CARD6在膿毒癥心肌損傷中的機制研究

摘 要 目的：探討CARD6在膿毒癥心肌損傷中的調節機制。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為對照組與模型組。采用LPS腹腔注射法構建膿毒癥心肌損傷小鼠模型，RT-qPCR檢測小鼠心肌組織中CARD6、caspase-1的mRNA水平。體外實驗則采用LPS刺激轉染CARD6過表達質粒的H9C2細胞，檢測caspase-1、細胞活力、CK-MB水平。結果：與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中LDH、CK-MB含量，caspase-1表達水平上升，提示膿毒癥導致小鼠心肌損傷，而CARD6表達水平明顯降低。體外實驗發現CARD6表達水平呈下降趨勢，轉染含有CARD6的過表達質粒后細胞釋放CK-MB的水平降低、細胞活力增加、caspase-1水平降低。結論：CARD6可改善膿毒癥所致心肌損傷，其機制可能與caspase-1介導的細胞焦亡相關。

關鍵詞 CARD6 caspase-1 細胞焦亡 膿毒癥 心肌損傷

中圖分類號：R363.21； R542.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）05-0039-04

引用本文 李一民， 石寧寧， 曲央旺姆， 等. CARD6在膿毒癥心肌損傷中的機制研究[J]. 上海醫藥， 2024， 45（5）： 39-42； 69.

基金項目：西藏自治區自然科學基金聯合項目（XZ202101ZR0011G）；西藏自治區自然科學基金組團式醫學援藏項目[XZ2020ZR-ZY40（Z）]

Study on the role of CARD6 in the sepsis-induced myocardial injury

LI Yimin1， SHI Ningning1， QU Yangwangmu1， XIN Yong1， ZHOU Wugang2

（1. Department of Intensive Care Unit， Shigatse People’s Hospital， Shigatse 857000， China； 2. Department of Emergency， Shanghai Ninth People’s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200011， China）

ABSTRACT Objective： To explore the regulatory mechanism of CARD6 in sepsis-induced myocardial injury. Methods： C57BL/6 mice were randomly divided into a control group and a sepsis model group. A mouse model of sepsis-induced myocardial injury was constructed using LPS intraperitoneal injection method， and the mRNA expression levels of CARD6 and caspase-1 in mouse myocardial tissue were detected by RT-qPCR. In vitro， H9C2 cells were stimulated by LPS and transfected with overexpression plasmid containing CARD6， and the levels of caspase-1， cell viability and CK-MB content were detected. Results： Compared with the control group， the contents of LDH and CK-MB in myocardial tissue of mice increased in the model group， suggesting that sepsis can cause myocardial damage in mice. In addition， the expression level of CARD6 in the cardiac tissue of the model group was significantly reduced. The intracellular CARD6 expression level in the LPS-treated H9C2 cell also showed a downstream trend. After transfection with the overexpression plasmid containing CARD6， the release of CK-MB levels in H9C2 cells decreased， cell viability increased and the expression level of caspase-1 decreased. Conclusion： CARD6 can ameliorate myocardial injury caused by sepsis and its mechanism may be related to caspase-1 mediated pyroptosis.

KEY WORDS CARD6； caspase-1； pyroptosis； sepsis； myocardial damage

膿毒癥是由感染誘發的患者機體反應失調狀態，若不能及時進行治療會導致患者循環功能障礙及器官功能損害[1-2]。膿毒癥最常引起的器官功能障礙是心臟功能異常[3]，至少有40%的膿毒癥患者患有突發性心悸等心功能障礙，但目前膿毒癥誘發的心功能障礙的病理生理學機制尚不明確[4]。

胱天蛋白酶募集域蛋白6（caspase recruitment domain family member 6，CARD6）是CARDs家族的成員，該家族的蛋白成員都具有一個CARD結構域。有研究表明CARD6可與受體相互作用蛋白（RIP）激酶家族成員形成復合體，作為NOD樣受體（NOD-like receptors， NLRs）及TLR樣受體（Toll-like receptor，TLRs）通路的重要介導途徑，激活NF-kB等信號通路，在機體先天性及后天性免疫反應和炎癥應答等方面起重要調控作用，參與多種疾病的發生和發展[5]。但CARD6在膿毒癥心肌損傷中的作用機制研究目前尚未見相關報告。本研究將分析并闡述CARD6 在膿毒癥所致心肌損傷中的分子機制，旨在為膿毒癥心肌損傷的臨床防治提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物，細胞及相關試劑

