大豆分離蛋白、豌豆分離蛋白和小麥面筋蛋白相互作用對高水分植物蛋白肉品質特性的影響

俎新宇 趙亞男 陳星爍 王新新 張樹成 趙秀蘭 趙祥忠 梁艷

摘要：混合多種蛋白原料以創造具有所有原料特征的人造肉產品已經在食品領域得到研究。然而，在高水分植物蛋白肉生產領域暫未得到研究，目前也沒有對使用大豆分離蛋白（SPI）、豌豆分離蛋白（PPI）和小麥面筋蛋白（WGP）的混合原料開發植物蛋白肉的研究。該研究的目的是減少植物蛋白肉生產的經濟成本，考察由SPI、PPI和WGP共混制備的植物蛋白肉是否比僅用SPI和PPI、SPI和WGP制備的植物蛋白肉具有更好的品質特性以及考察SPI、PPI和WGP以不同比例混合時蛋白之間的相互作用對高水分植物蛋白肉品質特性的影響。研究結果表明，WGP占比的增加增大了產品的硬度和咀嚼性，所有的混合原料基樣品均呈現很好的組織化結構，當樣品配比為P20W30時達到了最高的組織化度（2.14±0.07），混合蛋白原料也使產品的持水率增加，表觀觀察和SEM也顯示3種混合蛋白原料產品有著更好的拉絲效果和纖維化結構，此外，傅里葉變換紅外光譜表明混合蛋白原料產品主要以穩定的β結構存在，WGP占比的增加降低了產品的流變性能。總的來說，該研究表明混合3種蛋白制備的植物蛋白肉有著更好的品質特性。

關鍵詞：混合蛋白；高水分植物蛋白肉；雙螺桿擠壓；品質特性

中圖分類號：TS201.21

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0036-07

Effect of Interaction of Soy Protein Isolate， Pea Protein Isolate and

Wheat Gluten Protein on Quality Characteristics of

High-Moisture Plant Protein Meat

ZU Xin-yu¹， ZHAO Ya-nan¹， CHEN Xing-shuo¹， WANG Xin-xin¹， ZHANG Shu-cheng²，

ZHAO Xiu-lan³， ZHAO Xiang-zhong^1*， LIANG Yan^1*

（1.School of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology （Shandong Academy of

Sciences）， Jinan 250353， China; 2.Yantai Shuangta Food Co.， Ltd.， Zhaoyuan 265404，

China; 3.School of Public Health， Shandong University， Jinan 250100， China）

Abstract： The blending of multiple protein raw materials to create artificial meat products with all raw material characteristics has been investigated in the food field. However， it hasn't been studied in the field of high-moisture plant protein meat production field yet， and there are no studies on the development of plant protein meat using blended raw materials of soy protein isolate （SPI）， pea protein isolate （PPI） and wheat gluten protein （WGP）. The objectives of this study are to reduce the economic cost of plant protein meat production， to investigate whether plant protein meat prepared by blending SPI， PPI and WGP has better quality characteristics than plant protein meat prepared with only SPI and PPI， SPI and WGP， and to investigate the effect of protein interaction when SPI， PPI and WGP are blended in different ratios on the quality characteristics of high-moisture plant protein meat. The results show that the increase of the ratio of WGP increases the hardness and chewiness of the product， and all the blended raw material-based samples show a good texture structure， with the highest texture degree of 2.14±0.07 when the sample ratio is P20W30. Blending protein raw materials also increases the water holding capacity of the product， and the appearance observation and SEM also show that the product of the three blended protein raw materials has better wire drawing effect and fibrotic structure. In addition， Fourier transform infrared spectroscopy indicates that the product of blended protein raw materials mainly exists in a stable β structure， and the increase of WGP ratio reduces the rheological properties of the product. Overall， this study shows that the plant protein meat prepared by blending the three proteins has better quality characteristics.

