東北酸菜發酵過程中細菌菌群與亞硝酸鹽長消變化關系

張慶芳 袁文濤 孫溪 魏振勇 周姝靜 遲乃玉 于爽

摘要：為探究東北酸菜發酵過程中細菌菌群與亞硝酸鹽長消變化關系，實驗設立了兩種封閉發酵系統，即未添加亞硝酸鹽（自然發酵組）、添加亞硝酸鹽（對照組），結合主要理化指標（亞硝酸鹽、pH值等）對兩個系統內不同發酵階段的酸菜發酵液（相對豐度排名前30）中的菌屬進行比對分析。實驗研究了不同發酵階段有、無添加亞硝酸鹽樣品的菌群變化，結果表明，添加亞硝酸鹽對整個發酵周期中細菌的生長都具有影響，亞硝酸鹽使優勢乳酸菌菌屬（Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus）、α-變形菌菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Aureimonas、Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas）、β-變形菌菌屬（Acidovorax、Aquabacterium、Comamonas、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus）、CFB類菌屬（Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium）和未培養菌屬（Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast）在發酵初期相對豐度增加；使致病菌菌屬（Acinetobacter、Alkanindiges、Chryseobacterium、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae）相對豐度始終處于低水平狀態。在S系統內，發酵前期為亞硝酸鹽積累階段，此時Lactococcus、Leuconostoc為優勢乳酸菌菌屬，而達到發酵中后期時Lactobacillus成為絕對優勢乳酸菌菌屬；在發酵初期，Acinetobacter、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae等致病菌大量繁殖，導致亞硝酸鹽大量積累，而積累的亞硝酸鹽使這些致病菌的相對豐度始終處于低水平狀態，其中對Serratia的生長影響最顯著。

關鍵詞：東北酸菜；亞硝酸鹽；細菌菌群；優勢乳酸菌；致病菌

中圖分類號：TS255.53

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0050-14

Relationships Between Bacterial Flora and Growth and Decline of Nitrite

During Fermentation of Northeast Sauerkraut

ZHANG Qing-fang^1，2， YUAN Wen-tao^1，2， SUN Xi^1，2， WEI Zhen-yong^1，2，

ZHOU Shu-jing^1，2， CHI Nai-yu^1，2*， YU Shuang^1，2*

（1.College of Life and Health， Dalian University， Dalian 116622， China; 2.Engineering and Technology

Research Center for Marine Microorganism in Liaoning Province， Dalian 116622， China）

Abstract： To investigate the relationship between bacterial flora and growth and decline of nitrite during fermentation of northeast sauerkraut， in this experiment， two closed fermentation systems are set up， namely， nitrite is not added （natural fermentation group） and nitrite is added （control group）. In combination with the main physicochemical indexes （nitrite， pH value and so on）， the bacterial species in the fermentation broth of sauerkraut at different fermentation stages （relative abundance ranking top 30） in the two systems are compared and analyzed. In this experiment， the changes of the bacterial flora of samples with and without nitrite at different fermentation stages are investigated. The results show that the addition of nitrite has an effect on the growth of bacteria throughout the fermentation cycle， and that nitrite makes the relative abundance of the dominant Lactobacillus genera （Lactococcus， Leuconostoc， Lactobacillus）， α-Proteus （Allorhizobium-Neorhizobium-Parararhizobium-Rhizobium， Aureimonas， Brevundimonas， Methylobacterium， Sphingomonas）， β-Proteus （Acidovorax， Aquabacterium， Comamonas， Delftia， Herbaspirillum， Methylophilus， Methylovorus）， CFB genera （Dyadobacter， Pedobacter， Sphingobacterium） and uncultured genera （Brassica_napus_rape， uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae， uncultured_bacterium_f_env.OPS_17， uncultured_bacterium_o_Chloroplast） increase in the early stages of fermentation; and it makes the relative abundance of pathogenic bacteria genera （Acinetobacter， Alkanindiges， Chryseobacterium， Enterococcus， Serratia， uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae， uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae， uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae） always stay in a low-level state.In the S system，the early stage of fermentation is the nitrite accumulation stage. At this time， Lactococcus and Leuconostoc are the dominant Lactobacillus， and Lactobacillus becomes the absolute dominant Lactobacillus at the middle and late stages of fermentation. In the early stage of fermentation， the pathogenic bacteria such as Acinetobacter， Enterococcus， Serratia and uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae proliferates largely， leading to a large accumulation of nitrite， and the accumulated nitrite keeps the relative abundance of these pathogenic bacteria always at a low-level state， with the most significant effect on the growth of Serratia.

