白烏魚魚肉多肽的酶解工藝優化

陳秋月 張佳怡 張鵬程 萬欣 鄒定燕 李玥頎 焦曉磊 張崟

摘要：白烏魚是新培育的淡水魚品種，其蛋白肽的功能性有待深入研究。為建立最優的制備白烏魚魚肉蛋白肽的水解工藝，為其功能性評價提供參考，以白烏魚魚肉為原料，在比較不同蛋白酶（堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶）對其水解度影響的基礎上，通過單因素實驗和響應面法對白烏魚魚肉的酶解工藝進行了優化，結果顯示：堿性蛋白酶水解白烏魚魚肉的水解度最高（29.5%）。以該酶為催化劑，通過單因素實驗（酶解溫度、酶解時間、pH和酶濃度）和響應面法得出在酶解溫度55 ℃、酶解時間4.65 h、pH 8.65、酶濃度1.0%時，白烏魚魚肉的水解度最高（39.62%）。以該酶解工藝為條件，驗證實驗的實測水解度為39.87%，與預測值39.62%的相對誤差為0.63%。因此，所建立的白烏魚魚肉的酶解工藝具有可靠性。

關鍵詞：白烏魚；多肽；響應面法；優化；酶解工藝

中圖分類號：TS254.1

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0077-06

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Polypeptides from

Opniocepnalus argus var Kimnra

CHEN Qiu-yue^1，2， ZHANG Jia-yi^1，2， ZHANG Peng-cheng^1，2， WAN Xin^1，2，

ZOU Ding-yan^1，2， LI Yue-qi^1，2， JIAO Xiao-lei³， ZHANG Yin^1，2*

（1.Key Laboratory of Meat Processing in Sichuan Province， Chengdu University， Chengdu 610106，

China; 2.College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China;

3.Neijiang Academy of Agricultural Sciences in Sichuan Province， Neijiang 641099， China）

Abstract： Opniocepnalus argus var Kimnra is a newly cultivated freshwater fish species， and the functionality of its protein peptides needs to be further explored. In order to establish the optimal hydrolysis process of preparing protein peptides from Opniocepnalus argus var Kimnra and provide references for the evaluation of their functionality， with Opniocepnalus argus var Kimnra as the raw material， on the basis of comparing the effects of different proteases （alkaline protease， trypsin， papain， neutral protease， pepsin） on the degree of hydrolysis （DH）， single factor experiment and response surface method are used to optimize the enzymatic hydrolysis process of Opniocepnalus argus var Kimnra. The results show that alkaline protease has the highest degree of hydrolysis （29.5%）. Using alkaline protease as the catalyst， through single factor experiment （enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time， pH and enzyme concentration） and response surface method， it is found that the degree of hydrolysis of Opniocepnalus argus var Kimnra is the highest （39.62%） when enzymatic hydrolysis temperature is 55 ℃， enzymatic hydrolysis time is 4.65 h， pH is 8.65 and enzyme concentration is 1.0%. Under the conditions of this enzymatic hydrolysis process， the measured degree of hydrolysis in the verification experiment is 39.87%， with the relative error of 0.63% compared to the predicted value of 39.62%. Therefore， the established enzymatic hydrolysis process of Opniocepnalus argus var Kimnra is reliable.

Key words： Opniocepnalus argus var Kimnra; polypeptides; response surface method; optimization; enzymatic hydrolysis process

收稿日期：2023-12-05

基金項目：四川省科技計劃項目（2021YFN0033）；國家現代農業產業技術體系四川創新團隊項目（sccxtd-2023-15）；四川省自然科學基金項目（2022NSFSC1764）；內江市科技項目（2021KJJH008）

作者簡介：陳秋月（1998—），女，碩士，研究方向：農產品加工與保藏。

*通信作者：張崟（1981—），男，教授，博士，研究方向：農產品加工與保藏。

白烏魚是2022年被中國漁業協會認定的淡水魚新品種^[1]，具有高蛋白、低脂肪等特點^[2]，其市場開發潛力巨大。自從白烏魚新品種獲得認定以來，國內外學者對其胴體黏液中耐熱菌種類^[3]、白烏魚黏液中菌種的抗菌活性^[4]、一氧化碳處理對白烏魚魚肉品質的影響^[5]等進行了探索，建立了白烏魚方便湯粉^[6]、白烏魚肉松^[7]等產品的制作工藝。但是對白烏魚魚肉酶解液中功能性肽的酶解制備工藝研究較少。坊傳白烏魚魚肉具有催乳、促進傷口愈合等功效^[8]，但是至今沒有可靠的數據證明這些功效。