實驗所需6～8周齡C57BL/6J 雄性小鼠（18～23 g，SPF級）由上海交通大學實驗動物中心提供；心肌細胞H9C2購于上海引昊生物科技有限公司；caspase-1購自英國Abcam公司；CARD6引物、過表達質粒（LVCARD6）均由上海引昊生物科技有限公司構建合成。脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）購自美國Sigma公司；肌酸激酶同功酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒均購自上海爵文生物科技有限公司。

1.2 構建LPS膿毒癥心肌損傷小鼠模型

將C57BL/6J小鼠隨機分成假手術組（對照組，n=6）和膿毒癥心肌損傷組（模型組，n=6）。模型組在腹腔注射LPS（10 mg/kg）0.2～0.25 mL，籠養24 h，構建LPS誘導的膿毒癥造成的心肌損傷模型。對照組腹腔注射與LPS等量的生理鹽水。造模成功后，處死小鼠，分離小鼠心肌組織并冷凍在液氮中備用。

1.3 H9C2及過表達CARD6后LPS刺激的細胞實驗分組

H9C2細胞在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺和1%青鏈霉素的DMEM培養液、于5% CO2、37 ℃條件下培養1 d后換液，隨后2～3 d根據細胞狀態換液后繼續培養至對數生長期，轉染空載質粒或CARD6過表達質粒后培養24 h，加入LPS（終濃度為 10 μg/mL）繼續培養24 h，然后進行相對表達量的檢測。按照實驗目的分為4組，即LPS組（體外膿毒癥心肌損傷模型，加入溶于PBS（0.01 mol/L pH 7.2 磷酸緩沖液）的LPS至終濃度10 μg/mL，培養24 h）、NC組（對照，加入與LPS等體積的生理鹽水常規培養24 h）、空載質粒+LPS組（LPS+NC）和CARD6過表達質粒+LPS組（LPS+CARD6）（參照LPS組處理）。

1.4 ELISA檢測LDH和CK-MB水平

依ELISA試劑盒說明書檢測兩組小鼠心肌組織或H9C2各組細胞培養上清液中的乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶同功酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）水平。

1.5 細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法測定細胞存活率

取對數生長期的H9C2細胞，按每孔8×103細胞接種于96孔板中，每組3個復孔，待細胞貼壁后，更換新鮮培養基。使用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔光密度（OD）值。

1.6 定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）法檢測CARD6、caspase-1 mRNA相對表達水平

利用TRIzol試劑提取心肌組織或H9C2細胞樣本中總RNA，根據 PrimeScript RT Master Mix的說明書，使用引物從RNA中反轉錄提取 cDNA，所有 cDNA 在使用前保存在？80 ℃。反應條件：變性95 ℃ 5 min，退火94 ℃ 30 s，延伸60 ℃ 30 s，共40個循環；熔解程序：按照儀器的默認程序。完成后分析擴增曲線，計算Ct值，以U6為內參，運用2-△△Ct法計算各組間mRNA相對表達量[6]，實驗重復3次。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 膿毒癥和對照組小鼠心肌組織中CK-MB、LDH含量的比較

用ELISA試劑盒檢測對照組和模型組小鼠心肌組織中CK-MB、LDH含量，經數據統計分析后發現，與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中CK-MB（圖1A，P=0.000 1）及LDH含量（圖1B，P=0.000 7）明顯增高。上述實驗結果證實，我們成功建立了膿毒癥心肌損傷模型。

2.2 膿毒癥和對照組小鼠心肌組織中CARD6、caspase-1 mRNA表達水平的比較

為了探究CARD6及caspase-1是否參與膿毒癥心肌損傷過程，我們采用RT-PCR檢測了上述指標在對照組及模型組中mRNA 水平的變化。結果顯示，與對照組相比，模型組中小鼠心肌組織中caspase-1 mRNA表達水平顯著上升（圖2A，P=0.003 0），而CARD6 mRNA表達水平顯著降低（圖2B，P=0.001 2）。上述結果表明，CARD6、caspase-1 均參與膿毒癥心肌損傷進程。

2.3 H9C2細胞過表達CARD6后，caspase-1 mRNA表達量、CK-MB含量和細胞活力水平的變化

為了進一步探究CARD6是否可調控caspase-1表達，并參與膿毒癥心肌損傷。我們采用CARD6過表達質粒轉染H9C2細胞，并采用RT-PCR檢測了caspase-1 mRNA的表達水平，ELISA實驗檢測了CK-MB表達量及CCK8實驗檢測了細胞活力。實驗結果顯示，與NC組相比，LPS組中caspase-1 mRNA表達量顯著上升（圖3A，P=0.007 7）、CK-MB含量明顯上升（圖3B，P=0.000 6）、細胞活性顯著下降（圖3C，P=0.009 1），表明在膿毒癥細胞模型中LPS刺激后，caspase-1誘導的心肌細胞損傷明顯增強。