Key words： northeast sauerkraut; nitrite; bacterial flora; dominant Lactobacillus; pathogenic bacteria

收稿日期：2023-11-28

基金項目：國家重點研發計劃（2018YFC0311100）

作者簡介：張慶芳（1965—），女，教授，博士，研究方向：微生物及酶工程的基礎理論與應用。

*通信作者：遲乃玉（1965—），男，教授，博士，研究方向：微生物及酶工程的基礎理論與應用；

于爽（1986—），男，教授，博士，研究方向：微生物及酶工程的基礎理論與應用。

東北酸菜（northeast sauerkraut）是一種以大白菜為原材料的發酵蔬菜，口味咸酸，有開胃健食、潤腸通便、殺菌抗炎、促進消化的效果，營養價值豐富^[1]。在東北酸菜發酵期間，除乳酸菌之外的一些雜菌生長繁殖產生的硝酸鹽還原酶會將蔬菜本身含有的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽^[2-3]，亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質，同時也是一種常用的食品防腐劑。所以，控制發酵蔬菜食品中的亞硝酸鹽含量對于提高發酵蔬菜食品的安全性至關重要。但無法分析東北酸菜在發酵過程中產生的一定含量的亞硝酸鹽對細菌菌群的影響，從而不能得出兩者之間的明確關系。

隨著科學技術的不斷發展，人們已經對發酵蔬菜中微生物多樣性開展了多方位的研究。Wu等^[4]利用DGGE分析東北酸菜發酵過程中的微生物多樣性，鑒定出14種細菌。Yang等^[5]對來自3個不同家庭的酸菜進行了微生物群落動態分析，發現魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、梭狀芽孢菌屬、腸桿菌屬是酸菜中菌群結構的主要部分。劉長根^[6]通過高通量測序分析得出東北酸菜微生物中有17個門，35個綱，77個目，145個科，408個屬，283個種和1 414個OTU。Yang等^[7]研究發現蘿卜泡菜中細菌多樣性隨著發酵的進行而顯著下降。Chen等^[8]、Gou等^[9]、Huang等^[10]、Liu等^[11]、Ren等^[12]、Shen等^[13]、Yun等^[14]對不同酒曲和原料發酵的酒類微生物的多樣性進行了研究。Shan等^[15]研究表明，云南宣威火腿核心發酵菌屬為孢囊放線菌屬、乳酸桿菌、棒狀桿菌屬、小單孢菌屬、鏈霉菌。Lin等^[16]和Xiang等^[17]研究發現Lactobacillus能減少4種苦味氨基酸的含量，具有降低發酵蔬菜苦味的功效，還能提高發酵蔬菜的感官品質和風味。Liang等^[18]和Peng等^[19]也發現Lactobacillus參與碳水化合物、氨基酸、脂類的代謝，從而形成風味物質。Guo等^[20]利用宏基因組技術在白酒窖泥中發現乳酸菌、芽孢桿菌和梭菌等細菌與乳酸、乙酸等有機酸及乙醇、酯類等風味化合物產生有關，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒發酵中可以產生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，這對糖酵解過程影響顯著并可將淀粉等大分子物質降解為小分子糖。雖然目前已有大量發酵蔬菜及其他發酵食品中微生物多樣性和呈味物質的相關研究，但通過高通量測序結合OD_{600 nm}值和理化指標進行監測進而探究亞硝酸鹽對發酵蔬菜不同發酵階段細菌菌群影響的研究尚少。

