基于drop-off ddPCR方法檢測急性髓系白血病C-KIT基因N822位點突變及其臨床應(yīng)用

［摘要］ 目的： 建立急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者C-KIT基因N822位點突變的drop-off微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）定量檢測方法，并評價其臨床應(yīng)用價值。方法： 針對C-KIT基因第17外顯子設(shè)計一對引物及探針，優(yōu)化drop-off ddPCR反應(yīng)條件及體系，評價該方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性，使用所建立的方法對140例已行Sanger測序的AML初診患者骨髓標(biāo)本進行檢測，并用二代測序（next generation sequencing，NGS）驗證結(jié)果；用drop-off ddPCR對3例陽性患者化療后C-KIT突變頻率進行動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果： drop-off ddPCR檢測C-KIT基因N822位點突變的最適退火溫度為54 ℃，空白檢測限為1.62拷貝數(shù)/μL，最低檢測下限為10.12拷貝數(shù)/μL，線性良好。140例AML初診患者樣本中Sanger測序檢出2例陽性（1.4%），而ddPCR共檢出突變7例（5.0%），突變頻率為0.29%～7.41%；進一步應(yīng)用常規(guī)NGS方法對ddPCR陽性樣本進行驗證，共檢出陽性3例（2.1%），等位基因頻率為1.26%～8.00%。動態(tài)監(jiān)測3例陽性患者C-KIT突變頻率，結(jié)果顯示治療達完全緩解時C-KIT突變頻率明顯下降甚至降低至0。結(jié)論： 本研究建立了檢測C-KIT基因N822位點突變的drop-off ddPCR技術(shù)，具有良好的方法學(xué)檢測性能，其靈敏度高于Sanger測序和NGS，有望用于陽性患者緩解后的可檢測殘留疾病監(jiān)測及治療指導(dǎo)。

［關(guān)鍵詞］ drop-off微滴式數(shù)字PCR；C-KIT基因；基因突變；微小殘留??；急性髓系白血病；預(yù)后

［中圖分類號］ R733.71

［文獻標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）02-0151-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230124

［引用格式］李婷，金曄，袁倩，等. 基于drop-off ddPCR方法檢測急性髓系白血病C-KIT基因N822位點突變及其臨床應(yīng)用［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2024， 34（2）： 151-155，160.

Drop-off ddPCR-based method for detecting mutations in C-KIT gene N822 locus and its clinical application in acute myeloid leukemia

LI Ting1， JIN Ye1， YUAN Qian2，3， YAO Dongming2，3， XIANG Helin1， XIAO Gaofei2，3， YU Di1， LENG Jiayan1， LIN Jiang2，3， QIAN Jun1，2，3

（1. Department of Hematology， 2. Laboratory Center， 3. Zhenjiang Clinical Research Center of Hematology， Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212002， China）

［Abstract］ Objective： To develop a quantitative drop-off ddPCR technique for identifying of mutations at the C-KIT gene′s N822 locus in patients with acute myeloid leukemia （AML）， and assess the methodological performance and its clinical value. Methods： A pair of primers and probes were designed for the exon 17 of C-KIT gene. The system and reaction conditions of drop-off ddPCR were optimized. The method′s specificity， sensitivity， and repeatability were assessed. The established method was used to test bone marrow samples from 140 newly diagnosed AML patients previously Sanger sequenced， and the results were further confirmed by next generation sequencing （NGS）. In addition， the KIT-N822 mutation frequency was monitored dynamically in 3 patients by drop-off ddPCR. Results： The optimal annealing temperature of drop-off ddPCR for the KIT-N822 mutation was 54 ℃. With good linearity， the limit of detection was 10.12 copies/μL， and the limit of blank was 1.62 copies/μL. Among 140 AML samples， Sanger sequencing detected only 2 positive cases （1.43%）， however， ddPCR identified 7 positive （5.00%） with mutation frequency of 0.29%～7.41%， among which NGS found only 3 positive cases （2.1%） with variant allele frequencies ranging from 1.26% to 8.00%. The results showed that the C-KIT mutation frequency decreased significantly or even to 0 when the treatment reached complete remission. Conclusion： The drop-off ddPCR method for detecting KIT-N822 mutations was developed with better methodological performance and higher sensitivity than both Sanger sequencing and NGS. It maybe employed for monitoring measurable residual disease and guiding treatment following remission in positive patients.

