美洲大蠊提取物CⅡ-3調控p16INK4a誘導SKOV3細胞衰老

摘要：目的 探討美洲大蠊提取物CⅡ-3調控p16INK4a蛋白誘導卵巢癌細胞SKOV3衰老的作用。方法 通過CCK-8法測定不同濃度和時間美洲大蠊提取物CⅡ-3對SKOV3細胞增殖的作用；運用細胞集落形成實驗測定美洲大蠊提取物CⅡ-3對SKOV3細胞增殖能力的影響；流式細胞術檢測CⅡ-3作用后SKOV3細胞周期的變化；衰老相關-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色檢測CⅡ-3作用后SKOV3細胞衰老變化；Western Blotting檢測CⅡ-3作用后SKOV3細胞衰老調控分子p16INK4a蛋白表達的變化。結果 美洲大蠊提取物CⅡ-3可有效抑制SKOV3細胞增殖，最佳作用濃度為80 μg/mL，作用時間為48 h；CⅡ-3作用后，SKOV3細胞集落形成能力下降；阻滯于G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減少；SA-β-Gal陽性細胞百分比增加；衰老調控分子p16INK4a蛋白表達上調。結論 美洲大蠊提取物CⅡ-3通過調控衰老調控分子p16INK4a蛋白表達誘導SKOV3細胞衰老。

關鍵詞：美洲大蠊提取物CⅡ-3；SKOV3細胞；衰老；p16INK4a蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1674490X.2024.01.001

中圖分類號：R737.31文獻標志碼：A文章編號：1674490X（2024）01-0001-08

Periplaneta americana extract CⅡ-3 inducing SKOV3 cells aging by regulating p16INK4a protein

BI Ziying1，ZHOU Yue1，ZHANG Chenggui2，LIU Heng2，WANG Xiaobo1，TIAN Lu1，WU Ting1

（1.School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，China；2.Yunnan Key Laboratory of Insect Biomedical Research and Development，Dali 671000，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of Periplaneta americana extract CⅡ-3 in regulating p16INK4a protein in inducing SKOV3 aging. Methods SKOV3 cells were treated with different concentrations of Periplaneta americana extract CⅡ-3，and the effects of CⅡ-3 on the proliferation of SKOV3 cells were detected by CCK-8 assay. The effect of Periplaneta americana extract CⅡ-3 on the colony formation of SKOV3 cells was determined by colony culture experiments. SKOV3 cell cycle changes after CⅡ-3 action were examined with flow cytometry detection. Senescence changes in SKOV3 cells after CⅡ-3 action were determined with SA-β-Gal staining detects. Western Blotting was used to detect the effects of CⅡ-3 on SKOV3 cells phosphorylated p16INK4a protein expression. Results Periplaneta americana extract CⅡ-3 could effectively inhibit the proliferation of SKOV3 cells， and the optimal concentration was 80 μg/mL and an action time was 48 h. The colony formation ratio of SKOV3 cells were reduced after the effect of Periplaneta americana extract CⅡ-3 on SKOV3 cells， the proportion of cells blocked in G0/G1 phase were increased， the proportion of cells in S phase decreased， the percentage of positive cells of SA-β-Gal was increased and the upregulation of the expression of the aging regulatory molecule p16INK4a protein were raised. Conclusion Periplaneta americana extract CⅡ-3 could induce senescence in SKOV3 cells by modulating protein expression of the senescence regulatory molecule p16INK4a.