近年來，國內外研究人員從魚肉酶解液中分離鑒定出多種功能性肽，馬天新^[9]從烏魚魚肉中發現了血管緊張素I轉化酶（ACE）抑制肽，Zhang等^[10]從烏魚魚肉中發現了抗氧化肽，Huang等^[11]從鰱魚魚肉中提取了抗衰老肽，韓貴新等^[12]從雜交鱘魚龍筋中發現了具有抗腫瘤活性的功能性肽等。因此，白烏魚魚肉多肽可能是其具有催乳、促進傷口愈合等功效的主要原因。本文參照酶解肉類原料制備功能性肽的方法^[13-14]，采用響應面法對白烏魚魚肉的酶解工藝進行了優化，為評價白烏魚魚肉多肽的功能性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白烏魚（1 000～1 500 g/條）：十陵鎮久貿農貿市場；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（10 000 U/mg）：山東拓普生物工程有限公司；硫酸銅：江蘇諾泰澳賽諾生物制藥股份有限公司；硫酸鉀：江蘇普樂司生物科技有限公司；濃硫酸、36%～38%甲醛溶液、濃鹽酸：德國科隆公司；氫氧化鈉、百里酚酞、碳酸鈉、碳酸氫鈉：成都市科隆化學品有限公司。

WP-UPT-20標準型超純水機 四川沃特爾水處理設備有限公司；YP30002型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；KDN-04C型消化爐、KDN-102C型凱氏定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司；Scientz-11無菌均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3G型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-S6型六孔電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TGL-1650型高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白烏魚魚肉蛋白質的測定

根據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》方法測定白烏魚魚肉中蛋白質的含量。

1.2.2 白烏魚魚肉的酶解

將白烏魚宰殺后去皮去骨，切成3 mm×3 mm×2 mm的小塊，將魚塊混勻后稱取20.0 g，加入料液比1∶4（肉∶水）的去離子水，用無菌均質機拍打180 s。將料液調節至適當pH后，加入適量的酶制劑酶解，反應結束后于90 ℃水浴加熱10 min滅酶，待冷卻到室溫時，過濾除去殘渣，將濾液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為酶解液。

1.2.3 蛋白酶的篩選

選擇5種不同種類的蛋白酶（中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶），參照各種酶的指導性水解條件對白烏魚魚肉進行酶解，具體酶解條件見表1。

1.2.4 單因素實驗

在1.2.3的基礎上，以堿性蛋白酶為酶制劑，在料液比為1∶4的條件下，分別對酶解溫度、酶解時間、pH及酶濃度進行單因素實驗，具體酶解條件如下。

1.2.4.1 酶解溫度

根據堿性蛋白酶的指導性水解條件，在固定酶解時間為4 h、pH為8、酶濃度為0.6%的條件下，在45，50，55，60，65 ℃的酶解溫度下，分析酶解溫度對白烏魚魚肉水解度的影響。

1.2.4.2 酶解時間

以1.2.4.1確定的最佳酶解溫度為條件，在固定pH為8、酶濃度為0.6%的條件下，在2，3，4，4.5，5，5.5，6 h的酶解時間下，分析酶解時間對白烏魚魚肉水解度的影響。

1.2.4.3 pH

以1.2.4.1和1.2.4.2確定的最佳酶解溫度和酶解時間為條件，在固定酶濃度為0.6%的條件下，在6，7，8，9，10的pH下，分析pH對白烏魚魚肉水解度的影響。

1.2.4.4 酶濃度

以1.2.4.1、1.2.4.2和1.2.4.3確定的最佳酶解溫度、酶解時間和pH為條件，在0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的酶濃度下，分析酶濃度對白烏魚魚肉水解度的影響。

