基于免疫微環境探討養陰扶正解毒法治療原發性肝癌*

蔡 雪 于莉華 劉曉利 閆慧文 解宇晴 楊志云△

1.北京中醫藥大學第一臨床醫學院 (北京, 100700) 2.首都醫科大學附屬北京地壇醫院

2020年原發性肝癌發病率第6位,死亡率第3位,中國原發性肝癌新發病例數占全球的45.27%,死亡病例數占全球的47.12%[1],由此可見,原發性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一,我國是肝癌的高發地區。原發性肝癌復發率高,死亡率高,嚴重危害人類健康,大多數患者在發現時已經進入中晚期,錯失根治性手術切除機會,介入治療、放射治療以及包括分子靶向治療、免疫檢查點抑制劑治療在內的系統抗腫瘤治療是中晚期肝癌的主要治療方式,其中,不斷更新的免疫治療藥物為肝癌患者帶來更多希望,盡管目前免疫治療取得重大進展,但是仍存在許多局限,更深入地了解肝癌免疫特征及機制具有重要意義。《原發性肝癌診療指南(2022年版)》中推薦在肝癌的不同時期運用中醫方藥配合西醫治療可控制癥狀、預防復發轉移及延長患者生存[2],臨床及基礎實驗研究證明中醫藥能夠調控肝癌免疫,改善肝癌免疫抑制微環境[3,4]。本文從肝癌免疫的角度,探討養陰扶正解毒法在肝癌免疫微環境中的治療作用,為中醫藥抗腫瘤治療提供理論依據。

1 肝癌免疫微環境

肝癌免疫微環境由免疫細胞、基質細胞等細胞成分以及細胞外基質(ECM)、細胞因子、趨化因子等非細胞成分共同組成[5]。免疫細胞中的CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)主要發揮免疫殺傷作用,腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、髓源性抑制細胞(MDSC)、調節性T細胞(Tregs)等主要發揮免疫抑制作用[6]。肝癌免疫微環境具有以下特征:①炎性:肝癌多在病毒性或酒精性肝炎基礎上進展而來,是典型的炎性腫瘤;②酸性:肝癌細胞通過糖酵解途徑代謝,腫瘤組織局部形成酸性微環境,肝癌在酸性條件下具有更強的侵襲性和轉移性[7];③缺氧:肝癌細胞生長過快導致耗氧量增加,形成缺氧微環境[8];④腫瘤血管生成:缺氧微環境下缺氧誘導因子-1(HIF-1)刺激血管內皮生長因子(VEGF)等血管生成因子的表達,促進血管新生[8];⑤免疫抑制:肝癌細胞通過“免疫編輯”對機體免疫系統進行重塑,將腫瘤微環境“改造”成免疫抑制微環境,肝癌細胞中的上皮間質轉化(EMT)通過間充質干細胞(MSC)和腫瘤相關成纖維細胞(CAF)誘導MDSC、TAM和Tregs分化,免疫抑制因子如白細胞介素(IL)-10、轉化生長因子(TGF)-β及CD8+T細胞表面的程序性死亡受體1(PD-1)和DC上的細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)表達增加[9],T細胞免疫殺傷功能減弱,腫瘤細胞因此發生免疫逃逸。由此可見,腫瘤細胞將免疫微環境“改造”為適宜其生長、增殖和轉移的環境,如何改善肝癌免疫微環境、增強免疫細胞殺傷功能進而抑制肝癌進展是肝癌免疫治療的關鍵。

2 基于免疫微環境認識肝癌中醫病機

肝癌屬中醫“肝積”“癥瘕”“積聚”等范疇,肝癌發生的本質在于正氣虧虛,癌毒內蘊。所謂“積之成者,正氣不足,而后邪氣踞之”,正氣虧虛,脾失健運,濕熱內停,土壅木郁,肝氣失于條達,或氣血乏源,肝血虧虛,久而久之在肝內形成瘀血、痰濁等病理產物,外來毒邪與內生病理產物互相結聚,形成肝癌。腫瘤局部微環境是肝癌發生發展的場所,有不少學者基于免疫微環境論述肝癌病機,有學者將肝癌局部免疫微環境劃分為“正氣”與“邪氣”,具有腫瘤殺傷功能的免疫細胞屬于“正氣”;具有促進腫瘤細胞生長作用的屬于“邪氣”[10];何偉等[11]認為正氣虛弱,免疫功能低下是形成免疫抑制微環境的核心病機;程海波等[12]認為炎性微環境是熱毒的表現,高凝、腫瘤血管增生與血瘀相符合,而大量的黏附因子導致腫瘤轉移與痰濕黏滯重濁、隨氣流竄的特點相符。因此,腫瘤微環境的動態變化體現了正邪斗爭過程,機體正虛無力抗邪,則形成免疫抑制,表現為T細胞功能耗竭;瘀血、痰濁、癌毒等邪實凝聚,則形成炎性、酸性、缺氧的微環境特征。