Key words： blended proteins; high-moisture plant protein meat; twin-screw extrusion; quality characteristics

收稿日期：2023-11-28

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2020CXGC010604）

作者簡介：俎新宇（1999—），男，碩士研究生，研究方向：蛋白質工程。

*通信作者：趙祥忠（1969—），男，副教授，碩士，研究方向：海洋食品與生物技術。

梁艷（1984—），女，副教授，博士，研究方向：蛋白質工程。由于消費者對肉制品可持續替代品的興趣日益增長，植物性肉類類似物的市場潛力不斷增大^[1]。植物蛋白肉的成功與否取決于它們對真正肉類的各種特征的模仿程度。植物蛋白肉因其與傳統肉類食品在理化性質上的相似性、無膽固醇、高營養價值和易加工儲存方面的優勢成為替代傳統肉類食品的最佳選擇^[2-3]。根據制備植物蛋白肉水分含量的不同，分為低水分擠壓（水分含量為20%～40％）和高水分擠壓（水分含量為50%～70%）^[4]。本研究使用高水分擠壓技術，通過雙螺桿擠出機制備的產品纖維化程度更高、質地均勻且富有傳統肉類的彈性、韌性和組織化狀態。尤其是高水分擠壓可以實現低水分擠壓蒸煮過程中不能實現的細膩組織化結構^[5]。

蛋白質原料的質量、種類、含量、功能特性和混合比例是影響植物蛋白肉產品組織化纖維結構形成的關鍵因素，尤其是不同種類蛋白質原料的混合比例是影響植物蛋白肉與真正肉類相似度的關鍵因素^[6]。大豆蛋白因其良好的加工特性、均衡的營養價值和相對低廉的價格而被認為是生產植物蛋白肉的理想選擇^[7]。目前市場上的植物蛋白肉主要以大豆分離蛋白為原料^[8-9]。Lee等^[10]研究了大豆分離蛋白和水稻分離蛋白對植物蛋白肉理化特性的影響，其研究結果表明兩種蛋白組合比僅用一種蛋白制成的肉類類似物具有更好的品質。例如純大豆分離蛋白生產的產品雖然成本較低，但其豆腥味嚴重，且含有潛在的過敏原和抗營養因子^[11]。相比于大豆分離蛋白，豌豆分離蛋白不存在轉基因問題，由于豌豆分離蛋白的低致敏性和高營養價值，且豌豆分離蛋白富含必需氨基酸賴氨酸和支鏈氨基酸，其逐漸成為國內外植物蛋白肉的優質原料^[12]。Kaleda等^[13]以豌豆分離蛋白和燕麥蛋白混合物為原料研究了兩種混合蛋白對植物蛋白肉品質特性的影響，發現添加30%豌豆分離蛋白條件下產品的組織化度最高。小麥面筋蛋白有著優異的黏彈性、伸長率和熱凝固性，所以被廣泛用于生產植物蛋白肉^[8]。小麥面筋蛋白特有的黏彈性使以其作為原料生產的植物蛋白肉更容易形成網狀結構。Schreuders等^[14]研究發現豌豆分離蛋白和小麥面筋蛋白結合在120 ℃下擠壓可以形成具有很好纖維形態的雞胸肉類似物。

本研究的目的是探究SPI、PPI和WGP 3種蛋白以不同比例混合擠壓對植物蛋白肉品質特性的影響，并對SPI、PPI和WGP之間的相互作用對植物蛋白肉組織化度的影響進行研究，通過對植物蛋白肉樣品進行色度、質構、持水性、表觀結構、SEM掃描電鏡、FTIR和流變特性表征，系統探究了混合蛋白原料對植物蛋白肉產品品質特性和組織化度的影響，為開發和生產混合原料基植物蛋白肉產品提供了理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（SPI，純度≥90%）：山東山松生物科技有限公司；豌豆分離蛋白（PPI，純度≥90%）：煙臺雙塔食品股份有限公司；小麥面筋蛋白（WGP，純度≥90%）：封丘縣華豐粉業有限公司；復合磷酸鹽（CP，純度≥90%）：江蘇燕科生物工程有限公司；溴化鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AHT36雙螺桿擠出機 山東真諾智能設備有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；EZ-Test生物力學測試儀 日本島津公司；RH-20流變儀 上海保圣實業發展有限公司；TESCAN MIRA LMS掃描電子顯微鏡 泰思肯貿易（上海）有限公司；NR10QC+色差儀 深圳市三恩時科技有限公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 植物蛋白肉的制備