過表達CARD后，再用LPS刺激H9C2細胞時，與LPS+NC組相比，LPS+ CARD6組caspase-1 mRNA表達量顯著下降（圖3A，P=0.003 4）、CK-MB含量明顯降低（圖3B，P=0.009 9）、細胞活力有顯著提高（圖3C，P=0.006 9）。上述結果提示，CARD6對LPS誘發的心肌損傷有保護作用，CARD6通過調控caspase-1，而參與膿毒癥心肌損傷進程。

3 討論

膿毒癥心肌損傷的發病機制至今仍未完全明了，目前存在多種假說，如細胞因子穩態失衡[7-8]、細胞內Ca2+超載[9]以及一氧化氮（NO）的影響[10]等。對膿毒癥心肌損傷的診斷及治療，雖存在多種治療方案，但依然不能很好地診斷及治療。因此，進一步探究膿毒癥心肌損傷可能的發生機制，對于減少患者的并發癥，改善患者的預后具有重要的臨床意義。

本研究通過LPS誘導法建立膿毒癥小鼠心肌損傷模型，發現模型組小鼠血清中的CK-MB、LDH水平明顯升高（P<0.001），表明膿毒癥小鼠心肌損傷模型建立成功。在建立成功的小鼠模型組中進一步檢測并比較心肌組織中CARD6 mRNA的表達情況，發現與對照組相比，模型組小鼠心肌組織中caspase-1 mRNA表達顯著上升，而CARD6 mRNA表達則顯著降低（P<0.01），提示CARD6在膿毒癥心肌損傷中可能具有一定的保護作用，其作用機制可能與caspase-1介導的心肌細胞焦亡相關。為了進一步探討CARD6與膿毒癥心肌損傷的相關性，我們采用LPS處理H9C2細胞來構建體膿毒癥心肌體外損傷模型，隨后向細胞中轉染CARD6過表達質粒以做干預，發現轉染了CARD6過表達質粒后細胞的CK-MB含量明顯降低（P<0.01），caspase-1 mRNA表達量顯著下降（P<0.01），同時細胞活力有顯著上升（P<0.01），進一步表明CARD6對膿毒癥誘導的心肌細胞損傷起到了保護作用。上述結果表明，CARD6在膿毒癥心肌損傷過程中發揮保護作用，其機制可能與其抑制炎癥反應及caspase-1引發的細胞焦亡相關。

細胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發現的一種細胞死亡方式，是一種特定的細胞程序性、炎性死亡方式[11]，其發生的過程依賴于半胱氨酸依賴性caspases家族的炎性蛋白酶的活性[12]，突出的特點是死亡細胞發生水腫，進而迅速地發生質膜破裂，釋放出包括白介素-1b（IL-1b）、白介素-18（IL-18）及高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）等細胞內容物和炎性介質[13]，從而進一步加重宿主的炎癥反應。

CARD6是CARDs家族的成員，在肺、脾、胃等多器官組織中高表達，能夠激活NF-κB等信號通路，從而廣泛參與炎癥和細胞凋亡等相關過程[14]。目前的研究表明，CARD6與RIP激酶家族成員蛋白RICK結合后可以招募蛋白NEMO，進而活化NF-κB，調控炎癥反應。同時，RICK的激酶活性可以啟動p38-MAPK信號通路，進而也促進產生炎癥因子[15]。CARD6 是肝臟缺血再灌注損傷時體內炎癥反應和NF-kB信號通路的轉導抑制因子，其在肝臟缺血再灌注損傷中對缺血肝細胞具有保護作用[16]。還有研究顯示，過表達的CARD6可以抑制細胞凋亡、炎癥和氧化應激等過程來發揮對受損脊髓的保護作用[17]。這些結果表明，CARD6在多種信號通路中作為關鍵信號發揮作用。但目前關于CARD6介導的細胞焦亡在膿毒癥引發的心肌損傷方面的機制研究尚不明確。既往研究顯示，LPS可與CARD結構域相互作用，進而激活caspase引發的級聯反應，促進炎性因子的成熟[18]。caspase-1是細胞焦亡經典途徑的關鍵調節酶，與炎癥反應緊密相關[19]。敲除大鼠編碼caspase-1的基因后，可明顯緩解膿毒癥模型癥狀進展[20]。

綜上所述，我們的研究表明，促進CARD6的表達，可以抑制膿毒癥心肌損傷的進展，這一作用機制可能與caspase-1調控的炎癥因子成熟相關。本研究將為臨床膿毒癥心肌損傷的防控提供新的生物標志物及治療靶點。

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