華法林鈉羥酮縮合雜質的合成研究

摘 要 目的：合成華法林鈉生產工藝中產生的雜質WF-Z1～WF-Z6；方法：以2’-羥基苯乙酮（SM-1）為起始原料與碳酸二甲酯（SM-2）進行縮合反應生成4-羥基-1-苯并吡喃-2-酮（WF-1），然后與4-苯基-3-丁烯-2-酮（SM-3）進行邁克爾加成反應得到3-（α-丙酮基芐基）-4-羥基香豆素（WF），最后在酸性條件下與甲醇，乙醇或異丙醇進行縮酮反應得到相應的目標雜質WF-Z1～WF-Z6。結果：目標雜質采用液相聯用質譜（LCMS），核磁共振氫譜（1H NMR），核磁共振碳譜（13C NMR）等檢測手段鑒定了其化學結構。結論：合成的雜質可以作為華法林鈉工藝雜質的雜質對照品，且本工藝路線起始原料廉價易得，有望用于工業化生產。

關鍵詞 華法林 華法林鈉 工藝雜質 合成

中圖分類號：O626.3 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）07-0071-05

引用本文 江云兵， 周偉， 朱陽. 華法林鈉羥酮縮合雜質的合成研究[J]. 上海醫藥， 2024， 45（7）： 71-75.

Synthesis study of acetal impurities in warfarin sodium

JIANG Yunbing， ZHOU Wei， ZHU Yang

（the Central Research Institute of Shanghai Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To synthesize the impurities WF-Z1-WF-Z6 produced in the production process of warfarin sodium. Methods： Using 2′-hydroxyacetophenone （SM-1） as a starting material， 4-hydroxy-chromen-2-one （WF-1） was synthesized by condensation reaction with dimethyl carbonate （SM-2）. Subsequently， Michael addition reaction with 4-phenyl-3-buten-2-one （SM-3） was carried out to obtain 3-（α-acetoneylbenzyl）-4-hydroxycoumarin （WF）， and finally the corresponding target impurities WF-Z1-WF-Z6 were synthesized by reaction with methanol， ethanol or isopropanol under acidic conditions. Results： The chemical structure of these impurities were identified by LCMS， 1H NMR， 13C NMR. Conclusion： The synthesized impurities can be used as a reference material for the quality control of warfarin sodium and moreover， the starting materials used in this synthetic route are cheap and easy to obtain and it is expected to be used in industrial production.

KEY WORDS warfarin； warfarin sodium； impurities； synthesis

華法林鈉的化學名稱為3-（3-氧代-1-苯基丁基）-4-羥基-2H-1-苯并吡喃-2-酮鈉鹽，為雙香豆素的衍生物之一，于1954年6月被美國FDA批準上市，主要用于抑制血液中的血小板聚集，預防血栓栓塞性疾病，也可作為心肌梗死的輔助用藥，是目前應用最廣泛的抗凝血藥。由于其結構與維生素K相似，具有競爭性抑制維生素K的作用，抑制肝細胞中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成，從而起到抗凝血作用[1-2]。

作為抗凝血活性藥物成分的華法林鈉[3-6]，其化學合成方法受到廣泛的關注并被報道[7-10]。其主要合成途徑是利用中間體華法林與相應的堿金屬或者堿性化合物成鹽，然后經過脫色、噴霧干燥分離或不同的鹽冷凍干燥等方式制備華法林鈉。但是報道的合成路線中存在后處理操作繁雜、收率低、安全風險較高等問題，不適合工業化生產。

本工藝研究基于文獻報道[11-12]的方法進行改進，利用2’-羥基苯乙酮（SM-1）和碳酸二甲酯（SM-2）為原料制備4-羥基-1-苯并吡喃-2-酮（WF-1），然后與4-苯基-3-丁烯-2-酮（SM-3）反應制備3-（a-丙酮基芐基）-4-羥基香豆素（WF），再與堿性氫氧化物或者碳酸鹽反應，最終制備得華法林鈉堿性鹽。但是在中間體WF制備的過程中，會產生羥酮縮合雜質，該類有機雜質控制不當則會隨后續反應影響成品華法林鈉的質量控制，故對華法林羥酮縮合雜質的合成研究并且進行嚴格的質量控制具有重要的意義。同時本工藝研究對該類雜質在工藝中可能產生的機理進行了合理的推測解釋。