實驗通過同向旋轉的雙螺桿擠出機進行，擠出機由給料機、高溫擠壓區（分為7個加熱區間）和冷卻模具組成。冷卻模具尺寸為70 mm×100 mm×1 800 mm（寬×高×長），螺桿長度為125 cm，螺桿直徑為4 cm（L/D=31.25）。原料混合物由SPI、PPI和WGP組成，由于研究重點是PPI和WGP的共混，所以SPI的占比是固定的，配方的詳細信息見表1，并向其中加入1%的復合磷酸鹽作為保水劑。參考Xia等^[15]的方法并根據實際情況改進。使用重量給料機將混合均勻的樣品原料以10 kg/h的速率進料到擠出機中。通過入口，以15 kg/h的恒定流量將水注入擠出機中，以獲得最終產品中約60%（濕基）的水分含量。螺桿速度設置為800 r/min，從進料到模具的7個區域中的筒體溫度設定為40，60，80，120，140，160，150 ℃。使用循環水進行冷卻，并將冷卻溫度設置為50 ℃。從冷卻模具的末端收集擠出物，將擠出物冷卻至室溫，使用真空密封器將擠出物真空包裝在塑料袋中，并在－4 ℃下儲存，直到進一步分析，以防止保存期間質量劣變影響實驗結果。

1.3.2 色度分析

使用色度計對樣品的色度進行測量分析。在測量之前，使用標準白板進行校準。參數表示為L^*值（亮度）、a^*值（紅色或綠色）和b^*值（黃色或藍色）。在隨機選擇的位置對每個樣品進行10次測量。標準白板的L₀^*值、a₀^*值和b₀^*值分別為95.13，－0.64和0.68。ΔE表示樣品與白板的色差，數值越大表明色差越大，按公式（1）進行計算：

ΔE=（L^*-L₀^*）²+（a^*-a₀^*）²+（b^*-b₀^*）²。（1）

1.3.3 視覺外觀

將高水分擠壓肉類類似物樣品切割成50 mm×6 mm×50 mm（寬×高×長），然后使用相機拍攝外表面圖、橫切面圖和縱切面圖，所有照片都在黑色背景和LED光照射下拍攝。

1.3.4 硬度分析

使用生物力學測試儀進行硬度測試，分析了不同比例的SPI、PPI和WGP混合原料制備的植物蛋白肉樣品的硬度，將樣品切割成30 mm×7 mm×30 mm（寬×高×長），使用疲勞彈性測試的力學球形探頭以0.5 mm/s的速度下壓樣品，將樣品壓縮至厚度的50%，維持下壓狀態60 s，使球形探頭感受產品的回彈力，取下壓至樣品厚度的40%時探頭感受到的力為樣品的硬度。

1.3.5 嫩度、咀嚼性和組織化度分析

樣品的咀嚼性和組織化度使用Warner-Bratzler實驗來測量，Warner-Bratzler實驗可以通過測試樣品的最大剪切力來反映植物蛋白肉樣品的咀嚼性和組織化度。根據Novakovic＇等^[16]的方法并進行改進，評估樣品的咀嚼性和組織化度。將擠出物切割成15 mm×7 mm×50 mm（寬×高×長）。使用沃布氏切刀沿著擠出方向以1 mm/s的速度垂直（F_L）和水平（F_V）切割樣品。產品的嫩度用F_L表示，組織化度用F_L與F_V的比值表示（見公式（2）），產品的咀嚼性用剪切能（剪切過程中剪切力的積分）表示。每次分析重復10次，以測量每個樣品的F_L和F_V（n=10）。