本研究以東北酸菜為研究對象，采用一種東北酸菜小型發酵體系^[21]，即使用無菌且統一規格的礦泉水瓶作為發酵容器。將發酵溫度和腌漬方式進行優化后，確定25 ℃為本研究發酵體系中的最適發酵溫度。并基于Illumina NovaSeq測序平臺，采用16S rRNA高通量測序技術，對生漬法發酵條件下有、無添加亞硝酸鹽的東北酸菜發酵過程中不同發酵時間點的細菌菌群進行分析；同時對細菌菌群生長（OD_{600 nm}）及生理代謝相關的主要理化指標（pH、總酸、亞硝酸鹽）進行監測，進而探究東北酸菜不同發酵階段亞硝酸鹽與菌群的關系。本研究旨在探究亞硝酸鹽對東北酸菜不同發酵階段菌群的影響，從而為東北酸菜及其他發酵蔬菜的開發提供更多的基礎理論依據，并消除了人們對東北酸菜中亞硝酸鹽安全性的疑慮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大白菜；硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂（均為分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；DP812土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA基因V3～V4區引物合成及建庫測序：由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設備

PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；CRY-2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Thermo Multiskan 1510酶標儀 芬蘭Labsystems公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸菜的制作工藝流程及操作要點

制作工藝流程：挑選新鮮大白菜→清洗→瀝水→切絲混勻→裝瓶→注鹽水→封蓋→恒溫發酵→酸菜成品。

操作要點：設置添加亞硝酸鹽（亞硝酸鈉：100 mg/L）組和未添加亞硝酸鹽組，其中未添加亞硝酸鹽組為對照組。挑選新鮮大白菜，清理好外層葉片，將白菜順著菜幫掰成若干片后，用清水清洗干凈，瀝干表面水分后將白菜切成0.5～1 cm的均勻細絲。注意保證不同部位的白菜細絲混勻，選用統一規格的555 mL PET材料制備的東北酸菜發酵容器若干瓶，每瓶分裝160 g混勻的白菜絲，再注入1.5%鹽水至滿瓶，最終形成封閉發酵體系，將全部酸菜放置于25 ℃恒溫培養箱中發酵一定時間，得到酸菜成品。

1.3.2 酸菜理化指標的測定

每瓶酸菜代表一個獨立的時間點，從1 h開始取樣測量，然后分別在13 h、25 h、73 h、15 d取樣一次。將添加亞硝酸鹽組中發酵1 h、13 h、25 h、73 h、15 d的樣本依次命名為YS1、YS2、YS3、YS4、YS5，YS1～YS5的分組命名為Y組；將未添加亞硝酸鹽組中發酵1 h、13 h、25 h、73 h、15 d的樣本依次命名為S1、S2、S3、S4、S5，S1～S5的分組命名為S組。

將瓶內酸菜與發酵液倒入燒杯中，將其全部研磨后制成勻漿，分別稱取10 g酸菜勻漿作為待測樣品，進行理化指標的檢測^[22-24]。pH的測定：使用pH計；總酸含量的測定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法；亞硝酸鹽含量的測定：參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法；OD_{600 nm}值的測定：采用紫外分光光度計測定在波長600 nm處的吸光度值。所有實驗重復測定3次取平均值。

1.3.3 16S rRNA高通量測序技術

高通量測序技術（high-throughput sequencing）也稱“下一代”測序技術（“next-generation” sequencing technology，NGS），能夠一次性完成海量DNA分子的測序任務。如今，基于高通量測序的擴增子測序技術已在微生物多樣性分析研究中普及，根據待測樣品的不同又分為16S、ITS、18S擴增子測序，細菌主要是基于16S區，真菌主要基于18S區或ITS區（內轉錄間隔區）^[25]。

按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA，以其為模板，采用引物對338F（5′-ACTCCTAC-GGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′）進行PCR擴增，PCR擴增產物委托北京百邁克生物科技有限公司完成建庫測序。

1.3.4 生物信息學分析

首先利用Trimmomatic軟件和Cutadapt軟件對初始序列進行質量過濾；然后利用Usearch軟件和Uchime軟件對序列進行拼接和篩選，得到最終有效數據。使用QIIME 2軟件分析樣本中的Alpha多樣性（Alpha diversity）和Beta多樣性（Beta diversity），并比較S組和Y組中菌群豐度的差異^[26-29]。

2 結果與分析

2.1 酸菜樣本理化指標及OD_{600 nm}值的檢測

pH能反映酸菜的發酵進程，總酸（TAN）含量能體現出酸菜發酵后的酸香味，亞硝酸鹽（NIT）含量反映了發酵蔬菜的安全性，OD_{600 nm}值在一定程度上可以反映酸菜中的菌群濃度^[30]。

