煙堿對腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能的影響

[摘要]"目的"觀察膽堿能激動劑煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷后凝血功能的影響。方法"選取32只體質量250～300g雄性健康SD大鼠，采用隨機數字表法將它們分為四組（n=8）：假手術（sham"operation，S）組、腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組、煙堿（nicotine，NIC）組、α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。大鼠腸缺血再灌注損傷模型采取腸系膜上動脈夾閉45min后恢復再灌注120min的方法建立。α-BGT組在腸系膜上動脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT"1μg/kg，煙堿400μg/kg；NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，"S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，其余均同α-BGT組。在大鼠恢復再灌注120min后經腹主動脈取血樣，檢測血漿腫瘤壞死因子-α（plasma"tumor"necrosis"factor，TNF-α）、組織因子（tissue"factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue"plasminogen"activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平和血小板計數（platelet"count，PLT）。取遠端回腸采用Chiu評分法評估小腸組織受損程度。結果"與S組和NIC組比較，IR組和α-BGT組血漿TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平均出現顯劇升高，血漿AT水平下降，血小板計數下降（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）。結論"煙堿能夠抑制大鼠腸缺血再灌注損傷導致的凝血功能過度激活；其作用機制可能為外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結合，引起膽堿能抗炎通路的激活，進而導致促炎性細胞因子的釋放減少，從而減輕內皮細胞的損傷。

[關鍵詞]"腸缺血再灌注損傷；血液凝固；煙堿

[中圖分類號]"R656""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.14.010

Effect"of"nicotine"on"coagulation"and"fibrinolysis"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats

WANG"Haisong，"XU"Linmei，"CHEN"Zhenyi，"GAO"Haiying，"CAI"Dongmiao

Department"of"Anesthesiology，"the"First"Affiliated"Hospital"of"Xiamen"University，"Xiamen"361003，"Fujian，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effect"of"nicotine"on"coagulation"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats."Methods"32"male"Sprague-dawley"rats，"weighing"250-300g，"were"randomly"divided"into"4"groups"（n=8）："sham"operation"group"（S），"intestinal"ischemia-reperfusion"（IR）"group，"nicotine"（NIC）"group，"α7"nicotinic"acetylcholine"receptornbsp;（α7nAchR）"antagonist"group"α-bungarotoxin"（α-BGT）"group."Intestinal"IR"was"induced"by"clamping"superior"mesenteric"artery"for"45min"and"120min"of"reperfusion."In"group"NIC"nicotine"400μg/kg"was"injected"intraperitoneally"at"30min"before"superior"mesenteric"artery"occlusion."In"group"α-BGT"1μg/kg"was"injected"intraperitoneally"at"15min"before"superior"mesenteric"artery"occlusion."Plasma"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α），"tissue"factor"（TF），"antithrombin"（AT），"tissue"plasminogen"activator"（tPA），"fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1"（PAI-1），"D-dimer"levels"and"platelet"count"（PLT）"were"measured"after"120min"reperfusion."Chiu’s"count"was"used"to"assess"the"changes"in"intestinal"mucosal"pathlolgical"morphology."Results"Compared"with"group"S"and"group"NIC，"the"plasma"TNF-α，TF，"tPA，"PAI-1"and"D-dimer"levels"were"significantly"increased，"and"plasma"AT"level"and"platelet"count"were"significantly"decreased，"in"group"IR"and"group"α-BGT（Plt;0.05），Chiu’s"scores"were"significantly"increased（Plt;0.05）."Conclusion"Nicotine"can"inhibit"the"excessive"activation"of"coagulation"function"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats."Its"mechanism"may"be"related"to"activation"of"cholinergic"antiinflammatory"pathway，"reducing"the"release"of"pro-inflammatory"cytokines"thereby"reducing"endothelial"cell"injury.

[Key"words]"Intestinal"ischemia-reperfusion"injury;"Blood"coagulation;"Nicotine

腸缺血再灌注損傷是嚴重創傷、休克和腸移植等疾病常見的并發癥，具有較高的發生率和病死率[1-2]。腸道屏障功能受損和細菌移位是腸缺血過程中的常見并發癥，常導致活性氧和炎性細胞因子的過度釋放，甚至出現細胞凋亡。炎性細胞因子大量的釋放進入循環系統，造成內皮細胞受損，從而引起抗凝和纖容抑制，導致血管內外纖維蛋白沉積，出現凝血和纖溶功能紊亂，使得微循環障礙進一步加劇，最終導致多器官衰竭[3-4]。前期研究表明，大鼠內毒素血癥導致的凝血和纖溶功能紊亂，可以通過電刺激足三里穴使膽堿能抗炎通路激活，進而導致炎性細胞因子的釋放減少從而得到明顯的改善[5]。因此，本研究擬通過夾閉腸系膜上動脈復制大鼠腸缺血再灌注損傷動物模型，探討膽堿能激動劑煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷時凝血功能的影響。

1""材料與方法

1.1""實驗動物與分組

SPF級健康雄性Sprague"Dawley"大鼠32只，年齡6～8月，體質量250～300g，由廈門大學實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK（閩）2018-0009]。將實驗動物采用隨機數字表法分為4組，每組8只：①假手術（sham"operation，S）組；②腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組；③煙堿（nicotine，NIC）組；④α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。