組織化度=F_LF_V。（2）

1.3.6 持水率測試

采用烘箱干燥法測定高水分植物蛋白肉的持水率（濕基），參考Lee等^[5]的方法并進行改進，取生產48 h后的樣品進行研磨（4～5 g），稱重記為M_i，使用干燥箱于105 ℃干燥24 h。干燥后冷卻1 h至室溫，再次稱重記為M_d。水分含量按公式（3）計算，每個樣品重復5次實驗（n=5）。

水分含量（%）=（M_i-M_d）/M_i×100%。（3）

式中：M_i為干燥前樣品的質量，g；M_d為干燥后樣品的質量，g。

1.3.7 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同樣品的橫截面。將樣品直接黏合在導電黏合劑上，并使用濺射涂布機在10 mA下用金噴涂45 s。然后在掃描電子顯微鏡下以100，300，500倍的放大率觀察樣品，加速電壓為3 kV用于輪廓分析，15 kV用于譜圖繪制。檢測器為SE2二次電子檢測器。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

參考Wang等^[17]的方法并進行改進，取5 mg凍干樣品研磨成粉末并過120目篩，將1～2 mg樣品與100 mg 溴化鉀混合并在研缽中研磨混合物來制備溴化鉀圓盤，將100 mg混合物壓在圓盤中，使用光譜儀記錄IR光譜。掃描次數為64次，分辨率為4 cm^-1，每個樣品測試3次，取平均值。使用OMNIC 9.2.86軟件對紅外圖譜進行基線校正、歸一化和去卷積化處理，使用PeakFit v4.12軟件對4 000～500 cm^-1（酰胺Ⅰ區）進行擬合分析。

1.3.9 流變特性分析

將擠出物冷凍干燥，研磨至粒徑＜500μm，并以20%（質量比）的比例分散在蒸餾水中，攪拌1 h。在流變學測試前，將再水合樣品真空包裝，并在4 ℃冰箱中儲存12 h以上，以確保水分分布均勻。將分散液裝入流變儀平行板（直徑50 mm）正下方，在25 ℃下進行剪切測試，剪切速率為1～100 s^-1。

1.3.10 統計分析

使用方差分析（ANOVA）和皮爾遜相關系數（r）對所有數據進行分析，擠壓響應參數和擠壓物質地之間的皮爾遜相關系數使用SPSS Statistics 23.0進行統計分析。顯著性差異水平P＜0.05為差異顯著。使用Origin 2021軟件制作數據圖。

2 結果和分析

2.1 色度分析

植物蛋白肉的色澤影響著消費者對其的接受程度^[18]。不同SPI、PPI和WGP原料配比對植物蛋白肉色澤的影響見表2。

由表2可知，樣品的L^*值隨著WGP比例的增加而增加，表明樣品的白度不斷增加，這是WGP原料自身的白色導致的，這類高WGP原料的產品更適合模仿雞胸肉。樣品的a^*值和b^*值沒有顯著變化，說明不同原料配比混合添加對樣品的a^*值和b^*值沒有影響，不同比例的混合原料對顏色的影響不大，這更有利于混合原料植物蛋白肉的進一步開發。

2.2 視覺和宏觀狀態分析

在不同PPI和WGP比例條件下通過高水分擠壓得到手動變形植物蛋白肉樣品，通過目測外表結構和內部結構來進行分析。由視覺表面圖（見圖1中A）可以明顯觀察到隨著WGP比例的增大，樣品的顏色逐漸變白，該結果和色度計分析結果一致，SPI、PPI和WGP混合植物蛋白肉更適合模擬白肉，模擬紅肉時可以添加植物衍生的紅色素。所有混合比例的樣品均成型狀態好且結構緊致，沒有斷裂和不成型現象。表面出現了各向異性的擠壓痕跡，這是雙螺桿擠壓導致的正常現象。由橫切面圖（見圖1中B）觀察到樣品的纖維狀結構。SPI、PPI和WGP共混樣品均有著很好的纖維狀結構，但沒有添加WGP的樣品拉絲效果偏硬，纖維粗。隨著WGP占比的增大，纖維逐漸變細，拉絲效果更明顯，該研究結果和Schreuders等^[14]的研究結果一致。本研究在P20W30樣品中觀察到了最優的纖維化結構，表明SPI、PPI和WGP 3種混合蛋白高水分擠壓產品仍然具有致密的組織化結構。由沿垂直擠出方向的切面圖（見圖1中C）可以看到所有樣品均呈現分層狀結構，切面圖照片證實了植物蛋白肉內部結構是由多個U-shaped層堆疊而成，該發現和Lee等^[5]的研究結果一致。在P20W30樣品層狀結構中還出現了明顯的上下拉絲效果，這與質構數據結果一致。

