人工智能蛋白質設計技術的研究進展及在生物醫藥創新開發中的應用與面臨的挑戰

摘 要 蛋白質是協調復雜生命過程的精密“分子機器”，具有巨大的醫療應用潛力。然而，因為蛋白質的一維氨基酸序列、三維結構和生物功能之間的關聯復雜，所以設計蛋白質并將其工程化以實現預期的功能和特性是一個極其困難的挑戰。目前，人工智能在各個領域均取得了革命性的進展，人工智能與蛋白質工程技術的結合已成為一種強大的新型蛋白質設計工具，可用于生成各類生物活性分子。本文介紹人工智能蛋白質模擬和設計領域的研究進展和應用，尤其是在生物醫藥創新開發應用中面臨的挑戰和前景。

關鍵詞 人工智能 蛋白質工程 新型蛋白質 合成生物學 藥物開發

中圖分類號：O629.73； TP399 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）07-0001-09

引用本文 苗洪江， 董澤凱， 向秋茹， 等. 人工智能蛋白質設計技術的研究進展及在生物醫藥創新開發中的應用與面臨的挑戰[J]. 上海醫藥， 2024， 45（7）： 1-9； 55.

Research progress of artificial intelligence powered protein design and the prospect and challenges of its application in innovative biologics design

MIAO Hongjiang， DONG Zekai， XIANG Qiuru， XUE Guirong

（Shanghai Tianrang Intelligence Co.， Ltd.， Shanghai 200232， China）

ABSTRACT Proteins， the intricate “molecular machines” that orchestrate life’s processes， hold immense potential for therapeutic applications. However， the designing and engineering of these proteins towards desired properties and functions remain a formidable challenge due to the complex interplay between the amino acid sequence， the three dimensional structure， and biological function. Artificial intelligence （AI） has been making transformative strides in various fields and its combination with protein engineering techniques offers a powerful toolkit in generating novel proteins for synthetic biology and therapeutics development. In this review， we will discuss the advancements and applications of AI in protein modeling and design and highlight the challenges and outlook of its applications.

KEY WORDS artificial intelligence； protein engineering； novel proteins； synthetic biology； therapeutics development

我國是全球第二大藥品市場，但抗體藥物市場僅占全球抗體藥物市場份額的10%，在新型生物藥物的研發和供給方面仍然面臨著嚴峻挑戰。近年來，隨著人工智能（artificial intelligence， AI）技術的快速發展，AI在蛋白質工程領域也取得了突破性進展，不僅解決了困擾生物學領域超半個世紀的蛋白質結構預測難題[1]，而且從頭設計出了環肽[2-3]、抗體[4-6]、熒光素酶[7]、蛋白質開關[8]、自組裝的蛋白質納米顆粒[9]等各種類型的全新功能蛋白，為生物醫藥、合成生物學等領域帶來了大量全新的具有成藥潛力的生物活性分子。本文介紹AI在蛋白質模擬和設計領域的研究進展，以及相關研究進展在生物醫藥創新開發中的應用情況和潛在挑戰，為相關研發和從業人員展現一幅清晰的AI蛋白質設計技術發展圖譜，以啟發對蛋白質設計領域中新技術的探索開發和實踐應用，共同解決人們尚未得到滿足的醫療需求。

1 蛋白質結構預測

蛋白質參與生命過程的各個方面，如細胞信號轉導、基因修正和復制、新陳代謝調控等，是人體中最重要的分子類型之一。蛋白質的生物功能與其三維結構密切相關，蛋白質結構的測定一直是生物制藥、合成生物學等眾多領域研究的核心基礎：一方面，以X線晶體衍射、冷凍電鏡為代表的蛋白質結構實驗測定方法技術門檻高、耗時長，難以滿足生命科學研究對蛋白質結構解析的通量需求；另一方面，通過計算預測蛋白質結構、解釋蛋白質折疊的原理被視為分子生物學研究的“圣杯”，但由于蛋白質的生物復雜度高、潛在三維結構空間巨大，蛋白質的準確結構預測難題困擾了計算生物學領域長達半個多世紀。本章節主要介紹AI在蛋白質結構預測領域中的研究進展和其中部分具有代表性的方法及其應用。

