年，從北京海淀區(qū)一溫室大棚采集了8份疑似感染病毒的茄子樣品，拍照后保存于-80℃冰箱備用。陽性對(duì)照樣本由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

Trizol"Reagent"購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司;"一步法RTPCR試劑盒"［HiScript"Ⅱ"One"Step"RTPCR"Kit（Dye"Plus）］和5"min"TA/BluntZero"Cloning"Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Prime"ScriptTM"Ⅱ"High"Fidelity"One"Step"RTPCR"Kit"購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2"高通量測(cè)序與小RNA分析

利用Trizol法對(duì)所采集的8份茄子病樣進(jìn)行植物總RNA提取。利用NanoDrop"2000C紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）測(cè)定RNA濃度，并選取3個(gè)濃度較高的RNA樣品混合后作為一個(gè)模板，委托華大基因進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina"Hiseq"2000。將測(cè)序數(shù)據(jù)（raw"data）經(jīng)過過濾、組裝所獲得的contigs與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析;短序列采用Velvet軟件（kmer值設(shè)為17）［15］進(jìn)行組裝拼接。

1.3"RTPCR檢測(cè)

以提取的葉片總RNA為模板，利用TSWV特異性檢測(cè)引物，采用HiScriptⅡ"One"Step"RTPCR"Kit（Dye"Plus）對(duì)所采集的樣品進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。具體引物信息見表1。

1.4"全長克隆及測(cè)序

以茄子樣品的總RNA為模板，根據(jù)小RNA測(cè)序拼接得到的病毒核苷酸序列設(shè)計(jì)TSWV引物，利用Prime"ScriptTM"Ⅱ"High"Fidelity"One"Step"RTPCR"Kit對(duì)TSWV的S"RNA、M"RNA和L"RNA進(jìn)行擴(kuò)增，具體引物信息見表1。其中，S"RNA"采用TSWVSF/TSWV861R"進(jìn)行全長擴(kuò)增;M"RNA采用2對(duì)引物分段進(jìn)行擴(kuò)增，分別為TSWVMF/TSWVM1560R和TSWVM1560F/TSWVMR，L"RNA同樣也采用2對(duì)引物分段進(jìn)行擴(kuò)增，分別為TSWVLF/TSWVL4600R和TSWVL4600F/TSWVLR，擴(kuò)增后進(jìn)行序列拼接。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒純化，并克隆至載體pCE2"TA/BluntZero上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞FastT1"competent"cell（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）中;將菌液PCR鑒定為陽性的樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5"序列分析

利用DNAMAN"8軟件對(duì)序列進(jìn)行分析和拼接。利用BLAST進(jìn)行同源序列檢索。采用Clustal"W算法進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA"7.0軟件基于鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1"000。

2"結(jié)果與分析

2.1"田間病株癥狀以及高通量測(cè)序結(jié)果

2021年3月，在北京海淀區(qū)的一個(gè)溫室內(nèi)發(fā)現(xiàn)很多茄子植株出現(xiàn)矮化癥狀，葉片上伴隨著褪綠、斑駁和花葉等癥狀，且一些發(fā)病植株的茄子果實(shí)表面凹凸不平（圖1a）。隨機(jī)采集發(fā)病的茄子植株8份，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

通過高通量測(cè)序后，獲得原始數(shù)據(jù)13"515"309條;經(jīng)過過濾接頭以及去除低質(zhì)量序列等，共獲得長度介于18～30"nt的小RNA"12"583"651條。其中，24"nt的小RNA最多（4"523"787條），其次為21"nt的小RNA（2"008"507條）（圖1b）。經(jīng)過序列組裝以及比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)有93條拼接序列（contigs）與TSWV的基因組具有同源性。

2.2"RTPCR檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步明確高通量測(cè)序結(jié)果，采用TSWV的特異性引物TSWV861F/R對(duì)8個(gè)茄子樣品進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。結(jié)果表明，所采集的8個(gè)茄子樣品均擴(kuò)出預(yù)期大小條帶（圖2）。通過對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與已報(bào)道的TSWV分離物序列的相似性在98.7%以上，進(jìn)一步證明了引起茄子相關(guān)癥狀的為番茄斑萎病毒，且該病毒為TSWV的一個(gè)新的分離物，命名為TSWVeggplant。