［Key words］ drop-off ddPCR; C-KIT gene; gene mutation; measurable residual disease; acute myeloid leukemia; prognosis

C-KIT基因編碼Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受體，其過表達或突變激活在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的發(fā)病及預(yù)后中起重要作用［1-2］。C-KIT基因突變常發(fā)生于t（8;21）、inv（16）或t（16;16）的AML患者［3-4］，是預(yù)后不良指標(biāo)之一。攜帶C-KIT基因突變的AML患者往往預(yù)后差，完全緩解后復(fù)發(fā)風(fēng)險高，中國指南將此類患者納入中等預(yù)后組［5-7］。歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)工作組建議將C-KIT基因突變與其他標(biāo)志物聯(lián)合用于可檢測殘留疾病（measurable residual disease，MRD）監(jiān)測［8］。本研究旨在建立基于drop-off微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)檢測C-KIT基因N822位點突變的方法，以期用于AML預(yù)后評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測及治療指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2007年1月至2019年12月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院就診的140例初診AML（非M3型）患者，其中男77例，女63例，中位年齡57.5歲。參與研究的患者均簽署了知情同意書。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡在18周歲以上；② 其完整病例信息在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院可獲得；③ 初診AML并且未接受治療。不滿足上述3條標(biāo)準(zhǔn)的患者均排除在研究之外。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號K-20180063-Y）。

1.2 標(biāo)本處理及DNA提取

留取所有研究對象的骨髓標(biāo)本，肝素抗凝，使用Ficoll細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）提取骨髓單個核細胞，并用Trizol試劑（美國Thermo Fisher公司）提取DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物及探針設(shè)計

針對C-KIT基因N822突變的DNA序列設(shè)計一對特異性引物及探針，序列如下：正向引物5′-TTGGCAGCCAGAAATATCCT-3′；反向引物5′-GCAGAG-AATGGGTACTCACG-3′；突變位點外野生型探針5′-VICCTTTGTGATCCGACCATGAGT-BHQ1-3′；突變位點野生型探針5′-FAMTGATTCTAATTATGTGG-MGB-3′，上述引物及探針均由上海華大基因有限公司合成。

1.4 drop-off ddPCR反應(yīng)體系配置

使用ddPCR通用試劑盒（江蘇圣極基因科技公司）配置反應(yīng)預(yù)混液，包括10×dPCR反應(yīng)緩沖液3.5 μL、dPCR酶1.0 μL、正向引物1.0 μL、反向引物1.0 μL、突變位點外野生型探針0.7 μL、突變位點野生型探針0.7 μL、待測DNA模板5.0 μL，加入無核酶水至35 μL（引物及探針均統(tǒng)一調(diào)整濃度至10 μmol/L）。使用液滴制備儀將充分混勻的預(yù)混液制備成裝有微滴的芯片后，置于PCR擴增儀內(nèi)進行熱循環(huán)反應(yīng)，ddPCR擴增反應(yīng)程序設(shè)置為50 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，54 ℃ 40 s，循環(huán)周期45次，最后以25 ℃保持。擴增反應(yīng)結(jié)束后將芯片轉(zhuǎn)移至生物芯片閱讀儀上，對每個液滴的熒光信號進行檢測，基于泊松分布計算出該樣本C-KIT基因N822位點突變負荷水平。等位基因頻率（%）=（1-FAM通道所示拷貝數(shù)/VIC通道所示拷貝數(shù)）×100%。

1.5 drop-off ddPCR方法學(xué)性能評價

根據(jù)美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會發(fā)布的EP17-A指南，重復(fù)檢測野生型質(zhì)粒，計算空白檢測限（limit of blank，LOB），重復(fù)檢測低濃度樣本，計算最低檢測限（limit of detection，LOD），其中，野生型樣本為C-KIT基因N822位點突變陰性的質(zhì)粒，低濃度樣本為在野生型樣本的背景下加入KIT-N822突變質(zhì)粒。根據(jù)CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》對該方法進行驗證［9］。用ddPCR分別檢測野生型樣本和已知突變樣本，評價該方法的特異性。用drop-off ddPCR重復(fù)檢測低濃度樣本10次，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以CV＜5%作為評價重復(fù)性的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 drop-off ddPCR檢測臨床標(biāo)本及NGS驗證