Key words： Periplaneta americana extract CⅡ-3； SKOV3 cells；senescence；p16INK4a protein

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性程度較高的腫瘤之一，病死率位于婦科腫瘤之首［1-2］。目前，常用于治療卵巢癌的方法為手術治療、化療、靶向藥物治療，雖然這些方法具有良好的療效，但會引起耐藥性以及藥物毒副作用。因此，尋找低毒有效的卵巢癌治療藥物是卵巢癌治療研究的新舉措。

較多天然藥物有效成分具有良好的抗腫瘤活性且毒副作用小，美洲大蠊是傳統的天然藥物，在古本草中以“蜚蠊”之名入藥，主要用于活血化瘀、消腫鎮痛、解毒消疳等［3］。目前，美洲大蠊在臨床應用中具有良好的療效，已被開發為藥物并廣泛應用于臨床，如心脈隆注射液、康復新液、肝龍膠囊［4］，近年來美洲大蠊在抗腫瘤方面的研究也隨之越來越廣泛，美洲大蠊提取物CⅡ-3是一種小分子肽類物質，具有較好的抗腫瘤活性［5］，可抑制人宮頸癌細胞Hela、人前列腺癌PC3細胞［6］和人卵巢癌細胞HO8910的生長［7］。但目前美洲大蠊提取物CⅡ-3對卵巢癌細胞抑制作用機制尚不明確，本研究將美洲大蠊提取物CⅡ-3作用于卵巢癌SKOV3細胞，探討CⅡ-3對SKOV3細胞的調控作用，探究衰老調控分子p16INK4a在其中的調控作用，為卵巢癌的藥物治療研究提供實驗依據。

1材料

1.1細胞和藥物

SKOV3購于武漢普諾賽生物科技有限公司。美洲大蠊提取物CⅡ-3由大理大學藥學院提供。

1.2實驗材料與試劑

SKOV3專用培養基（普諾賽生物，批號 WH3723G143）；PBS磷酸鹽緩沖液（大連美侖生物科技有限公司，批號 WH0022U091）；胰蛋白酶（Hyclone 公司，批號 MA0232）；CCK-8試劑盒（大連美侖生物科技有限公司，批號 MA0218）；結晶紫染料（天津市光復精細化工研究所，批號 CNAB035-O）；細胞周期檢測試劑盒（Key GEN Bio TECH 公司，批號 KGA512）；SA-β-gal染色試劑盒（碧云天生物，批號 RG0039）；β-actin兔來源抗體（Abcam公司，批號 ab211542）；p16INK4a兔來源抗體（Abcam公司，批號 ab124964）；蛋白裂解液（索萊寶科技有限公司，批號 R0010）；羊抗兔抗體（Abcam公司，批號 ab150077）；ECL化學發光試劑盒（碧云天生物，批號 P0018S）。

1.3主要儀器

CO2培養箱（三洋公司，型號 MCO-18AIC）；實驗室安全柜（安泰空氣技術有限公司，型號 BSC-1301ⅡA2）；倒置顯微鏡（麥克奧迪公司，型號 AE31）；低速臺式離心機（中科中佳公司，型號 SC-3610）；蒸汽壓力滅菌器（上海博迅公司，型號 YXQ-50S1）；多功能酶標儀（BIO-RAD公司，型號 iMARK）；細胞計數板（上海善然生物科技有限公司，型號 AE-H8547）；流式細胞儀（Beckman 公司，型號 Cyto FLEX）；多振幅軌道搖床（上海智誠公司，型號 ZHWY-100H）；垂直電泳轉印系統（BIO-RAD 公司，型號 1658033）；凝膠成像儀（UVP 公司，型號 GDS8000）；蛋白轉膜系統（BIO-RAD 公司，型號 1704150）。

2實驗方法

2.1細胞培養

用SKOV3專用培養基培養SKOV3細胞，培養條件為37 ℃、5% CO2環境，倒置顯微鏡下觀察細胞密度達到80% 以上時，用胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液，以1∶3傳代培養。

2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力

收集對數生長期的SKOV3細胞，計數，細胞以1×103/孔接種于96孔板中，輕輕搖晃使細胞均勻分布于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養過夜，加入終濃度分別為10、20、40、80、120、140、160 μg/mL的美洲大蠊提取物CⅡ-3，每組設置3個復孔，在24 h、48 h、72 h檢測點，加入CCK-8溶液，孵育1 h。酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度（A），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=［（A對照組-ACⅡ-3組）/（A對照組-A空白組）］×100%。