由圖1可知，添加亞硝酸鹽與未添加亞硝酸鹽這兩種發酵條件下，pH均呈整體下降趨勢，但添加亞硝酸鹽組的pH整體大于未添加亞硝酸鹽組。由此可知，添加亞硝酸鹽會影響整個發酵過程中pH的變化，導致pH整體偏高。添加亞硝酸鹽組與未添加亞硝酸鹽組的TAN均呈整體上升趨勢，但添加亞硝酸鹽組的TAN含量整體小于未添加亞硝酸鹽組，由此可知，添加亞硝酸鹽會影響整個發酵過程中TAN含量的變化，導致TAN含量整體偏低，該結果與pH的變化情況相吻合。發酵時間為25 h時未添加亞硝酸鹽組達到“亞硝峰”，此時添加亞硝酸鹽組的NIT含量為33.50 mg/L，當發酵時間為25～73 h時，添加亞硝酸鹽組的NIT含量下降趨勢更劇烈。添加亞硝酸鹽與未添加亞硝酸鹽這兩種發酵條件下OD_{600 nm}值均呈整體上升趨勢，但添加亞硝酸鹽組的OD_{600 nm}值整體小于未添加亞硝酸鹽組，由此可知，添加亞硝酸鹽影響了整個發酵過程中的菌群濃度，在相同時間點抑制了發酵系統內菌群的生長。

2.2 酸菜樣本的生物信息學分析

2.2.1 酸菜樣本細菌微生物高通量測序結果及質量評估

S1～S5、YS1～YS5樣本細菌微生物的高通量測序結果見表1。

由表1可知，從兩個酸菜樣本中共獲得891 634條原始序列，雙端序列質控、拼接后共得到888 590條高質量序列，最終將高質量序列通過拼接、過濾和嵌合后共得到有效序列839 128條，序列平均堿基長度為423 bp，樣本平均GC含量為52.70%。此外，各酸菜樣本的測序質量值Q20＞98%、Q30＞95%，有效序列占比＞91%，說明測序結果數據質量良好。

2.2.2 酸菜樣本細菌菌群的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性主要的衡量指標包括Chao 1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數、覆蓋率^[31]。Chao 1和ACE指數衡量物種的豐度，指數越大，豐度越高；Simpson指數和Shannon指數反映了物種的多樣性，Simpson指數越小，Shannon指數越大，多樣性越高^[32]。兩個酸菜樣本細菌菌群的Alpha多樣性指數分析結果見表2。

由表2可知，樣本S1和S2的物種豐度均高于樣本YS1和YS2，多樣性均低于YS1和YS2，樣本S3、S5的物種豐度和多樣性均高于樣本YS3，樣本S4的物種豐度低于YS4、多樣性高于YS4。兩個樣本的覆蓋率均≥0.999 4，表示測序覆蓋率達到了99%，樣本中物種幾乎全部被檢測出來。根據10個樣本的理化指標進行推斷：第一，在未添加亞硝酸鹽的樣本中，S2達到了整個發酵周期菌群多樣性峰值，此時酸菜中細菌豐度最大；隨著發酵進程的推進，S4中細菌的多樣性和豐度值逐漸減少至平穩。第二，在添加亞硝酸鹽的樣本中，隨著發酵進程的推進，YS5達到了整個發酵周期菌群多樣性峰值，此時酸菜中細菌豐度最大。由此可知，在S組中S2的物種豐度最高，S1的物種多樣性最高；在Y組中YS5的物種豐度最高，YS1的物種多樣性最高。發現無論是否添加亞硝酸鹽，在發酵1 h即發酵初始時的物種多樣性均最高。S組內S1～S3的物種豐度大于Y組內YS1～YS3，分析原因為添加亞硝酸鹽抑制了發酵過程中多種細菌菌群的生長繁殖。

2.2.3 酸菜樣本細菌菌群的Beta多樣性分析

本研究采用主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）和非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）對S組和Y組間細菌菌群結構的差異進行分析。PCoA將標記出的特征值和向量統一排序，在降維的思想中選擇排列在前幾名的主要特征值，基于加權UniFrac距離和未加權UniFrac距離的計算結果找到距離矩陣中最主要的坐標，以觀察兩組間的差異^[33]。NMDS分析是一種非線性模型，其基本特征是將樣本間的相似或相異性數值看作一種以點之間距離來表示的單調函數，在保持初始數據排序關系的前提下，用相同排序的新數值代替初始數據來完成度量多維尺度分析，從而分辨樣本間的差異性^[34]。在兩種分析方法中，樣本在坐標圖上距離越近，表明相似性越高，樣本的聚集程度越高，細菌菌群結構越相似；樣本離散程度越大，細菌菌群結構差異越大。