2.1 脾失健運 《金匱要略》言“四季脾旺不受邪”,《素問·五癃津液別篇》言“脾為之衛”。脾是機體重要的免疫防御系統,脾虛與肝癌的發生密切相關,肝癌患者往往脾胃虧虛,正氣不足,衛外失固,進而免疫防御功能和監視功能下降,腫瘤微環境中免疫細胞的識別和殺傷力降低,研究表明脾虛導致免疫功能低下,肝郁脾虛的肝癌小鼠T、B淋巴細胞增殖能力顯著降低,細胞因子IL-2、γ-干擾素(IFN-γ)顯著降低, IL-10、IL-4顯著升高,小鼠免疫抑制顯著[13]。脾為氣血生化之源,脾胃運化和輸布水谷精微,濡養五臟六腑,脾胃虛弱則運化無力,出現乏力、納差、惡心嘔吐、腹脹痛、形體消瘦等癥狀。肝癌患者脾虛存在物質的能量的代謝紊亂[14],脾虛與腫瘤細胞的能量代謝異常有關,脾虛造成腫瘤細胞的能量代謝重組,形成缺氧微環境[11]。于爾辛教授[15]提出“肝癌的本是脾虛”,采用健脾理氣法能夠調節小鼠T細胞和NK細胞, 抑制血管內皮細胞生長因子的表達和腫瘤血管形成,改善免疫功能。因此,脾失健運是肝癌發生的重要病機,脾虛導致機體免疫功能降低,有利于肝癌免疫抑制微環境形成,促進肝癌細胞生長、轉移。

2.2 肝失疏泄 《格致余論》言“司疏泄者肝也”,腫瘤的發生與精神狀態有十分密切的聯系,肝癌患者常常情志抑郁,氣機不得暢達,造成肝氣郁結,血液瘀滯,形成實邪,正如《難經本義》言“積蓄也,言血脈不行,蓄積而成病也”,瘀血又進一步阻滯氣血運行,導致肝臟失于濡養,造成肝血虧虛,表現為肌膚甲錯、肝區疼痛、舌質紫黯、脈細澀或結代等,肝失疏泄與肝之陰血虧虛互為因果,抑制機體免疫功能,腫瘤局部微環境中免疫細胞功能失常,免疫殺傷功能減弱,肝癌進一步進展,研究表明肝腎陰虛小鼠CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3+NK1.1+NK細胞比例均顯著降低,腫瘤細胞呈浸潤性生長,小鼠生存期顯著縮短[16]。小柴胡湯和解少陽,方中柴胡升舉陽氣、疏肝解郁,其聯合常規療法治療原發性肝癌TACE術后,可有效保護患者免疫功能,維持T細胞數量,提高患者生活質量[17];芍藥軟肝合劑中白芍養血柔肝,加之清熱解毒、行氣散結之藥物,能提高荷瘤小鼠機體免疫功能,其能抑制荷瘤小鼠中VEGF的表達,從而抑制腫瘤生長[18]。因此,肝失疏泄、肝血虧虛是肝癌發生的重要病機,肝失疏泄導致免疫抑制,而養血柔肝、疏肝解郁之品能調節其免疫,增強機體免疫功能,延緩肝癌惡化。

2.3 癌毒內蘊 肝癌的致病因素包括飲酒、肝炎病毒、黃曲霉素等,這些在中醫上均屬于外來毒邪,正虛不能抵抗邪氣,邪氣久踞,形成腫塊,腫塊耗血傷津,加重肝臟陰血虧虛。另外,瘀血、痰濁等內生病理產物與外來毒邪互相凝結,阻滯氣機,促進腫塊生長,本虛與標實互根互用,形成惡性循環,使病情加重,這一過程與腫瘤細胞在免疫微環境中作用過程相似,機體免疫功能下降無法清除腫瘤細胞,腫瘤細胞在免疫微環境中誘導免疫抑制細胞分化,促進免疫抑制分子表達,進而抑制免疫細胞殺傷功能,腫瘤細胞發生免疫逃逸得以繼續增殖,使得癌毒內蘊加強,正氣進一步虧損,形成“因虛致實,因實致虛”的惡性循環。肝癌是典型的炎癥相關腫瘤,腫瘤微環境中存在腫瘤相關成纖維細胞、腫瘤相關巨噬細胞、IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性物質[19],加之缺營養、酸化的特點,對周圍免疫細胞具有顯著抑制[20],這與癌毒耗損正氣、纏綿深痼的致病特點類似。另外,腫瘤外泌體是腫瘤微環境的重要組成部分,腫瘤外泌體可抑制免疫應答,增加腫瘤的侵襲轉移能力,體現了癌毒走注流竄的特點[21]。因此,癌毒內蘊是肝癌發生的重要病機,解毒散結等祛邪法以改善腫瘤酸性、炎性、缺氧、免疫抑制微環境,從而恢復T細胞功能,抑制肝癌細胞增殖和轉移。