2.3細胞集落形成實驗

收集對數生長期的SKOV3細胞，計數，細胞以1×103/孔接種于6孔板中，培養箱內培養過夜，將對照組（僅有SKOV3細胞、培養基和美洲大蠊提取物CⅡ-3同等劑量的PBS，不加CⅡ-3，以下簡稱“對照組”）和CⅡ-3組（加入終濃度為80 μg/mL的美洲大蠊提取物CⅡ-3，作用時間為48 h，以下簡稱“CⅡ-3組”）置于37 ℃、5% CO2培養箱內分別培養48 h后，換液，培養7 d，每3 d更換1次新的培養液，顯微鏡下觀察，單個細胞團中細胞數＞50個為1個細胞集落，結晶紫染色，計算細胞集落形成率。細胞集落形成率（%）=（細胞平均集落數/每孔加入的細胞數）×100%。

2.4流式細胞術分析細胞周期

收集對照組和CⅡ-3組的SKOV3細胞，用50 μL PBS制成細胞懸液，加入1 mL 75 %無水乙醇，-20 ℃固定過夜，洗滌細胞，用碘化丙啶染色，避光、37 ℃條件下溫浴30 min，流式細胞儀檢測波長488 nm處熒光強度。

2.5SA-β-Gal衰老染色

收集對數生長期的SKOV3細胞，計數，細胞以1×106/孔接種于6孔板中，每孔2 mL培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h后，如前所述處理細胞，將對照組和CⅡ-3組的SKOV3細胞分別培養48 h后，棄去培養液，用PBS洗滌2次，固定液常溫固定15 min；再用 PBS 洗滌3次，每次3 min；棄去PBS，每孔加入1 mL配制好的染色液，避光、37 ℃條件下孵育過夜，計算衰老陽性細胞百分率。染成藍色的細胞為衰老陽性細胞，隨機計數400個細胞中的衰老染色陽性細胞數。

2.6蛋白質印跡法檢測p16INK4a蛋白表達

收集對照組和CⅡ-3組的SKOV3細胞，PBS洗滌2次，用蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA測定蛋白濃度，將樣本按等量的蛋白量在10% SDS-PAGE中電泳，轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌1次，4 ℃ 條件下一抗（1︰1 000）孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，室溫條件下二抗（1︰1 000）孵育2 h，TBST緩沖液洗膜3次，ECL顯色，凝膠成像儀拍照，計數蛋白相對表達量。蛋白相對表達量=目標蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。

2.7統計分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，多組間均值比較采用重復測量雙因素方差分析，兩組間比較采用 Tukey 檢驗，計量資料以x±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1CⅡ-3對SKOV3細胞增殖能力的影響

不同作用濃度和時間的CⅡ-3，對SKOV3細胞的增殖有不同程度的抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.000 1），當CⅡ-3作用時間為48 h，作用濃度為80 μg/mL時，CⅡ-3對SKOV3細胞的抑制作用最佳（P＜0.000 1）。因此，選用 80 μg/mL CⅡ-3，作用于SKOV3細胞48 h進行后續實驗，見表1。

3.2CⅡ-3對SKOV3細胞集落形成能力的影響

與對照組比較，CⅡ-3組SKOV3細胞形成集落數量減少（P＜0.000 1），提示CⅡ-3具有降低SKOV3細胞集落形成的能力，見表2、圖1。

3.3CⅡ-3對SKOV3細胞周期的影響

流式細胞術結果圖2A中，第1個峰為G0/G1期，第2個峰為G2/M 期，平臺為S期。結果顯示，與對照組比較，CⅡ-3組S期的細胞比例降低（P＜0.01），G0/G1期的細胞比例升高（P＜0.01），G2/M期的細胞比例升高（P＜0.05），提示CⅡ-3作用后SKOV3細胞周期阻滯于G0/G1期，見表3、圖2。

3.4CⅡ-3對SKOV3細胞SA-β-Gal染色的影響

SA-β-Gal染色顯示，藍色為陽性細胞；未著色為陰性細胞。與對照組相比，CⅡ-3組衰老細胞增多（P＜0.000 1），提示CⅡ-3具有促進SKOV3細胞衰老的作用，見表4、圖3。