由圖2可知，第一主成分PC1和第二主成分PC2的貢獻率分別為39.67%和20.21%，表明PCoA可以高度解釋原始測序信息的差異。S組內僅S1分布于PC1的負坐標區域，組內其他樣本均分布于PC1的正坐標區域，而Y組內5個樣本均分布于PC1的負坐標區域。說明發酵1 h時細菌菌群結構與其他樣本的差異最大，分析原因為發酵環境內原料、水攜帶的菌群導致此時菌群結構復雜多樣。

由圖3可知，Y組整體的離散程度大于S組。在S1與YS1、S2與YS2、S3與YS3、S4與YS4、S5與YS5 5組樣本的間距中，發現S1與YS1的間距最近，說明隨著發酵時間的延長，添加亞硝酸鹽對發酵體系內菌群結構的影響越來越顯著。

2.3 東北酸菜發酵系統中細菌菌群與亞硝酸鹽長消變化關系

2.3.1 發酵系統中優勢乳酸菌菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖4可知，隨著發酵進程的推進，發酵體系內的優勢乳酸菌菌屬的相對豐度不斷升高，發酵過程中乳酸菌不斷產生亞硝酸鹽還原酶和H⁺，導致TAN含量不斷升高，pH不斷降低，使亞硝酸鹽不斷降解至安全值；乳酸菌在發酵過程中逐漸占據主導地位，在發酵中后期成為發酵體系內的優勢菌群，導致OD_{600 nm}值迅速升高^[35]。在發酵時間點2以后，Y組中優勢乳酸菌的相對豐度遠遠高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中優勢乳酸菌的生長，使其相對豐度不斷增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，S組與Y組中優勢乳酸菌的相對豐度有所降低但都出現回升現象。由此可知，亞硝酸鹽對優勢乳酸菌的生長具有明顯影響，使其在發酵中后期相對豐度增加。

由圖5可知，在發酵時間點2以后，Y組中Lactococcus、Leuconostoc的相對豐度遠遠高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Lactococcus、Leuconostoc的生長，使其相對豐度不斷增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，S組與Y組中Lactococcus的相對豐度開始降低，而Y組中Leuconostoc的相對豐度有所降低但又出現回升現象，S組中Leuconostoc的相對豐度產生波動后降低。在發酵過程中，Y組中Lactobacillus的相對豐度始終低于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Lactobacillus的生長，使其相對豐度始終處于低水平狀態；在S組中，發酵系統內不斷生成的亞硝酸鹽影響了Lactobacillus的生長，使其相對豐度先升高后降低，同時Lactobacillus迎來了第一個低峰值；當到達發酵時間點4時，由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Lactobacillus的相對豐度不斷增加，并將迎來第二個更高的峰值。結果表明，亞硝酸鹽對Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus的生長具有明顯影響，使Lactococcus、Leuconostoc在發酵中后期相對豐度增加；使Lactobacillus的相對豐度始終處于低水平狀態。

2.3.2 發酵系統中α-變形菌菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖6可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中α-變形菌的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中α-變形菌的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，α-變形菌的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對α-變形菌的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度升高，在發酵中后期相對豐度不斷降低。

由圖7可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Aureimonas、Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Aureimonas、Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Aureimonas、

Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、

Aureimonas、Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas

的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

2.3.3 發酵系統中β-變形菌菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖8可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中β-變形菌的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了β-變形菌的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，β-變形菌的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對β-變形菌的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

由圖9可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中Acidovorax、Aquabacterium、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Acidovorax、Aquabacterium、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Acidovorax、Aquabacterium、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。隨著發酵進程的推進，S組與Y組中Comamonas的相對豐度呈現基本相同的變化趨勢，但除發酵時間點3～4之間，Y組中Comamonas的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Comamonas的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Comamonas的相對豐度不斷降低，雖有所回升但仍處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對Acidovorax、Aquabacterium、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus、Comamonas的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