1.1 AI破解蛋白質結構預測難題

傳統的基于物理力場或知識能量函數的蛋白質三維結構預測方法，如ROSETTA[10]、TINKER[11]等，不僅需要進行大量的計算以尋找能量最小化的蛋白質三維構象，而且預測的精度往往也較低。另有不少研發人員開發了各種同源建模方法[12-15]，根據序列同源性從已知蛋白質結構數據庫中尋找高度相似的結構模板來完成預測，雖然計算效率顯著提高，但由于算法依賴并受限于高質量結構模板，適用范圍十分有限。Wang等[16]首次將殘差神經網絡用于蛋白質殘基間的接觸圖矩陣預測，再將接觸圖矩陣作為限制條件進行從頭模擬，使可預測的蛋白質數量提高了近3倍。谷歌DeepMind團隊開發的AlphaFold2[1]采用transformer架構從多序列比對（multiple sequence alignment， MSA）中抽取氨基酸殘基間的關聯信息，再通過具備旋轉平移不變性的結構模塊映射到三維空間，端到端的實現了近原子級別精確度的蛋白質結構預測，標志著蛋白質結構預測難題已獲破解（圖1）。DeepMind團隊運用此算法開展了大規模的蛋白質結構預測工作，并與歐洲分子生物學實驗室和歐洲生物信息研究所合作建立和開放了蛋白質結構數據庫，數據庫中的蛋白質三維結構至2023年6月已突破2億個，涵蓋了已知的各種生物來源的蛋白質[17]。DeepMind團隊還于近期推出了更新版本的AlphaFold-latest[18]，后者可同時對蛋白質及其各類配體，如小分子、核酸、金屬離子、被修飾的殘基等形成的復合體結構進行預測，且預測準確度也大大超越之前的SOTA模型。

與此同時，國內外研發人員還開發了RoseTTAFold[19]、TRFold2[20]、Uni-Fold[21]，OpenFold[22]等一系列蛋白質結構預測準確度與AlphaFold2相當的算法。此外，Wu等[23]和Lin等[24]分別提出了OmegaFold和ESMFold算法，基于經大量蛋白質序列預訓練獲得的蛋白質語言模型，直接從目標蛋白質序列中提取高維嵌入信息，再通過結構模塊映射到三維空間，避免了對MSA的依賴，對孤兒蛋白質（orphan protein）、抗體等類型蛋白質的結構預測準確度更高。

1.2 AI預測蛋白質結構的廣泛應用

隨著AlphaFold2等各類能夠準確預測蛋白質結構的AI模型的開源和大規模蛋白質結構數據庫的開放，AI預測的蛋白質結構被廣泛應用于生命科學研究、生物醫藥開發和合成生物學探索等各個領域。

Huang等[25]運用AlphaFold2預測了脫氨酶家族中所有蛋白質的三維結構，并根據結構相似性聚類發現了多個新型脫氨酶，這些脫氨酶經簡單的工程化改造后可由單個腺病毒載體遞送，首次實現了大豆植物內的胞嘧啶堿基編輯。Kreitz等[26]運用AlphaFold2對Photorhabdus virulence cassette的尾纖維蛋白進行模擬和工程化改造，開發出新型蛋白質靶向遞送系統，為基因編輯、癌癥治療和生物調控提供了新的途徑。Ren等[27]基于AlphaFold2預測的結構生成了細胞周期蛋白依賴性激酶20的高抑制性小分子，優化后的小分子已進入臨床試驗開發階段。Ko等[28]結合運用冷凍電鏡解析與AlphaFold2預測獲得了配子表面蛋白質Pfs48/45的準確結構，進而確定了瘧疾傳播阻斷抗體的結合位置并從中選出了合適片段進行瘧疾疫苗的開發。