2.3"基因組克隆與分析

根據(jù)表1中的引物進(jìn)一步克隆了TSWV全長序列，并向NCBI提交了該分離物的S"RNA，"M"RNA和L"RNA序列（GenBank序列登錄號(hào)分別為OM154966、OM154967和OM154968）。其中，TSWV的S"RNA大小為2"958"bp，編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSs基因大小為1"404"bp，其互補(bǔ)鏈編碼的外殼蛋白N基因大小為777"bp;TSWV的M"RNA大小為4"776"bp，編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSm基因大小為909"bp，其互補(bǔ)鏈具有一個(gè)大的開放閱讀框，基因大小為3"408"bp，編碼2個(gè)糖蛋白GN和GC。TSWV的L"RNA大小為8"913"bp，編碼的RdRp基因大小為8"640"bp。

進(jìn)一步對(duì)TSWVeggplant分離物與其他已知TSWV分離物的序列同源性進(jìn)行分析，BLAST比對(duì)結(jié)果顯示TSWVeggplant的S"RNA序列與其他TSWV分離物序列一致性在98.6%以上，M"RNA序列一致性在98.8%以上，L"RNA序列一致性在97.3%以上。其中，S"RNA與菊苣Cichorium"intybus分離物（GenBank"No."MG593199）的序列一致性最高（99.6%），M"RNA與番茄分離物（GenBank"No."KU179570）的序列一致性最高（99.1%），L"RNA與菊苣分離物（GenBank"No."MG593197）的序列一致性最高（98.8%）。

2.4"系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對(duì)TSWVeggplant全基因組核苷酸序列與其他TSWV序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA"7.0軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，TSWVeggplant的S"RNA"進(jìn)化樹可分為3個(gè)組，其中TSWVeggplant的S"RNA與美國菊苣分離物（GenBank"No."MG593199）親緣關(guān)系最近，聚合為一個(gè)分支，形成組3（圖3a）;M"RNA進(jìn)化樹形成2個(gè)組，其中TSWVeggplant的M"RNA與中國番茄分離物（GenBank"No."JF960236）關(guān)系最近，與中國的其他分離物形成組1，而國外的很多分離物形成組2（圖3b）;L"RNA與韓國的枸杞Lycium"chinense分離物（GenBank"No."MT643234）關(guān)系最近，形成組1，而中國分離物形成組2（圖3c）。說明，該分離物與國內(nèi)報(bào)道的分離物有所不同。

3"結(jié)論與討論

TSWV是世界十大植物病毒之一，寄主范圍非常廣泛，給世界上許多國家和地區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。自1989年在中國廣州首次發(fā)現(xiàn)以來，已在我國多個(gè)省市發(fā)生，部分地區(qū)發(fā)生非常嚴(yán)重［2，"17］，尤其是番茄和辣椒上［10，"18］，如在四川［19］和云南［20］的辣椒上，黑龍江［18］、北京［10］的番茄上均有檢出TSWV。由于TSWV的傳播介體薊馬繁殖速度快，長期的化學(xué)藥劑防控導(dǎo)致薊馬抗藥性增強(qiáng)，致使TSWV的防治越來越困難。

茄子是我國重要的蔬菜作物，也是我國北方設(shè)施栽培的主要蔬菜之一，而近幾年，病毒病害時(shí)有發(fā)生。已報(bào)道的可侵染茄子的病毒約44種，新的病毒種類還在不斷增加。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)和PCR方法，明確了侵染茄子的病毒為TSWV。研究發(fā)現(xiàn)，TSWV在侵染茄子后，會(huì)導(dǎo)致茄子植株發(fā)育不良，葉片出現(xiàn)嚴(yán)重花葉、褪綠、斑駁等癥狀，且發(fā)病植株上的茄子果實(shí)表皮出現(xiàn)凹凸不平的癥狀，嚴(yán)重影響了茄子的產(chǎn)量和質(zhì)量。進(jìn)一步利用分子生物學(xué)方法，克隆了侵染茄子的TSWV分離物的全基因組序列。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)本研究在茄子上分離的TSWV"S、M和L"RNA親緣關(guān)系表現(xiàn)出不同的地域性，"S"RNA和與美國分離物親緣關(guān)系較近，M"RNA與中國分離物親緣關(guān)系較近，而L"RNA與韓國分離物親緣關(guān)系較近，說明該分離物與國內(nèi)其他分離物有所不同，可能是隨著品種的交流以及薊馬的擴(kuò)散，與不同國家的株系間發(fā)生了基因重組。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的TSWV分離物是否存在不同株系之間的重組需要進(jìn)一步的研究。"

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（責(zé)任編輯：田"喆）