2.3.4 發酵系統中CFB類菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖10可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中CFB類菌屬的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中CFB類菌屬的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，CFB類菌屬的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對CFB類菌屬的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

由圖11可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

2.3.5 發酵系統中未培養菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖12可知，隨著發酵進程的推進，S組與Y組中未培養菌屬的相對豐度都呈現下降趨勢，在發酵時間點1～3之間，Y組中未培養菌屬的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中未培養菌屬的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，未培養菌屬的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對未培養菌屬的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

由圖13可知，在發酵時間點1～3之間，Y組中Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast的相對豐度明顯高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast的相對豐度不斷降低，并處于低水平狀態。由此可得，亞硝酸鹽對Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast的生長具有明顯影響，使其在發酵初期相對豐度增加。

2.3.6 發酵系統中致病菌菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系

由圖14可知，除發酵初始外，Y組中致病菌的相對豐度始終低于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中致病菌的生長，使其相對豐度始終處于低水平狀態。在S組中，發酵系統內不斷生成的亞硝酸鹽影響了致病菌的生長，使其相對豐度先升高后降低，同時致病菌迎來了第一個低峰值；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，S組中致病菌的相對豐度仍不斷降低。這意味著無論是Y組還是S組，在發酵后期致病菌菌屬的相對豐度都處于低水平狀態，此時東北酸菜不會對人體健康構成危害，為可食用狀態。由此可知，亞硝酸鹽對致病菌的生長具有明顯影響，使其相對豐度始終處于低水平狀態。

由圖15可知，在發酵時間點1～2之間，Y組中Alkanindiges的相對豐度明顯高于S組，在發酵時間點1～3之間，Y組中uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae的相對豐度高于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Alkanindiges、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae的生長，使其相對豐度增加；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，Y組中Alkanindiges、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae的相對豐度一直處于低水平狀態。Y組中Acinetobacter、Chryseobacterium的相對豐度始終處于低水平狀態，且在發酵時間點1～3之間Acinetobacter、Chryseobacterium的相對豐度遠遠低于S組，說明添加的亞硝酸鹽影響了Y組中Acinetobacter、Chryseobacterium的生長，使其相對豐度始終處于低水平狀態；在S組中，發酵系統內不斷生成的亞硝酸鹽影響了S組中Acinetobacter、Chryseobacterium的生長，使其相對豐度先升高后降低；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，導致乳酸菌大量積累，S組中Acinetobacter、Chryseobacterium的相對豐度仍處于低水平狀態。在整個發酵過程中，Y組中Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對豐度處于低水平狀態且明顯低于S組，說明添加的亞硝酸鹽顯著影響了Y組中Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的生長，使其相對豐度始終處于低水平狀態；由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，導致乳酸菌大量積累，Enterococcus的相對豐度仍處于低水平狀態；在發酵時間點1～2之間，分析S組中的Serratia由于具有硝酸鹽還原酶，而促進了亞硝酸鹽的生成；在發酵時間點2～3之間，該階段表現為亞硝酸鹽影響了Serratia的生長，使其相對豐度降低，由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，乳酸菌大量積累，Serratia的相對豐度有所回升，但其相對豐度始終處于處于低水平狀態；uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae是腸桿菌科中具有硝酸鹽還原酶的一種細菌，可將發酵體系中存在的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在S組發酵前期，發酵體系內含氧量較高，uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae不斷消耗發酵系統中的氧氣并隨之不斷增長，同時將原料所攜帶的硝酸鹽不斷地轉化成亞硝酸鹽，導致發酵體系內亞硝酸鹽含量不斷升高，隨著發酵系統中乳酸菌大量積累、pH不斷降低、TAN不斷升高，發酵體系內呈現出缺氧的酸性環境，以Lactobacillus為代表的乳酸菌在發酵體系中逐漸占據主導地位，使得uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對豐度在發酵后期不斷下降，并處于低水平狀態。在發酵時間點1～2之間，Y組uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae的相對豐度明顯低于S組，說明添加的亞硝酸鹽顯著影響了Y組中uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae的生長，使其相對豐度降低；在發酵時間點2～3之間，發酵過程中不斷生成亞硝酸鹽，從而使uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae的相對豐度繼續降低，同時其迎來了第一個低峰值，由于發酵系統內亞硝酸鹽不斷降解，TAN含量不斷升高，pH不斷降低，uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae的相對豐度有所回升，但仍處于低水平狀態。由此可知，亞硝酸鹽對Alkanindiges、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae、Acinetobacter、Chryseobacterium、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae的生長具有明顯影響，使Alkanindiges、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae在發酵初期相對豐度增加；使Acinetobacter、Chryseobacterium、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對豐度始終處于低水平狀態；使uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae在發酵前期相對豐度降低。