1.2""模型制備

大鼠腸缺血再灌注損傷模型采用參考文獻[6]中結扎腸系膜上動脈的方法制備。動物自由飲水，在實驗開始前12h停止進食。通過腹腔注射50mg/kg"的1%戊巴比妥納對大鼠進行麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥固定于鼠板上，經常規消毒后鋪巾，沿著腹部正中切開約3.5cm的切口進入腹腔，游離大鼠腸系膜上動脈后，用無損傷動脈夾將其夾閉，45min后松開動脈夾以恢復再灌注。待腸系膜上動脈重新恢復搏動后將腸管回納入腹腔并逐層關腹。S組僅分離不夾閉腸系膜上動脈，α-BGT組在腸系膜上動脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT"1μg/kg，煙堿400μg/kg。NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，"S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，余均同α-BGT組。

1.3""標本采集

在大鼠恢復再灌注120min后，通過腹腔注射50mg/kg"1%戊巴比妥納麻醉大鼠，將2.7ml取自于腹主動脈的血樣于含枸櫞酸鈉抗凝管中并持續靜置15min，再在4℃的離心機（3000g）離心10min，收集離心后的上清液，貯存于–20℃冰箱中待用，血漿中瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor，TNF-α）、組織因子（tissue"factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue"plasminogen"activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平采用ELISA法來測定。取血1ml置于含乙二胺四乙酸二鉀鹽抗凝采血管中，使用全自動血細胞分析儀進行血小板計數。取離回盲瓣5cm處小腸組織制成標本，進行小腸組織損傷病理評分。

1.4""小腸組織損傷病理評分

采用10%甲醛溶液固定遠端回腸，進行石蠟包埋，常規制備HE染色切片，并在光學顯微鏡下觀察小腸病理損傷情況，參考文獻[7]采用Chiu評分法評判小腸黏膜損傷程度。

1.5""統計學方法

采用SPSS"20.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與S組相比均出現明顯升高，而AT水平則降低，血小板計數減少（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）；IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與NIC組相比均出現明顯升高，AT水平降低，血小板計數（platelet，PLT）減少（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）。見表1，表2。

3""討論

腸缺血再灌注損傷是導致臨床危重癥患者出現多器官衰竭的重要原因，其病理生理機制主要是過度釋放炎癥細胞因子、趨化因子和氧自由基，從而造成局部和遠隔器官受損，同時伴有血管內皮細胞的損傷[8-9]。研究顯示，腸缺血再灌注時血管內皮細胞受損，從而激活凝血系統，抑制纖溶系統，最終出現微循環功能障礙[2]。

機體的主要抗凝系統為AT系統和TF系統，其中AT在缺血再灌注損傷時直接抑制內皮細胞上的糖胺的表達和凝血酶的蛋白水解活性，其是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。在感染時，AT因為合成受阻及消耗過多等原因常常導致其水平下降[3，10]。當腸缺血再灌注損傷發生時，機體釋放大量的炎性細胞因子TNF-α，導致血管內皮細胞過度的釋放TF、TF與凝血因子FⅦa或Ⅹa形成復合物激活外源性的凝血系統[11]。TF-FVIIα復合物又可以引起TNF-α的合成和釋放。TNF-α激活炎性細胞因子級聯反應，誘導TF表達，進一步促進炎癥級聯反應與凝血反應的相互作用，形成一個持續不斷的惡性循環[12]。在生理性凝血過程中血小板起著關鍵性的作用，在急性炎癥反應時，凝血功能出現異常，是由于血小板大量被消耗所致。本實驗結果顯示，IR組小腸組織Chiu評分、血漿TNF-α和TF明顯高于S組，AT和血小板較S組降低，證明模型制備成功。

在正常生理狀態下，血液中的tPA水平維持在一個特定的水平內，當出現急性炎癥反應時，TNFα刺激血液中PAI-1水平升高，血管內皮細胞釋放大量的tPA入血，隨后tPA與PAI-1形成復合物，抑制纖溶功能，導致血管內纖維蛋白降解物D-二聚體增[13]。

本實驗選擇給予煙堿的時機和劑量是根據文獻[14]來確定的，結果發現，大鼠小腸組織Chiu評分在腸缺血再灌注損傷后顯劇升高，血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平上升，而AT含量與血小板計數下降，大鼠小腸組織Chiu評分在給予煙堿處理后明顯低于IR組，且與IR組相比血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平降低，AT水平及血小板計數增加，這說明煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷的炎癥反應具有抑制作用，并使紊亂的凝血功能得到改善。而在預先給予α7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑α-銀環蛇毒素后，煙堿對大鼠炎癥和凝血功能的改善被阻斷，表明煙堿對腸缺血再灌注大鼠凝血功能的影響主要通過與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結合而發揮作用的。

煙堿對腸缺血再灌注損傷時凝血功能的影響可能是通過與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體相結合，導致膽堿能抗炎通路被激活，從而抑制炎癥反應，進而導致紊亂的凝血和纖溶功能得到改善。炎癥系統和凝血系統在腸缺血再灌注損傷時相互激活，其中炎性細胞因子TNF-α在激活凝血系統時發揮了關鍵作用。有研究表明，TNF-α可造成機體組織因子過度表達，進而引起凝血系統的激活，并抑制抗凝血和纖溶功能[15-16]。研究證明，α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑能夠抑制腸上皮細胞在缺氧/復氧條件下發生的炎癥反應和氧化損傷，其主要機制是通過膽堿能抗炎通路的激活來實現的[4]。劉薇等[14]經研究后發現，煙堿對內毒素大鼠凝血和纖溶功能具有明顯的改善作用，其機制可能是煙堿與α7煙堿型乙酰膽堿受體結合，通過膽堿能抗炎通路的激活來抑制炎癥反應而發揮作用。

綜上所述，預先給予煙堿，可以有效地改善腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能，其作用機制可能是煙堿與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結合，繼而激活膽堿能抗炎通路，導致炎性細胞因子的釋放減少，從而減輕內皮細胞的損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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