采用優(yōu)化后的ddPCR反應(yīng)體系及條件對140例已行Sanger測序的AML初診患者臨床樣本進行檢測，基于計算所得的LOB及LOD，將各個樣本的檢測結(jié)果區(qū)分為陰性與陽性，其中陽性樣本進一步進行常規(guī)二代測序（next generation sequencing，NGS）檢測，測序深度大于500 X，由南京金域醫(yī)學(xué)檢驗所完成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0及GraphPad Prism 9.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計數(shù)資料用率（%）表示。采用Pearson檢驗和線性回歸方程對ddPCR線性檢測進行相關(guān)性分析，評價其方法學(xué)特性，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特異性及重復(fù)性驗證

用drop-off ddPCR檢測已知KIT-N822K突變型樣本，F(xiàn)AM通道可見突變型液滴，且與野生型液滴區(qū)分明顯，檢測野生型樣本及已知KIT-D816V突變樣本，僅可見空白液滴及野生型液滴，結(jié)果如圖1所示，表明該方法特異性較好。用drop-off ddPCR重復(fù)檢測低濃度樣本（理論濃度為20拷貝數(shù)/μL）10次，陽性率為100%，且CVlt;5%（4.46%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 線性及檢測限驗證

用drop-off ddPCR重復(fù)檢測野生型質(zhì)粒23次，計算出LOB為1.62拷貝數(shù)/μL，將KIT-N822K突變質(zhì)粒定量后，用TE緩沖液將其稀釋至理論濃度為20拷貝數(shù)/μL，重復(fù)檢測20次，計算出LOD為10.12拷貝數(shù)/μL。選擇已知突變頻率的KIT-N822K突變樣本，用野生型樣本對其進行倍比稀釋，制備成理論突變頻率為5.00%、1.00%、0.50%、0.20%、0.10%、0.05%及0.02%的樣本，用drop-off ddPCR對每個濃度樣本重復(fù)檢測3次，測得的實際突變頻率取平均值，結(jié)果如圖2所示。理論突變頻率與相對應(yīng)的實際突變頻率平均值呈良好線性關(guān)系（R2＝0.999，P＜0.001），結(jié)果見圖3。

2.3 臨床樣本檢測

140例初診AML患者樣本中，Sanger測序僅檢出2例陽性（1.43%），而drop-off ddPCR方法共檢出突變7例（表1），突變頻率為0.29%～7.41%（中位頻率1.42%），結(jié)果如圖4所示。將ddPCR檢測陽性樣本送NGS進一步驗證，共檢出KIT-N822K突變3例（表2），測序深度為585～2142 X，等位基因頻率為1.26%～8.00%，其中2例為c.2466T＞G改變、1例為c.2466T＞A改變。4例ddPCR檢測為陽性而NGS檢測為陰性的樣本，ddPCR檢測其突變頻率為0.29%～1.42%（中位突變頻率1.35%）。隨后用ddPCR動態(tài)監(jiān)測3例陽性患者化療后C-KIT突變頻率，結(jié)果如圖5所示，3例患者化療達到完全緩解時C-KIT突變頻率明顯下降甚至降低至0。

3 討論

AML是一種高度異質(zhì)性的血液腫瘤［10］，眾多研究揭示分子標(biāo)志物在AML患者的預(yù)后評估、靶向治療以及MRD評價等方面具有越來越重要的作用［11］。C-KIT基因突變在AML患者中相對少見（約占6%），主要在伴有t（8;21）、inv（16）或t（16;16）的AML病例中觀察到約占CBF-AML患者的30%［12-13］，這些突變最常發(fā)生于編碼激酶激活環(huán)的第17外顯子，其臨床意義與突變類型密切相關(guān)。研究表明，N822突變的克隆較D816突變衰退或消失得更快，且對于酪氨酸激酶抑制劑的療效優(yōu)于D816突變［5］。在AML細胞中，N822K Tgt;A基因突變通過阻斷C-KIT活化，啟動了C-KIT介導(dǎo)的凋亡/自噬通路，這表明C-KIT N822K突變或許可作為AML的治療靶點［14］。