1.2.5 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、pH（C）、酶濃度（D）4個因素進行響應面實驗設計，以水解度（DH）為響應值，采用1中心、4因素、5水平、30次實驗的響應面實驗方案，分析酶解條件對白烏魚魚肉水解度的影響。響應面實驗因素水平表見表2。

1.2.6 水解度的測定

參考鄒澤斌等^[15]的方法，使用緩沖溶液將酶解待測液的pH調節至7.0，將待測溶液定容至100 mL，吸取待測溶液20 mL至250 mL的錐形瓶中，加入5 mL甲醛溶液及2～3滴0.5%的酚酞溶液，并在室溫下放置5 min，然后用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定至終點。NaOH的體積用于計算游離氨基酸的量。水解度計算公式如下：

水解度（%）=游離氨基酸量（mg/g）總氮量（mg/g）×100%。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0、Excel 2016對實驗數據進行統計分析和繪圖；采用Design-Expert 12.0設計響應面實驗方案，并分析數據的顯著性和繪制響應面圖。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶種類對水解度的影響對比

為了篩選對白烏魚魚肉具有較高酶解效率的蛋白酶，本實驗選取堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶對白烏魚魚肉蛋白進行水解，所得水解度見圖1。

由圖1可知，這5種蛋白酶對白烏魚魚肉的水解效率差異顯著（P<0.05），水解度從大到小的順序為堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞胃蛋白酶。因此，根據水解度選擇堿性蛋白酶為催化劑，用于水解白烏魚魚肉并制備多肽。

堿性蛋白酶是一種絲氨酸內切酶^[16]；胃蛋白酶有利于共價連接在絲氨酸上的磷酸基團^[17]；胰蛋白酶主要作用位點為賴氨酸和精氨酸的羧基側^[18]；木瓜蛋白酶則是一種半胱氨酸內切酶^[19]。白烏魚魚肉蛋白中絲氨酸含量較高，而堿性蛋白酶的活性中心為絲氨酸，因此堿性蛋白酶作用于白烏魚魚肉，能夠更有效釋放生物活性肽^[16]。這些酶特性的差異可能是導致其對白烏魚魚肉水解度不同的主要原因。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶解溫度

由圖2可知，白烏魚魚肉蛋白的水解度隨著酶解溫度的增加呈現先升高后降低的趨勢。在55 ℃時，水解度最高，55 ℃后水解度顯著下降（P＜0.05），這可能是溫度破壞了酶內部結構，酶活性下降，酶對白烏魚魚肉蛋白的酶解效果降低所致。酶解溫度低于55 ℃時，堿性蛋白酶活性未達到最佳，這可能是導致白烏魚魚肉水解度較低的主要原因。

寧詩文等^[20]在采用堿性蛋白酶對大黃花魚肉進行水解時得出類似的實驗結果。蛋白酶的活性受水解溫度的影響很大，只有在一定的溫度范圍內，酶保持最佳活性，才能夠達到最大酶解效率。55 ℃時堿性蛋白酶的活性最高，這可能是55 ℃時白烏魚魚肉水解度最高的主要原因。因此，選擇45～65 ℃作為響應面設計時的溫度限值。

2.2.2 酶解時間

在2.2.1中確定的最適酶解溫度條件下，對酶解時間對白烏魚魚肉水解度的影響進行實驗，所得結果見圖3。

由圖3可知，白烏魚魚肉的水解度隨著酶解時間的增加呈現顯著上升的趨勢（P＜0.05），在5 h時水解度達到峰值，之后水解度略有下降。堿性蛋白酶主要影響連接絲氨酸的肽鍵，當酶解達到一定程度時，堿性蛋白酶切割位點達到飽和^[21]，這可能是隨著酶解時間的延長，白烏魚魚肉蛋白水解程度不再增加的主要原因。因此，選擇3.35～5.95 h作為響應面設計時的時間限值。