3 養陰扶正解毒法調控肝癌免疫

扶正祛邪是中醫治療肝癌的根本法則,應貫穿肝癌治療的始終。扶正應以益氣養陰為主,振奮臟腑功能活動,旨在恢復脾之運化,肝之疏泄、藏血功能,提高機體免疫防御和免疫監視能力,改善CTL、NK等免疫細胞耗竭,恢復其殺傷作用;祛邪即削弱或清除病邪,以減輕其對機體的損害,應以化瘀解毒,軟堅散結為主,佐以行氣化痰,防止毒邪留戀,免疫學的角度即打擊TAM、MDSC、Tregs等免疫抑制細胞,降低PD-1、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)等免疫抑制分子表達,阻斷腫瘤細胞免疫抑制通路,多靶點、多途徑介導腫瘤細胞凋亡,發揮中醫藥殺傷腫瘤細胞并抑制其增殖和轉移的作用。

3.1 養陰扶正 “見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”,益氣扶正是治療肝癌的基本法則。肝脾功能聯系密切,脾氣健運,則肝氣疏泄條達;氣血生化充足,則肝血得藏。健脾養胃能夠抑制腫瘤異常糖代謝, 清除其副產物,重塑腫瘤微環境[22],許多近現代醫家認為益氣扶正是抗癌的重要舉措[23-25]。另外,腫瘤易耗血傷陰,肝陰是肝臟功能的基礎,《臨證指南醫案》言“肝為剛臟,非柔潤不能調和”,養陰柔肝對恢復肝之疏泄、藏血功能,重塑肝癌免疫微環境具有重要意義。《醫宗必讀·乙癸同源論》言“東方之木,無虛不可補,補腎即所以補肝”,因此,應運用滋水涵木法,同補肝腎之陰,使肝之疏泄條達。

養陰扶正法通過改善免疫功能對肝癌發揮治療作用已經在許多研究中得到證實。如研究發現健脾益氣方能夠下調NLRP3炎癥小體的表達、抑制細胞程序性壞死,改善肝癌免疫功能[26];益氣養陰類中藥可以顯著提高CD4/CD8比值,增強巨噬細胞功能,改善免疫抑制狀態,提高患者的免疫力[27]。本團隊經驗方養陰扶正解毒方(沙參、麥冬各15 g, 白花蛇舌草、生黃芪各20 g ,徐長卿12 g,柴胡、苦參、白術各9 g )用于肝癌的輔助治療,本方具有養陰扶正、解毒散結之功效,能有效改善肝癌患者癥狀,延長患者生存,小鼠實驗表明養陰扶正解毒方有效抑制腫瘤生長,增加脾臟和外周血及腫瘤組織的CD8+和CD3+T細胞的水平,降低CD8+T細胞表面共抑制分子PD-1、TIGIT和T細胞免疫球蛋白-3(TIM-3)的表達,恢復腫瘤浸潤性T細胞的細胞毒性,延緩其凋亡。此外,治療顯著降低了外周血和腫瘤組織中炎癥和免疫抑制細胞因子(包括IL-1β、IL-6和IL-10)的表達,增加了效應細胞因子TNF-α和IFN-γ的表達,改善T細胞耗竭和免疫抑制微環境[28,29]。因此,養陰扶正法可以改善炎性微環境,降低PD-1、TIM-3等免疫抑制分子表達,恢復T細胞毒性,減輕免疫抑制,進而加強免疫監控和免疫殺傷,從而抑制肝癌進展。

3.2 解毒散結 金元四大家之一張從正主張“先論攻邪,邪去而元氣自復”、“邪氣留則正氣傷,邪氣去則正氣安”,祛邪應貫穿肝癌治療始終。肝癌腫瘤局部“痰、郁、瘀、毒”結聚膠著,應治以活血化瘀,解毒散結為主,佐以行氣化痰。活血化瘀以祛除瘀毒,改善腫瘤患者缺氧微環境,抑制腫瘤血管及癌栓形成;解毒散結以抑制炎性反應,降低炎癥因子水平,介導腫瘤細胞凋亡;行氣化痰以抑制腫瘤細胞糖酵解,減少乳酸堆積,改善酸性微環境,從而改善免疫抑制,抑制腫瘤生長。