2 蛋白質設計

依賴自然進化獲得新的蛋白質功能和特性通常需要數百年乃至數萬年的時間，這難以滿足當前人類在疾病檢測和治療、工業合成和生產等眾多領域的蛋白質需求。此外，蛋白質還存在巨大的未被探索空間，以一種由100個氨基酸組成的蛋白質為例，其可能的序列有2100之多，遠遠超出人類已知的天然蛋白質序列的總和。隨著基因檢測及其編輯技術的快速發展，科學家們已可高效地合成指定蛋白質的基因序列，從而通過各類細胞或無細胞表達方法獲得這些蛋白質[29-30]。然而，要從如此龐大的蛋白質序列空間中獲得具備預期功能和特性的蛋白質子集是非常困難的。本章節主要介紹AI在蛋白質定向進化和從頭設計領域中的研究進展與應用。

2.1 定向進化蛋白質序列優化

定向進化是一種通過模擬自然進化過程對天然蛋白質進行的有目的的改造方法[31]，其先以飽和突變或隨機突變的方式建立包含大量突變體的文庫，然后對文庫中的序列進行實驗驗證以獲得具備預期功能或特性的優化突變體，之后再組合上一輪被驗證的優化突變位點及氨基酸類型來構建新的突變體文庫，通過多輪實驗，最終獲得功能更強、特性更優并可滿足應用需求的蛋白質序列。然而，鑒于大多數隨機突變是有害突變的現實，定向進化常需通過高通量、多輪次的實驗來完成，投入高、周期長，且因只能對有限突變點位進行探索，結果可能落入局部最優解陷阱而導致實驗失敗。

AI技術的應用大幅改善了定向進化的效率和成功率。得益于AI算法，研發人員能在計算機上對龐大的蛋白質適應度空間進行全面探索，避免落入局部最優解陷阱。同時，AI模型可通過學習大量的特性標記的生物實驗數據或采用無監督的方式經學習千萬級的氨基酸序列來獲取序列與特性的關聯，故能進行更加精準的突變體文庫建設，減少實驗驗證的量級和輪次，大幅降低優化突變體篩選成本，使定向進化具備更好的時效性和產業應用價值。Biswas等[32]開發了基于預訓練模型的low-N設計法，僅依賴24條有標簽數據訓練的下游模型指導定向進化，基于同一野生型維多利亞綠色熒光蛋白酶，只通過1輪實驗便獲得了活性超過文獻報告的經多輪定向進化所得優化突變體的新序列。Kulikova等[33]開發的MutCompute采用三維卷積神經網絡學習蛋白質結構的局部適應度空間，用于預測具備潛在增益效果的氨基酸突變。運用此方法，Lu等[34]開發出與天然聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate， PET）水解酶相比有5個點位突變的FAST-PETase，后者在各種溫度和pH環境下的活性均更好，僅需1周時間便可完全降解來自51種熱成型產品的未經任何預處理的PET。Hie等[35]運用完全無監督的蛋白質語言模型推薦進化性可行的突變，結果僅經2輪和總數不超過20個的實驗篩選便獲得了親和力高于臨床開發階段抗體的突變體。

2.2 蛋白質從頭設計

蛋白質從頭設計不再依賴已知的天然蛋白質，而是根據預期功能或結構直接設計蛋白質的氨基酸序列，以實現從無到有的具有全新功能的蛋白質開發[36]。這種從零開始的設計雖然具有廣泛的應用價值和廣闊的應用前景，但由于目前對蛋白質序列-結構-功能深層關聯的認知尚很有限，蛋白質從頭設計是一項極具挑戰性的工作。得益于前沿生成式AI技術的快速發展，蛋白質從頭設計，無論是基于結構還是基于序列的方法，都取得了突破性的進展[37-39]。

2.2.1 基于結構的蛋白質從頭設計

由于蛋白質的氨基酸序列決定蛋白質的三維結構，三維結構又決定了蛋白質的功能，故基于結構的蛋白質設計方法多以結構作為支點，先找到符合預期功能的蛋白質結構，再挖掘可折疊成此結構的氨基酸序列。Huang等[40]開發了SCUBA，采用神經網絡模擬以主鏈為中心且獨立于側鏈的能量函數，先用基于卷積核密度估計的方法從蛋白質結構中估算統計能量函數，然后訓練全連接的神經感知機來表達此函數。進行蛋白質設計任務時，通過SCUBA驅動的隨機動力學模擬生成可設計的主鏈，再運用研發人員自主開發的ABACUS2[41]為主鏈填充氨基酸序列。Huang等[40]在實驗室中合成了由SCUBA設計的蛋白質并通過X線晶體衍射解析了其結構，驗證發現設計與實際結構間的誤差為0.96～1.85 ？，達到了原子級別精度。