2.3 質構分析

對于市場而言，質構特性是植物蛋白肉產品最重要的屬性。通過力學球形探頭和Warner-Bratzler實驗測試了產品的質構特征，這種測試設計比傳統的TPA測試更具有科學性和參考價值。不同原料配比對高水分植物蛋白肉質構的影響見表3。

由表2可知，隨著WGP比例的增加，樣品的硬度逐漸增大（P＜0.05）。這是由于小麥面筋蛋白有著優異的黏彈性、伸長率和熱凝固性，使其產品更易形成致密的網狀結構，從而導致產品硬度的增大。嫩度和咀嚼性也是植物蛋白肉產品重要的屬性，嫩度值越小表明產品的嫩度越高。實驗結果顯示隨著WGP占比的增加，產品的嫩度值和咀嚼性不斷增大，表明添加WGP導致的致密網狀結構可能會使產品不嫩且更有嚼勁，這類食品更適合年輕人食用，而PPI占比高的產品更嫩，這類食品更適合老年人食用，因為老年人的牙齒和顎骨肌肉衰弱，更喜歡柔軟且易吞咽的食品。

植物蛋白肉的組織化度是一個重要的質構指標，當纖維形成時，橫向切割（F_L）比縱向切割（F_V）需要更大的力，橫向和縱向切割之比反映了擠壓過程中產品組織化形成的程度和強度^[19]。實驗結果表明隨著WGP比例的增加，產品的組織化度先顯著增大后略微減小，在P20W30時達到最大的組織化度，為2.14±0.07。豌豆分離蛋白在120 ℃以上完全變性，已暴露與其他蛋白交聯的鍵合位點，Schreuders等^[14]的研究也表明在120 ℃以上PPI和WGP開始形成纖維，在140 ℃以上WGP和PPI混合擠壓可以形成更多的纖維。本研究中，在160 ℃條件下，大分子的鍵合位點可以暴露出來，允許更多的相互作用，并導致了更大的鍵合作用，從而導致在SPI存在的條件下同時添加PPI和WGP有著更高的纖維化結構^[20]。

2.4 持水率分析

高水分植物蛋白肉的水分含量取決于原料混合物在擠壓過程中保留水分的程度，產品的持水率和原料蛋白種類有著密切的關系。由圖2可知，所有產品的持水率均在44%～53%之間。隨著WGP比例的增加，產品的持水率顯著增加（P＜0.05），這是因為WGP可以在高溫下變性形成致密的網狀結構，從而鎖住水分來減少水分的流失。樣品P0W50的持水率最高，這是因為PPI原料的持水率大約為WGP的50%，原料的差異性導致了產品的持水率不同，該研究結果和Lee等^[5]的研究結果一致，都表明樣品的持水率隨著PPI比例的增加而降低。還可能是因為WGP比例增加導致了樣品內部孔面積減小、孔隙率增加，使得水分不易流失^[21]。