3 討論

圖1展示了添加亞硝酸鹽組（Y組）與未添加亞硝酸鹽組（S組）中pH、TAN、NIT和OD_{600 nm}值的變化情況，發現Y組的pH始終大于S組，Y組的NIT含量始終小于S組，該現象與張慶芳等^[36]在亞硝酸鹽對Lactobacillus brevis 4903發酵中亞硝酸菌對乳酸菌的發酵有抑制作用的研究結果一致。Y組發酵體系內產酸量較低，推測原因可能是乳酸菌產生亞硝酸還原酶將亞硝酸鹽還原成氨氣，氨氣與乳酸菌所產的乳酸反應，導致發酵環境中pH偏高，TAN含量偏低，有利于發酵早期乳球菌屬的生長與積累。

Alpha多樣性結果表明，添加亞硝酸鹽對各樣本中共有的菌屬的相對豐度有顯著影響。Beta多樣性結果表明，發酵時間點1時，S組內S1的菌群結構與組內其他樣本的差異最大，隨著發酵時間的延長，添加亞硝酸鹽對發酵體系內菌群結構的影響越來越顯著。

本文研究表明S組和Y組中共含有Enterococcus、Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus 4種乳酸菌菌屬，其中Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus為S組中的優勢乳酸菌菌屬。與S組相比，Y組中Lactococcus與Leuconostoc的相對豐度分別增加了18.55%和8.05%，而Lactobacillus的相對豐度減少了14.79%，說明添加亞硝酸鹽使Lactococcus與Leuconostoc的相對豐度升高，但使Lactobacillus的相對豐度降低；隨著發酵進程的推進，亞硝酸鹽被大量降解，亞硝酸鹽對Lactobacillus的發酵影響開始解除。發酵前期為亞硝酸鹽積累階段，發酵時間點2時亞硝酸鹽含量達到12.62 mg/L，此時Lactococcus、Leuconostoc為S組中的優勢乳酸菌菌屬，而當發酵25 h時達到亞硝峰（32.63 mg/L）后，Lactobacillus成為S組中的絕對優勢乳酸菌菌屬；Lactococcus和Leuconostoc為Y組中的優勢乳酸菌菌屬，且亞硝酸鹽使Leuconostoc和Lactococcus的相對豐度升高，使Lactobacillus的相對豐度降低，此結果與Huang等^[37]的研究結果相同。在發酵73 h時，Y組中亞硝酸鹽含量達到23.33 mg/L，為S組中亞硝酸鹽含量（6.66 mg/L）的3.5倍；在發酵15 d時，Y組中亞硝酸鹽含量達到11.80 mg/L，為S組亞硝酸鹽含量（3.09 mg/L）的3.8倍，由此可知，在發酵73 h后Y組中亞硝酸鹽對Lactobacillus的生長仍具有影響，而S組中亞硝酸鹽基本不影響Lactobacillus的生長。乳酸菌具有抗菌、抗氧化、免疫、調節人體脂代謝、治療高血壓等功效^[38]。Chryseobacterium、Enterococcus、Serratia和uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae是東北酸菜中比較有代表性的致病菌菌屬，觀察S組和Y組中幾種致病菌菌屬的變化情況，發現YS2中Chryseobacterium的相對豐度（15.94%）比S2（32.93%）低16.99%，YS2中Enterococcus的相對豐度（0.22%）比S2（0.47%）低0.25%，YS2中uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對豐度（0.35%）比S2（28.31%）低27.96%，YS2中Serratia的相對豐度（0.01%）比S2（0.28%）低0.27%，其中Serratia在YS3、YS4、YS5中相對豐度均為0，說明亞硝酸鹽對Serratia的生長影響最顯著，使其相對豐度始終處于極低水平狀態。以上均證明亞硝酸鹽可防止發酵過程中出現過多雜菌引起腐敗現象，保證了發酵的順利進行。此外，本研究發現無論是否人為添加亞硝酸鹽，東北酸菜中亞硝酸鹽的殘留量均會隨著時間的延長降至遠低于國標值，因此在科學的生產工藝下，東北酸菜不會對人體健康產生危害。