得益于蛋白質結構預測難題的破解，不僅蛋白質設計結果可借助預測模型來進行高效、準確的計算檢驗，而且能直接將預測模型應用于蛋白質設計流程以同時生成序列和結構，進一步提高蛋白質設計的效率和成功率。Wang等[42]開發的RFDesign、天壤XLab[20]開發的TRDesign等都是以結構預測模型為底座的蛋白質從頭設計方法：通過設置與目標相關的模體損失函數、幻想損失函數等，以馬爾科夫鏈蒙特卡洛（Markov chain Monte Carlo）或梯度下降的方式對初始序列進行突變優化，直到完成預設的優化輪次或獲得符合預期的結構和序列。Wang等[42]還提出了蛋白質補齊（protein inpainting）的理念，與自然語言完形填空或從毀壞圖像中恢復信息類似，在訓練過程中掩蓋局部的序列或結構使模型具備補齊能力。運用此方法設計的程序性細胞死亡受體配體-1結合蛋白pdl1_inp_1經實驗證實不僅具有結合能力，且親和力（Kd=326 nmol/L）也高于野生型的程序性細胞死亡受體-1（Kd=3.9 mmol/L），而其與已知蛋白質庫中最接近的序列相似度只有25.4%。

去噪擴散模型[43]通過在前向過程中反復向數據中注入高斯噪聲，再在反向過程中訓練神經網絡將高斯噪聲去噪使模型獲得生成能力。去噪擴散模型在圖像和文本生成中有極好表現[44]，用于蛋白質設計能進一步提高設計的結構新穎性、可控性和通用性。Trippe等[45]開發的ProtDiff采用具備不變性的圖神經網絡模擬和實現蛋白質主鏈的生成，并提出了一種順序蒙特卡洛（sequential Monte Carlo）的估算方法SMCDiff來實現目標模體的設計，可在分鐘級時間內完成設計工作。Watson等[46]的RFdiffusion在蛋白質折疊模型RoseTTAFold的基礎上進行了基于結構去噪的微調，通過在主鏈坐標中加入三維高斯噪聲和模擬布朗運動在蛋白質的結構中加入平移、旋轉噪聲，再在反向降噪中訓練模型最小化預測和真實結構的均方差，設計時便能從隨機初始化的結構中通過去噪生成全新的蛋白質主鏈結構了。Watson等[46]運用RFdiffusion生成了拓撲限制的單鏈蛋白質、蛋白質結合配體、對稱性復合體、金屬結合的蛋白質等各類全新的蛋白質并進行了系列生物實驗驗證，僅合成不足100條從頭設計的序列就獲得了甲型流感病毒血凝素H1、白介素-7受體α、程序性細胞死亡受體配體-1和原肌球蛋白受體激酶A的高親和力結合配體。Generate：Biomedicines公司開發的Chroma系統[47]采用外部條件限制下的貝葉斯采樣方法生成全新的蛋白質結構和序列，只需根據目標設置相應的限制條件，如對稱性、局部構象、形狀甚至自然語言提示，便可完成各類蛋白質的設計任務而不需要重新訓練（圖2）。

雖然許多模型能夠同時進行蛋白質結構和序列的設計，但由于表面疏水性殘基等原因會出現溶解性差、合成成功率低的問題[48]，故常需對氨基酸序列進行進一步的優化。Dauparas等[49]提出了為固定蛋白質主鏈填補氨基酸序列的圖神經網絡ProteinMPNN，該模型采用編碼器-解碼器的結構從輸入的主鏈結構計算圖中提取節點和邊的特征，采用循環的方式根據節點特征和已解碼序列依次計算下一個殘基點位的氨基酸分布概率并進行采樣，實現了各類復雜結構的序列設計。經多項生物實驗驗證，ProteinMPNN可以很高的成功率獲得較傳統方法設計的序列和天然序列合成特性更優的氨基酸序列[50-52]。Hsu等[53]開發了ESM-IF，采用帶有幾何向量感知機層的圖神經網絡在一個由近20萬個實驗解析蛋白質結構和1 200萬個由AlphaFold2預測的蛋白質結構組成的數據庫上進行訓練，在新冠病毒的刺突蛋白受體結合區域實現了50%以上的序列恢復率。