1 儀器與試劑

RV10加熱磁力攪拌器（德國IKA公司）；Bruker DMX 400 MHz 核磁共振儀、氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（MeOD）、四甲基硅烷（TMS）（瑞士Bruck BioSPin公司）；Agilent 5975C質譜儀（美國Agilent公司）；Waters 2695型高效液相色譜儀、沃特斯2489制備純化儀器（美國Waters公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；RV8旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒公司）。

2’-羥基苯乙酮[密度為1.131～1.135 g/mL，氣相（GC）含量≥99.0%，濟南魯欣化工科技有限公司]；碳酸二甲酯（密度為0.973～0.977 g/mL，GC含量≥99.0%，東營石大勝華新材料有限公司）；4-苯基-3-丁烯-2-酮（熔點為37.5～41.0 ℃，GC含量≥99.0%，武漢格羅麗材料有限公司）；二甲苯、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等常規溶劑均為市售分析純；濃鹽酸、氫氧化鈉、N，N-二異丙基乙胺等均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 合成方法

首先以SM-1為起始原料，與SM-2進行縮合反應生成WF-1，再與SM-3進行邁克爾加成反應得到WF，然后與甲醇，乙醇或異丙醇作為溶劑在酸性條件下進行羥酮縮合反應得到相應的目標化合物雜質WF-Z1～WFZ6，具體路線如圖1所示。

2.1 化合物WF-1的合成

在反應瓶中分別加入氫氧化鈉（58.4 g，1.46 mol）加入到無水乙醇（100 mL）和二甲苯（500 mL），氬氣保護下，開啟攪拌，加熱至90 ℃，回流2 h，然后在快速攪拌下滴加SM-1（100.0 g，0.73 mol）和SM-2（193.0 g，1.63 mol）的混合溶液，加熱至溫度95 ℃，繼續保溫攪拌反應5 h。反應結束后，冷卻，加去離子水，用濃鹽酸調pH，過濾，濾餅洗滌，于70 ℃真空干燥，得類白色固體WF-1 95.0 g，收率79.8%。

1H NMR（400 MHz，MeOD）：δ 7.91（dd，J=7.8，1.3 Hz，1H），7.70～7.59（m，1H），7.35（dd，J=11.7，5.2 Hz，2H），4.89（s，2H）。

13C NMR（100.6 MHz，MeOD）：δ 166.92，164.63，153.89，132.39 ，123.87，123.11，116.22，115.89，90.33。MS-ESI（m/z）：163.2[M+H]+。

2.2 化合物WF的合成

在反應瓶中依次加入WF-1（90.0 g，0.56 mol）、SM-3（98.4 g，0.672 mol）和水（800 mL），加入N，N-二異丙基乙胺（6.55 g），升溫至100 ℃攪拌反應10 h。反應結束后，降溫，向體系中再加丙酮加熱溶解，冷卻結晶，過濾得固體，于50～60 ℃真空烘箱干燥，得白色固體WF 116.0 g，收率67.8%。

1H NMR（400 MHz，MeOD）：δ 7.95（td，J=7.8，1.4 Hz，1H），7.62（dd，J=17.1，8.5 Hz，1H），7.32（dtd，J= 19.5，12.5，4.0 Hz，6H），7.20～7.15（m，1H），4.17～4.05（m，1H），2.41（dt，J=13.0，6.5 Hz，1H），2.07～1.93（m，1H），1.73（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，MeOD）：δ 162.24，159.89，152.77，143.81，131.78，131.51，128.26，127.70，127.09，126.84，125.81，123.82，122.60，115.92，103.69，99.53，42.75，35.55，26.39。MS-ESI（m/z）：309.3[M+H]+。

2.3 化合物WF-Z1和WF-Z2的合成

在反應瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），甲醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），于60 ℃加熱并回流5 h，反應完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據文獻[13]描述確認構型，分別得到對映異構體 （2S，4S）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z1）8 g，收率38.2%；對映異構體 （2R，4S）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z2）5 g，收率23.9%。

WF-Z1：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.91（dd，J=7.9，1.3 Hz，1H），7.55（ddd，J=8.6，7.3，1.6 Hz，1H），7.36～7.27（m，4H），7.27～7.20（m，3H），4.16 （dd，J=11.7，7.0 Hz，1H），3.36 （s，3H），2.52（dd，J=14.0，7.0 Hz，1H），2.01（dd，J=14.4，11.4 Hz，1H），1.70（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.07，158.13，153.07，143.45，131.51，128.63，127.07，126.45，123.72，122.36，116.64，115.73，105.56，101.34，49.84，43.44，35.52，22.26。MS-ESI（m/z）：323.2[M+H]+。