2.5 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

不同原料配比的樣品縱切面的SEM圖像見圖3。

由圖3可知，所有樣品均表現出整齊的孔狀纖維排列結構，這些結構類似真實的肉類纖維。由圖3中A可以明顯看到有許多分布均勻且大小一致的孔隙，這是由于冷凍干燥后的樣品水分缺失，中間出現孔隙。由圖3中C可以看出P50W0樣品的孔隙最大，這是因為樣品經冷凍干燥后拍攝電鏡，PPI使孔面積增大，孔隙率減少，導致樣品的嫩度值減小，嫩度增加，該觀察結果和Warner-Bratzler實驗中測試的產品嫩度值結果一致，結果表明PPI會使產品的孔面積增大。隨著WGP占比的增加，可以明顯看出產品的孔面積減小，但孔隙率增加且分布均勻，這是由于產品原料中的WGP形成多孔網絡結構，使得樣品各向異性降低，此發現和表觀分析結果一致，這種形態使得高WGP占比的產品有著更好的組織化度，拉絲效果明顯，此結果與質構分析結果一致，證實了樣品P20W30有著最好的拉絲效果，和傳統肉類最相似。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜是表征蛋白質結構和構象常用的方法。不同原料配比的植物蛋白肉樣品紅外光譜圖見圖4。

由圖4可知有5個吸收帶，位于約3 300，2 930，1 635，1 520，1 230 cm^-1處。3 300 cm^-1處的吸收帶是因為分子間氫鍵中O—H和N—H的拉伸振動^[22]。WGP占比的增加導致了圖譜的紅移。2 930 cm^-1處的吸收帶是因為蛋白質分子中的—CH₃和—CH₂中碳氫鍵的伸縮振動^[16]。1 635 cm^-1處的吸收帶是酰胺Ⅰ帶，主要歸因于蛋白質中C—O的拉伸。1 520 cm^-1處的吸收帶是酰胺Ⅱ帶，主要歸因于N—H的彎曲振動和C—N的拉伸振動。1 230 cm^-1處的吸收帶是酰胺Ⅲ帶，主要歸因于C—N的拉伸振動和N—H的彎曲振動^[23]。

酰胺Ⅰ區是對蛋白質二級結構敏感的區域，常用酰胺Ⅰ帶來計算蛋白質的二級結構^[24]。樣品中蛋白質二級結構的每個構象所占的比例見表4。

由表4可知，α-螺旋結構約占13%～16%，β-折疊約占44%～45%，β-轉角約占26%～28%，無規則卷曲約占12%～13%。所有原料配比生產的產品都以β-折疊和β-轉角為主要的二級結構，其次是α-螺旋和無規則卷曲，這表明所有樣品主要以穩定的β結構存在，其中樣品P20W30最穩定。

2.7 流變特性分析

對于植物蛋白肉的研究，了解其流變學特性是改善其質量的先決條件。不同原料配比的產品的表觀黏度隨著剪切速率增加的變化見圖5。

由圖5可知，隨著剪切速率的增加，復水粉末樣品的黏度均呈逐漸下降的趨勢，在0～30 s^-1黏度急劇下降，隨著剪切速率的增加，系統所需的剪切應力逐漸穩定，樣品黏度的下降速率變慢并趨于平緩，在剪切速率超過60 s^-1后黏度基本沒有變化，是典型的剪切稀化的非牛頓流體行為，這是由于高濃度的生物聚合物具有典型的剪切減薄行為^[25]。在高水分擠壓中，加入的水主要轉化為擠壓產品中的凍結水，在蛋白質擠壓過程中起到潤滑和降黏的作用。在同一剪切速率下，隨著WGP占比的增加，樣品的黏度也增加，WGP的添加降低了樣品的流變性能。

3 結論

本研究以SPI、PPI和WGP為原料，通過雙螺桿擠出機研究了在高水分擠壓中3種混合蛋白原料對高水分肉類類似物品質特性的影響。結果發現所有樣品的組織化度均大于1，其中P20W30樣品有著最高的組織化度（2.14±0.07），P20W30樣品的視覺拉絲效果和微觀結構各向異性比兩種蛋白混合的P50W0樣品更明顯。隨著WGP比例的增加，樣品的咀嚼性和持水率顯著增加，WGP的添加降低了產品的流變特性，3種混合蛋白原料制備的產品以穩定的β結構存在。總的來說，本研究以SPI為主要原料和其他兩種蛋白混合不僅降低了生產成本，而且對產品的品質特性有著明顯的提升作用，這些結果表明混合蛋白原料制備的植物蛋白肉可以用來模仿真肉。

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