研究表明解毒散結能夠抑制腫瘤生長,改善腫瘤微環境免疫抑制。國醫大師周仲瑛教授的經驗方“消癌解毒方(白花蛇舌草、蜈蚣、僵蠶、麥冬等)”由清熱解毒藥、化痰祛瘀藥和益氣養陰藥等組成,能夠在腫瘤細胞凋亡和腫瘤血管生成方面發揮良好作用[12];復方斑蝥膠囊具有破血消瘀,攻毒蝕瘡的功效,患者治療后血清中VEGF、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)含量均明顯降低,有效抑制腫瘤血管生成,改善缺氧免疫微環境[30];白花香蓮解毒顆粒聯合經肝動脈化療栓塞術治療HBV相關性肝癌,治療4周后發現治療組患者CD4+、CD4+/CD8上升水平以及CD8+下降水平均優于對照組[31];扶正解毒消積方增強初次TACE治療的氣陰兩虛、毒瘀蘊積證肝癌患者的免疫功能,增強機體抗腫瘤能力,延長無進展生存期[32]。因此,解毒散結法能抑制腫瘤血管生成,降低缺氧誘導因子水平,維持T細胞水平,發揮抗腫瘤作用。

4 現代藥理學研究

4.1 養陰扶正類中藥 目前對中藥單體調節腫瘤免疫的機制研究日益增多,黃芪多糖在體外以劑量和時間依賴的方式抑制CD4+CD25+Treg細胞的生長和增殖,其機制可能是通過降低肝癌局部微環境中FOXP3的表達并恢復細胞因子平衡,另外,黃芪多糖介導CXCR4/CXCL12通路來阻斷SDF-1或其受體,從而抑制Treg細胞遷移[33],也有研究表明黃芪多糖能夠通過miR-133a-3p/MSN軸減弱PD-L1介導的免疫抑制,產生抗腫瘤作用[4];人參皂苷Rg3抑制肝細胞癌Hep1-6、HepG2和SMMC 7721細胞活性并誘導細胞凋亡,另外,它可以增強淋巴細胞增殖以及IL-2和IFN-γ的分泌,從而抑制腫瘤生長[34];甘草多糖減少肝癌小鼠腫瘤微環境和脾臟淋巴結中的Treg細胞比例,降低Foxp3在Treg細胞中的表達,上調血清Th1/Th2細胞因子比率,抑制腫瘤生長[35];芍藥苷通過抑制TGF-β1/Smads信號轉導通路蛋白的表達強度抑制肝癌Hep G2細胞的侵襲和遷移[36]。因此,養陰扶正類中藥能夠調節不同分子及通路打擊免疫抑制細胞Treg細胞的生長和增殖及遷移,增強T細胞增殖及殺傷力,或抑制PD-L1的表達,或通過阻斷相關信號通路抑制肝癌細胞侵襲和遷移,從而達到治療肝癌目的。

4.2 解毒散結類中藥 解毒散結類中藥經研究證實能夠改善肝癌免疫微環境,介導腫瘤細胞凋亡。黃芩苷是黃芩的主要成分之一,其可以促進腫瘤相關巨噬細胞極化為M1樣噬菌體,從而增強癌癥細胞的自噬,另外,黃芩苷能夠通過激活內質網激活轉錄因子6(ATF6)信號傳導促進HepG2肝癌細胞凋亡[37],Ke等[38]研究證明黃芩苷降低STAT3活性,進一步下調IFN-γ誘導的PD-L1表達,從而恢復T細胞對腫瘤細胞的敏感性;大黃能夠誘導腫瘤細胞凋亡抑制肝癌進展[39];穿心蓮內酯能夠抑制肝癌細胞中的VEGF,而VEGF是肝癌治療的有效靶點[40];百花蛇舌草抑制肝癌細胞的增殖,誘導其凋亡,且可誘導Bax/Bcl-2比值上調,下調IL-6/STAT3信號通路活性[41,42]。因此,解毒散結類中藥能夠抑制肝癌細胞增殖,增強其自噬,誘導其凋亡,或下調PD-L1的表達,減輕T細胞耗竭,或抑制腫瘤血管生成,發揮抗腫瘤作用。

5 結語

目前,免疫療法在腫瘤治療中展現出良好前景,通過干預免疫微環境、改善免疫細胞耗竭功能是免疫治療的主要機制,越來越多的研究證明,中醫藥能夠多層次、多途徑、多靶點改善免疫微環境,恢復腫瘤患者免疫功能,延長患者生存。本文從免疫微環境的角度探討中醫藥對肝癌的免疫治療作用,認為養陰扶正解毒法能較好地改善肝癌免疫功能,養陰扶正解毒法是本團隊多年來治療肝癌的基本治則,臨床及實驗研究證明能有效延長患者生存,改善肝癌免疫抑制微環境。中藥復方作用機制復雜,未來還有許多未知需要我們探索。