東北酸菜的原料大白菜中含有一定量的硝酸鹽，在東北酸菜的發酵過程中，發酵前期存在多種具有硝酸還原酶的細菌，白菜自身所攜帶的硝酸鹽會被發酵體系內的雜菌還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽最終又會被乳酸菌逐漸降解至安全值^[39]。由此可知，食用科學工藝所生產的東北酸菜具有一定的安全性。由本研究中的兩個發酵系統中各菌屬相對豐度變化情況可知，在東北酸菜的整個發酵周期中，發酵前期pH較高，發酵系統內Lactococcus大量增長，其產生的亞硝酸鹽還原酶使發酵體系內的亞硝酸鹽大量降解；發酵后期Lactobacillus大量增長，其產生大量的乳酸導致發酵系統內pH始終處于較低水平狀態，此時發酵體系內的H⁺發揮作用導致亞硝酸鹽不斷降解。以上結果與張慶芳等^[35]、王一茜等^[40]的研究結果相符合。

4 結論

以25 ℃生漬法發酵的東北酸菜發酵液為研究對象，在添加亞硝酸鹽與未添加亞硝酸鹽這兩組中選取的10個樣本進行高通量測序，得到以下結論：10個樣本共注釋得到13個門的142個屬，Y組中YS4的物種豐度大于S4，S組中S1的物種多樣性大于YS1。通過研究添加亞硝酸鹽組與未添加亞硝酸鹽組這兩種發酵條件下各理化指標和微生物指標變化情況，由pH、TAN含量、NIT含量和OD_{600 nm}值的變化可知，添加亞硝酸鹽會對酸菜整個發酵體系內的菌群結構產生一定的影響。綜上所述，無論是否添加亞硝酸鹽，兩個發酵體系中酸菜樣本的細菌總數均呈現先上升后下降的趨勢。發酵開始后，添加亞硝酸鹽對整個發酵周期中細菌的生長都具有影響，亞硝酸鹽使優勢乳酸菌菌屬（Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus）、α-變形菌菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Aureimonas、Brevundimonas、Methylobacterium、Sphingomonas）、β-變形菌菌屬（Acidovorax、Aquabacterium、Comamonas、Delftia、Herbaspirillum、Methylophilus、Methylovorus）、CFB類菌屬（Dyadobacter、Pedobacter、Sphingobacterium）和未培養菌屬（Brassica_napus_rape、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_env.OPS_17、uncultured_bacterium_o_Chloroplast）在發酵初期相對豐度增加；使致病菌菌屬（Acinetobacter、Alkanindiges、Chryseobacterium、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、uncultured_bacterium_f_Xanthobacteraceae）的相對豐度始終處于低水平狀態。東北酸菜發酵過程中乳酸菌逐漸占據主導地位，在發酵中后期成為發酵體系內的優勢菌群；在S系統內，發酵前期為亞硝酸鹽積累階段，此時Lactococcus、Leuconostoc為優勢乳酸菌菌屬，而達到發酵中后期時Lactobacillus成為絕對優勢乳酸菌菌屬；在發酵初期，Acinetobacter、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae等致病菌大量繁殖，導致亞硝酸鹽大量積累，而積累的亞硝酸鹽使Acinetobacter、Enterococcus、Serratia、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae等致病菌的相對豐度始終處于低水平狀態，其中對Serratia的生長影響最顯著。

5 展望

發酵蔬菜因其獨特的風味深受人們喜愛，但其中的亞硝酸鹽含量一直是食品安全問題的熱點。本文對東北酸菜發酵過程中相對豐度排名前30的菌屬與亞硝酸鹽長消變化關系進行了研究，為后期調控東北酸菜發酵環境中菌群結構、提高東北酸菜發酵品質奠定了基礎，為含有亞硝酸鹽的不同發酵蔬菜的開發與研究提供了新的理論依據和方向。

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