WF-Z2： 1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.93（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.66～7.51（m，1H），7.42～7.25（m，4H），7.25～7.17（m，3H），4.17（dd，J=7.4，3.9 Hz，1H），3.26（s，3H），2.49（dd，J=14.1，3.9 Hz，1H），2.35（dd，J=14.1，7.4 Hz，1H），1.6（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.84，158.93，153.01，143.07，131.74，128.09，127.40，126.14，123.84，122.45，116.73，115.65，103.19，102.46，49.28，39.83，35.36，22.46。MS-ESI（m/z）：323.2[M+H]+。

2.4 化合物WF-Z3和WF-Z4的合成

在反應瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），乙醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），于60 ℃加熱并回流5 h，反應完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據文獻[13]描述確認構型，分別得到類白色固體對映異構體 （2S，4S）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z3） 7 g，收率32.1%；對映異構體 （2R，4S）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z4）5 g，收率22.9%。

WF-Z3：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.90（dd，J=7.8，1.4 Hz，1H），7.55（ddd，J=8.6，7.3，1.6 Hz，1H），7.38～7.29（m，4H），7.29～7.20（m，3H），4.20（dt，J=14.8，7.4 Hz，1H），3.76（dq，J=9.1，7.0 Hz，1H），3.59（dq，J=9.1，7.1 Hz，1H），2.53（dd，J=14.0，6.9 Hz，1H），2.00（dd，J=14.0，11.8 Hz，1H），1.72（s，3H），1.13（t，J=7.1 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.96，159.08，153.01，142.98，131.68，127.96，127.58，126.04，123.80，122.59，116.72，115.73，102.96，102.31，57.87，40.08，35.19，23.06，15.03。MS-ESI（m/z）：337.2[M+H]+。

WF-Z4：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.91（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.58（ddd，J=8.6，7.4，1.6 Hz，1H），7.36（ddd，J=15.2，8.3，4.4 Hz，2H），7.30～7.14（m，5H），4.17（dd，J=7.4，3.7 Hz，1H），3.71～3.55（m，2H），2.51（dd，J=14.1，3.8 Hz，1H），2.33（dd，J=14.1，7.4 Hz，1H），1.67（s，3H），0.96（t，J=7.0Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.96，159.08，153.01，142.98，131.68，127.96，127.58，126.04，123.80，122.59，116.72，115.73，102.96，102.31，57.87，40.08，35.19，23.06，15.03。MS-ESI（m/z）：337.2[M+H]+。

2.5 化合物WF-Z5和WF-Z6的合成

在反應瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），異丙醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），60 ℃加熱，反應5 h，反應完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據文獻[13]描述確認構型，分別得到類白色固體對映異構體（2S，4S）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z5）7.2 g，收率31.7%；對映異構體 （2R，4S）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z6）5.5 g，收率24.2%。

WF-Z5：1H NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 7.95～7.81（m，1H），7.62～7.45（m，1H），7.33（dd，J=11.5，3.8 Hz，4H），7.29～7.19（m，3H），4.35～4.25（m，1H），4.20（dd，J=11.8，6.8 Hz，1H），2.49（dt，J=10.5，5.2 Hz，1H），2.02～1.91（m，1H），1.73（s，3H），1.23（d，J=6.2 Hz，3H），0.91（d，J=6.1 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.21，158.54， 153.01，143.68，131.45，128.58，127.10，126.38，123.71，122.54，116.65，115.84，105.15，101.47，65.43，44.14，35.33，24.18，23.75，23.62。MS-ESI（m/z）：351.2[M+H]+。

WF-Z6：1H NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 7.88（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.63～7.50 （m，1H），7.41～7.30（m，2H），7.30～7.15（m，5H），4.26（dt，J=12.3，6.2 Hz，1H），4.15（dd，J=7.3，4.7 Hz，1H），2.46（dd，J=14.0，4.7 Hz，1H），2.30（dd，J=14.0，7.4 Hz，1H），1.67（s，3H），1.05（d，J=6.1 Hz，3H），1.02（d，J=6.2 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.95，159.40，153.01，143.03，131.64，127.93，127.57，125.97，123.73，122.68，116.66，115.84，102.92，101.47，65.97，40.94，35.52，24.09，24.03，23.45。MS-ESI（m/z）：351.2[M+H]+。