2.2.2 基于序列的蛋白質從頭設計

與基于結構的蛋白質設計方法不同，基于序列的蛋白質設計方法希望根據功能或特性需求直接生成相應的氨基酸序列，生成對抗網絡（generative adversarial network， GAN）和變分子編碼器（variantional autoencoder， VAE）等生成式算法被廣泛應用于此領域。Hawkins-Hooker等[54]開發了MSA-VAE和AR-VAE，通過編碼器-解碼器架構學習近7萬條各種熒光素酶序列，設計生成的一些序列在生物檢測中顯示有發光效果。Repecka等[55]開發的ProteinGAN采用時間卷積網絡同時學習序列中的局部和全局信息，由鑒別器網絡對生成器網絡產生的序列進行打分，由此不斷提高模型生成符合天然蛋白質特性的序列的能力。在以細菌蘋果酸脫氫酶為對象的生物實驗中，一些由ProteinGAN生成的序列被證實具有蘋果酸脫氫酶活性且有較好的溶解性。

隨著自然語言模型的爆發式發展，針對蛋白質序列的蛋白質語言模型展現出了對蛋白質序列空間的極強的探索能力，即使不進行有監督的微調，也能僅基于蛋白質的序列信息零樣本的學習對其功能及溶解性、熱穩定性、結合位點等進行有效的預測[56-58]。基于這類預訓練蛋白質語言模型，Saleforce Research公司等開發了ProGen[59]，在以2.8億條蛋白質序列及其相應功能和特性作為限制標簽的數據集上，將序列生成作為下一標記預測任務進行訓練，而在指定的蛋白質家族上的微調可進一步提高ProGen的序列生成能力。設計時，ProGen可以根據輸入的限制標簽從頭生成氨基酸序列。在以溶菌酶為對象的設計案例中，一些由ProGen生成的序列在體外實驗中被證實具有催化活性，其中包括與天然蛋清溶菌酶活性相當的個體。Evozyne和英偉達公司聯合開發了ProT-VAE[60]，在蛋白質語言模型ProtT5的編碼器和解碼器中間通過卷積壓縮和解壓層鏈接嵌入可訓練的VAE模型，在蛋白質設計時凍結蛋白質語言模型和中間層參數，僅訓練中間的VAE就實現了高效的模型微調。由ProT-VAE設計的蛋白質經生物實驗驗證，生物活性較天然人苯丙氨酸羥化酶高2.5倍。

擴散模型亦被應用于基于序列的蛋白質從頭設計。微軟公司AI4Science團隊等開發的EvoDiff[61]采用離散擴散實現蛋白質序列的從頭設計，不僅能生成基于結構的設計方法無能為力的內在無序的蛋白質，而且模型可從用戶輸入的MSA中獲取進化信息并指導生成，使設計的序列更好地擬合預期功能和特性。基因泰克公司Prescient團隊提出了擴散優化采樣在抗體序列上進行梯度指導的離散擴散，融合貝葉斯優化進行多目標指導的設計算法[62]。體外實驗顯示，應用此方法生成的針對人表皮生長因子2的抗體實現了97%的表達率和25%的結合率。

3 小結與展望

AI技術的應用已使蛋白質結構預測和設計領域獲得了革命性的突破，不僅破解了困擾生物學家半個多世紀的蛋白質結構預測難題，而且各種由AI設計的全新蛋白質也在實驗室中被合成出和得到驗證，在生物醫藥、合成生物學等產業的應用正在不斷展開。