目前檢測C-KIT基因突變的方法有很多種，主要包括Sanger測序、qPCR、NGS等，其中，Sanger測序因靈敏度較低（15%～20%），不適用于MRD監(jiān)測；RQ-PCR雖靈敏度高，但為相對定量，無法清晰展示病程中突變負荷水平的動態(tài)變化；NGS具有高通量、靈敏度高等優(yōu)點，但因其費用昂貴、操作復(fù)雜、耗時長、對樣本質(zhì)量要求高等，難以用于單基因動態(tài)的MRD監(jiān)測。ddPCR是將樣本劃分為數(shù)萬個獨立的分區(qū)，每個分區(qū)獨立進行PCR反應(yīng)，通過對包含擴增靶序列的分區(qū)進行熒光檢測來確定樣品中目標(biāo)序列的起始濃度。與NGS相比，ddPCR雖不能對全基因組進行測序，但對于特定熱點突變的檢測更為便捷、經(jīng)濟和省時。

傳統(tǒng)ddPCR是針對突變熱點區(qū)域設(shè)計一根突變型探針，在該區(qū)域外設(shè)計一根野生型探針作為參照，對于某種特定的突變類型具有高度特異性。drop-off ddPCR方法在此基礎(chǔ)上對探針進行了優(yōu)化，它根據(jù)突變位點區(qū)域設(shè)計兩根野生型探針，一條位于突變位點上，一條位于突變位點外，當(dāng)該突變位點出現(xiàn)突變時，對應(yīng)的野生型探針則無法與模板緊密結(jié)合，這種方法僅用一對探針和引物就可以檢出多種突變。

本研究基于drop-off ddPCR技術(shù)建立了一種檢測C-KIT基因N822位點突變的方法，該方法特異性強，靈敏度可達0.1%，并且檢測5拷貝數(shù)/μL以上濃度的樣本重復(fù)性及線性關(guān)系良好。用該方法對140例初診AML患者的骨髓標(biāo)本進行檢測，共檢出陽性7例（5.00%），突變頻率為0.29%～7.41%，而Sanger測序僅檢出陽性2例（1.43%），將這7例陽性標(biāo)本進行常規(guī)NGS檢測，僅檢出陽性3例（2.14%），測序深度為585～2142 X，突變頻率為1.26%～8.00%，由此表明ddPCR對于低頻突變的檢出能力優(yōu)于Sanger測序及常規(guī)NGS。

因具有特異性強、通量高、對低頻突變靈敏度高等特點，ddPCR對于AML患者化療后的MRD監(jiān)測有明顯優(yōu)勢。但由于AML的高度異質(zhì)性、復(fù)發(fā)時可能出現(xiàn)的微小亞克隆以及病程中發(fā)生的克隆演化等因素使MRD監(jiān)測變得復(fù)雜化。多項研究表明C-KIT突變克隆在復(fù)發(fā)時往往表現(xiàn)出高度動態(tài)性，一項Meta分析顯示初診時伴有C-KIT突變的AML患者，在復(fù)發(fā)時約30%會出現(xiàn)克隆丟失［15］，故C-KIT基因突變需要與腎母細胞瘤蛋白1、融合基因等其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用于AML患者化療后的MRD監(jiān)測。

本研究用建立的ddPCR方法對3例C-KIT突變患者化療后突變負荷水平進行了動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示，化療后達完全緩解時突變負荷水平降低至0，并且在后續(xù)隨訪中均未檢出突變。但作為一項回顧性研究，本次研究樣本數(shù)量較少，今后還需收集更多樣本進一步分析C-KIT基因突變在疾病進展過程中的克隆演變情況，以指導(dǎo)個性化治療。

總之，本研究基于drop-off ddPCR技術(shù)建立了檢測C-KIT基因N822位點突變的方法，該方法重復(fù)性好，靈敏度高，可用于AML患者初診時C-KIT基因突變的篩查及預(yù)后評估，并有潛在可能與其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用于MRD監(jiān)測，從而更早地預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險，指導(dǎo)及時調(diào)整治療方案，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

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［收稿日期］ 2023-04-16" ［編輯］ 郭 欣

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（82270179，81970118）；鎮(zhèn)江市血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心項目（SS2018009）；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目（SH2022026，SH2021052）

［作者簡介］李婷（1996—），女，碩士研究生；錢軍（通訊作者），主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： qianjun0007@hotmail.com