3 雜質來源

本工藝開發過程中涉及使用酸堿調節pH的操作工序，該類雜質來源主要是由華法林在酸性條件下與醇類進行的羥酮縮合反應所產生，與文獻報道[13-15]的合成該類雜質的方法和路徑一致，因此推測其產生途徑如圖2所示，后期工藝開發的過程中可以考慮避免使用醇類溶劑，或者開發更合適的純化工藝，降低該類雜質在中間體華法林的含量，確保有機雜質在中間體制定的標準范圍以內，進而保證本工藝開發生產的華法林鈉符合質量要求。

4 討論

本研究以SM-1為原料，通過縮合和邁克爾加成兩步反應得到WF，然后以低級醇類作為溶劑在酸性條件下進行羥酮縮合反應得到相應的目標雜質WF-Z1～WF- Z6。由于其原料廉價易得，可以克級量制備相應的縮合雜質，避免工藝開發中雜質經過富集、純化、再純化等繁瑣途徑，從而為原料藥的質量研究提供保障。另外，該雜質來源主要是由于華法林制備過程中在酸性條件下與醇類進行的羥酮縮合反應所導致，后期工藝開發的過程中可以考慮避免使用醇類溶劑，或者開發更合適的純化工藝制備得到高質量華法林，進而避免該類雜質或者將其在華法林中的含量降低到工藝開發標準以下，最終可安全可靠地工業化生產出符合藥典要求的華法林鈉原料藥。

參考文獻

[1] Majerus PW， Broze GJ， Miletich， JP， et al. Goodman and Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics， 9th edition[M]. New York： McGraw-Hill Education， 1996： 1346-1350.

[2] 李夢瑤， 蔡志強， 侯玲， 等. 新型小分子抗凝血藥物的合成、作用機制及構效關系研究進展[J]. 合成化學， 2020， 28（4）： 346-359.

[3] 劉小冬， 孔毅. 抗凝血藥物研究進展[J]. 醫藥衛生， 2017， 3（5）： 287-289.

[4] 胡章海. 抗血栓藥物的臨床應用研究進展[J]. 安徽醫藥， 2017， 21（5）： 785-788.

[5] 王秀， 夏泉. 抗凝血藥物臨床應用的現狀及研究進展[J].安徽醫藥， 2011， 15（10）： 1189-1192.

[6] 陳新謙， 金有豫， 湯光. 新編藥物學（第15版）[M]. 北京：人民衛生出版社， 2003， 527-528.

[7] Schroader CH， Madison， Link KP， et al. Process of making crystalline warfarin sodium： US2765321[P]. 1956-10-02.

[8] Schroader CH， Link KP， Madison W， et al. Warfarin sodium： US3077481[P]. 1963-02-12.

[9] Paul LK， Schroeder CH， Link KP， et al. Warfarin alkali metal derivative process： US3192232[P]. 1965-06-29.

[10] Ohnishi M， Sugawara R， Kusano T， et al. Structure-activity relationship between the hydro-phobicity of alkali metal salts of warfarin [3-（a-acetonyl-benzyl） -4-hydroxycoumarin] and the effectiveness of the taste response to these salts in mice[J]. Biosci Bintech Biochem， 1995， 59（6）： 995-1006.

[11] Uwaydah IM， Mohammad A， Brown CH， et al. Syntheses based on 2-hydroxy acetophenone： WO9724347[P]. 1997-07-10.

[12] Bercovici S， Evron Y， Fuxman O， et al. Process for synthesis of pure warfarin acid， warfarin alkali metal salts and corresponding clathrates： US20020120155[P]. 2002-08-29.

[13] Rayar AM， Lagarde N， Martin F， et al. New selective cyclooxygenase-2 inhibitors from cyclocoumarol： synthesis， characterization， biological evaluation and molecular modeling[J]. Eur J Med Chem， 2018， 146（1）： 577-587.

[14] Krstic LJ， Sukdolak S， Solujic S， et al. An efficient synthesis of warfarin acetals on montmorillonite clay k-10 with microwaves[J]. J Serb Chem Soc， 2002， 67（5）： 325-329.

[15] Shahzadi S， Ali S， Asif I， et al. The mechanism and crystal structure of 2-methoxy-2-methyl-4-phenyl-3，4，4a，10btetrahydro-2H，H-pyrano[3，2-c]chromen-5-one. Acetal of warfarin acid[J]. Turk J Chem， 2006， 30（6）： 703-709.