3.5CⅡ-3對SKOV3細胞p16INK4a表達的影響

蛋白質印跡法結果顯示，與對照組比較，CⅡ-3組p16INK4a蛋白表達上調，差異有統計學意義（P＜0.01），提示CⅡ-3能夠有效促進SKOV3細胞衰老，見表5、圖4。

4討論

細胞衰老是一種不可逆的細胞周期停滯狀態，抑制了細胞的增殖，限制了細胞的壽命，是一種腫瘤抑制機制［8］。近年來越來越多研究顯示，通過誘導癌細胞衰老可達到抑制癌細胞生長和增殖的效果［9］。研究［10］表明，奧拉帕尼通過誘導卵巢癌細胞SKOV3、A2780和OVCAR-3細胞衰老，可抑制其增殖。因此，誘導細胞衰老也是一種有效的抗腫瘤機制，這種抗腫瘤機制促進了癌癥治療的發展。本研究通過CCK-8法測定美洲大蠊提取物CⅡ-3對SKOV3細胞的抑制作用，實驗結果顯示，CⅡ-3可以抑制SKOV3細胞的增殖，當CⅡ-3濃度為80 μg/mL，作用SKOV3細胞48 h時，對SKOV3細胞的抑制作用最佳；細胞集落形成實驗是用來檢測細胞增殖能力的重要技術方法，本研究運用集落形成實驗檢測CⅡ-3對SKOV3細胞增殖能力的影響，結果顯示，經80 μg /mL CⅡ-3處理48 h后，SKOV3細胞集落形成能力下降，以上結果提示，美洲大蠊提取物CⅡ-3能有效抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖。細胞周期調控細胞分裂［11］，細胞周期停滯標志著細胞無法繼續分裂，是細胞衰老的重要特征，衰老的細胞常阻滯于細胞周期的G0/G1期，在腫瘤細胞調控中將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期可抑制腫瘤細胞增殖［12-13］。本研究將CⅡ-3作用SKOV3細胞，流式細胞周期檢測結果顯示，CⅡ-3作用后，G0/G1期SKOV3細胞比例增高，S期細胞比例減少，提示細胞增殖能力下降。SA-β-Gal表達陽性是細胞衰老的重要指標［14］，SA-β-Gal陽性細胞著藍色，胞漿內可見藍色顆粒，本研究通過SA-β-Gal染色發現，與對照組比較，CⅡ-3組SKOV3細胞SA-β-Gal染色加深，衰老細胞高于對照組，表明美洲大蠊提取物CⅡ-3作用后，SKOV3細胞出現衰老形態學改變。

p16INK4a是細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑［15］，也是細胞衰老的重要調控分子［16］。p16INK4a上調對細胞衰老和腫瘤抑制至關重要［17］，p16INK4a高表達能夠促進細胞衰老，抑制細胞增殖。蒽環類化療藥物通過促進早期乳腺癌患者體內p16INK4a表達，有效抑制乳腺癌細胞在患者體內增殖［18］，青蒿琥酯通過促進p16INK4a表達，誘導結腸癌細胞SW480細胞衰老，進而有效抑制了SW480細胞增殖［19］。本研究檢測p16INK4a蛋白表達，結果顯示，與對照組相比，CⅡ-3組SKOV3細胞p16INK4a蛋白表達量增加，提示CⅡ-3可上調p16INK4a蛋白表達，誘導SKOV3細胞衰老，抑制SKOV3細胞增殖。

綜上所述，美洲大蠊提取物CⅡ-3可有效誘導SKOV3細胞衰老，CⅡ-3通過上調p16INK4a蛋白表達發揮誘導SKOV3細胞衰老，抑制SKOV3細胞增殖的作用，研究結果可為卵巢癌藥物研究提供實驗依據；CⅡ-3誘導SKOV3細胞衰老的機制錯綜復雜，該結果可為后續進一步深入機制研究奠定基礎。

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（責任編輯：劉俊華）