2.2.3 pH

pH對白烏魚魚肉水解度的影響見圖4。

由圖4可知，隨著pH從6增加到9，水解度從27.73%增加至31.47%，此時白烏魚魚肉的水解度最大，顯著高于其他pH時的水解度（P＜0.05）。當pH繼續增加時，水解度顯著下降（P＜0.05）。堿性蛋白酶的最佳pH范圍為8.5～9.5，在此pH范圍時其酶活性較高。當pH超過9.5時，反應環境會抑制堿性蛋白酶的活性，水解度降低^[22]，這可能是pH為9時白烏魚魚肉的水解度最高的主要原因。因此，選擇pH 7.35～9.95作為響應面設計時的pH限值。

2.2.4 酶濃度

酶濃度對白烏魚魚肉水解度的影響見圖5。

由圖5可知，隨著酶濃度的增加，白烏魚魚肉的水解度逐漸增加，在酶濃度為1.0%時，白烏魚魚肉的水解度達到峰值。隨著酶濃度的繼續增加，白烏魚魚肉蛋白的水解度趨于穩定。底物濃度和酶濃度之間具有匹配性^[23-24]，在底物濃度確定的條件下（1.2.4.4），再高的酶濃度也不能催化底物更多地水解，這可能是當酶濃度超過1.0%時水解度趨于平緩的主要原因。因此，選擇酶濃度0.6%～1.4%作為響應面設計時的酶濃度限值。

2.3 響應面實驗結果

根據圖2～圖5的實驗結果，以酶解溫度（A）45～65 ℃、酶解時間（B）3.35～5.95 h、pH（C）7.35～9.95、酶濃度（D）0.6%～1.4%為響應限值，設計四因素五水平的響應面實驗方案。響應面實驗設計和結果、實測水解度（Y_1實測）和預測水解度（Y_1預測）以及實測水解度與預測水解度的相對誤差見表3。

由表3可知預測水解度和實測水解度的相對誤差值，有20組（67.7%）的相對誤差小于5%，有25組（83.3%）的相對誤差小于10%。由此可見，所建立的各酶解因素與水解度之間的擬合模型能夠較準確地預測水解度。為了進一步分析所建立模型的可靠性，對擬合模型的顯著性進行了分析。

2.4 擬合顯著性分析

對各反應條件與水解度的擬合方差和顯著性分析見表4。

由表4可知，模型的P＜0.000 1，表明該擬合模型極顯著，由失擬項的P＞0.05可知，所建立的白烏魚魚肉的酶解條件與水解度間的擬合模型具有顯著性。

由表4中一次項A、B、C、D的P值大小順序D＞B＞A＞C可知，對白烏魚魚肉酶解工藝的影響程度為pH（C）＞酶解溫度（A）＞酶解時間（B）＞酶濃度（D）。因此，在采用堿性蛋白酶水解白烏魚魚肉制備多肽時，應重點控制pH。

白烏魚魚肉蛋白水解度與各因素的響應面圖見圖6。比較圖6中水解度與各因素的變化幅度可知，在其他條件確定的情況下，水解度隨著pH的變化而變化的幅度最大，這也進一步證明了pH是影響白烏魚魚肉酶解制備多肽的關鍵因素，應重點控制。

2.5 擬合方程的可靠性驗證

為了進一步驗證所建立擬合模型的可靠性，以酶解溫度55 ℃、酶解時間4.65 h、pH 8.65、酶濃度1.0%為水解條件，對白烏魚魚肉的水解度進行測定，所得結果為（39.87±0.63）%。該值與預測值39.62%的相對誤差為0.63%（<5%）。因此，所建立的最優酶解工藝具有較好的可靠性。

3 結論

通過對比堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶對白烏魚魚肉水解度的影響，發現堿性蛋白酶對白烏魚魚肉蛋白的水解效果顯著優于其他4種蛋白酶（P<0.05）。以堿性蛋白酶為催化劑，在單因素實驗的基礎上，通過響應面實驗得出：當酶解溫度為55 ℃、酶解時間為4.65 h、pH為8.65、酶濃度為1.0%時，白烏魚魚肉的水解度最高（39.62%）。驗證實驗結果顯示：所得預測值39.62%與實測值的相對誤差為0.63%（<5%）。因此，白烏魚魚肉的最優水解工藝為酶解溫度55 ℃、酶解時間4.65 h、pH 8.65、酶濃度1.0%。

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