美國蛋白質設計研究院與韓國SK生物科技公司合作開發的新冠病毒疫苗SKYCovione[63]已獲準在韓國和英國上市并進行了大規模的接種。這種疫苗通過人工設計的自組裝納米蛋白質顆粒實現抗原表位的多次展示，引發的免疫反應和抗體激活效果顯著高于傳統疫苗，且因設計的抗原蛋白質具有很好的穩定性，疫苗無需冷凍保存和運輸。Absci公司基于零樣本生成式AI算法設計的抗人表皮生長因子2抗體不僅在表面等離子共振實驗檢測中顯示有較曲妥珠單抗更強的親和力，在免疫原性和各項可開發性指標上也均表現優異[64]。Absci公司已與默沙東、阿斯利康等公司達成合作協議，共同推進腫瘤、皮膚病等疾病治療藥物的開發。基于Chroma蛋白質從頭設計平臺，Generate：Biomedicines公司正在開發腫瘤、傳染性疾病和免疫性疾病等治療藥物，并與Roswell Park綜合癌癥中心合作開發新型嵌合抗原受體T細胞療法產品[65]。

未來，高通量的蛋白質生產和檢驗方法的開發和進步將持續擴大蛋白質設計的應用場景。例如，與傳統的合成方法相比較，逐漸成熟的無細胞蛋白質合成技術具有更強的可控性、更低的經濟和時間成本、更高的安全性[66-67]，這會大幅加速設計—合成—檢驗—分析優化的流程，使蛋白質設計項目得以快速推進。此外，AI模型的訓練需要大量精準標記的高質量數據，但在分子生物學領域，這樣的數據是昂貴和稀缺的，是目前限制蛋白質設計落地應用的主要“瓶頸”，而全新的高通量檢測方法恰能很好地應對此難題。A-Alpha Bio公司開發出獨特的噬菌體展示技術，能同時展示數百萬到數十億個噬菌體，在保證靈敏度和特異度的前提下將蛋白質-配體結合的檢測通量提高了幾個數量級[68]。Porebski等[69]基于Illumina HiSeq平臺開發的深度篩查技術可在3 d內完成數千萬的抗體-抗原結合檢測。進一步的，機器人和自動化實驗室的部署還能對蛋白質的序列、特性和適應度空間進行更加全面的探索，分布更加均勻的數據有望繼續提高AI設計方法的普適性[70-72]。

得益于廣泛的關注和深入的研究，AI領域的最前沿模型正被迅速地應用于蛋白質設計，本文列舉的設計方法的進化和設計能力的提高正是這種趨勢的完美體現。雖然深度學習模型經常因為“黑盒”屬性被詬病，但其在復雜生物問題的解釋，如蛋白質結構預測、突變分析、蛋白質設計等領域，已經展現出遠超基于專家經驗或嚴謹的數學建模的水平[73]。研發人員也正通過在數據處理、模型架構設計、損失函數設置等各個環節嵌入生物物理和生物化學方面的經驗和知識，提高AI模型的可解釋性和魯棒性[74-76]。

AI技術的廣泛應用無疑加快了數字生物學時代到來的步伐，在算法快速發展、模型快速迭代更新的時代背景下，確保最前沿AI模型的可及性和民主化有助于提高整個蛋白質設計領域的產學研結合水平，促進“人工智能+生物技術”的產業化落地。因此，眾多研發人員和公司都選擇擁抱開源，讓更多的研發和從業人員可以運用最先進和最符合需求的AI算法來解決目標問題。然而，當前的蛋白質設計方法普遍具有算法復雜、算力需求大、流程整合困難的特點，單純的算法開源很難滿足非計算背景研發人員的應用需求。為此，Cradle Bio公司、InstaDeep公司、天壤XLab等都推出了AI賦能的計算平臺（圖3），不僅配備充足的算力支持，而且對眾多的蛋白質設計工具進行優化和整理，通過邏輯清晰、操作簡單的頁面將豐富的蛋白質模擬和設計能力展現給用戶，使AI模型更加易用好用。

隨著AI蛋白質設計技術的普及和應用，蛋白質設計將會越來越廣泛地應用于多肽、抗體、酶等各類生物醫藥相關蛋白質的開發，從而推動蛋白質科學向蛋白質工程的轉變。可以預見，按需設計的定制化、個體化精準醫療的出現已不再遙遠。

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