兒童肺炎支原體肺炎肺泡灌洗液CARDSTX、HMGB1、TLR2表達及臨床意義

李玉琴 王喆 丁瑩 儲矗 周衛芳

【摘要】目的研究肺炎支原體肺炎（MPP）患兒肺泡灌洗液中社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（CARDSTX）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、Toll樣受體2（TLR2）表達，探討其在MPP發病中的臨床意義。

方法回顧性分析55例MPP病例組及20例對照組臨床資料，同時檢測兩組支氣管肺泡灌洗液（BALF）中CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、晚期糖基化終末產物受體（RAGE）及髓樣分化因子88（MyD88）表達，體外檢測不同濃度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表達并進行比較。

結果與對照組相比，MPP組LYM絕對值計數、PA、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+明顯下降，CRP、LDH、D-二聚體、IgA、IgG、IgM、CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88均升高，差異有統計學意義（P<0.05或0.001）。CARDSTX刺激后HMGB1、TLR2的表達升高，且呈正相關，差異有統計學意義（P<0.001）。

結論CARDSTX可能通過HMGB1-TLR2-MyD88途徑參與肺炎支原體（MP）的致病。

【關鍵詞】肺炎支原體肺炎；社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素；高遷移率族蛋白1；Toll樣受體2；髓樣分化因子88

中圖分類號：R725.6文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.003

ExpressionandclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia

LIYuqin，WANGZhe，DINGYing，CHUChu，ZHOUWeifang

（DepartmentofInfectiousDiseases，Children'sHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215000，Jiangsu，China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofcommunity-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX），highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）andToll-likereceptors2（TLR2）inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP），andtoexploretheclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inthepathogenesisofMPP.

MethodsRetrospectiveanalysiswascarriedoutontheclinicaldataof55MPPchildrenand20childrenincontrolgroup.AndtheexpressionsofCARDSTX，HMGB1，TLR2，TLR4，receptorofadvancedglycationendproducts（RAGE）andmyeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）inbronchoalveolarlavagefluid（BALF）ofthetwogroups.Inaddition，theexpressionsofHMGB1andTLR2afterstimulationwithdifferentconcentrationsofCARDSTXinvitroweredetectedandcompared.

ResultsComparedwiththecontrolgroup，LYMabsolutevaluecount，PA，CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD19+，NKcell，andCD19+CD23+weresignificantlydecreased，whileCRP，LDH，D-dimer，IgA，IgG，IgM，CARDSTX，HMGB1，TLR2andMyD88weresignificantlyincreased，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05or0.001）.TheexpressionofHMGB1andTLR2increasedafterCARDSTXstimulation，therewasapositivecorrelationbetweenthem，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.001）.

ConclusionCARDSTXmaybeinvolvedinthepathogenesisofmycoplasmapneumoniae（MP）throughHMGB1-TLR2-MyD88pathway.

【Keywords】mycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP）;community-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX）;highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）;Toll-likereceptor2（TLR2）;myeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）

肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae，MP）可以通過呼吸道飛沫傳播及直接接觸傳播，兒童普遍易感，最終發展為肺炎支原體肺炎（mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP）的概率超過30%，且感染后長期存在，易反復發作。MPP占住院兒童社區獲得性肺炎（communityacquiredpneumonia，CAP）的比例超過10%，因此，早期診斷并及時治療MPP，成為兒科醫生急需關注的問題。本研究通過觀察MPP患兒的臨床特征，以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（communityacquiredrespiratorydistresssyndrometoxin，CARDSTX）、高遷移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）及其受體表達量及各指標之間的相關性，探索CARDSTX、HMGB1、Toll樣受體2（Toll-likereceptor2，TLR2）在MPP發病中的可能機制，為MPP診療提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對象

選取2018年1月至2019年6月期間在蘇州大學附屬兒童醫院住院治療，確診為MPP并行支氣管鏡檢查的患兒55例為MPP組［月齡（25.86±14.68）個月，男女比例33/22］，同時選取同期因支氣管異物行支氣管鏡檢查的兒童20例作為對照組［月齡（27.89±16.64）個月，男女比例12/8）］。兩組性別、月齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2納入及排除標準

MPP組入選標準：符合MPP診斷標準［1］。排除其他病原體的混合感染，有支氣管肺發育不良、免疫缺陷、先天性心臟病等病史及病史資料不完整的病例。對照組入選標準：有異物吸入史，病程小于3天，影像學檢查表現為明確的異物征象且未提示炎性改變，最近2個月內無下呼吸道感染。本研究為回顧性研究，通過醫院倫理委員會的批準（倫理審批號：2020CS035），且征得研究對象家長的知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集

采集BALF，所有患兒用37℃生理鹽水進行灌洗（0.5～1mL/kg，不超過5～10mL/kg），再通過負壓將灌洗液吸出，獲得的BALF保存于滅菌收集器分別送病原學檢測（MP、CP核酸定量檢測試劑盒；廣州達安基因股份有限公司，病毒快診試劑盒：DIAGNOSTICHYBRIDSUSA）。BALF標本離心后管底沉淀加入0.5mLTrizol，提取總RNA，RNA逆轉錄合成cDNA。使用RT-qPCR法檢測CARDSTX、HMGB1、TLR2、Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）、晚期糖基化終末產物受體（receptorforadvancedglycationendproduct，RAGE）及髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）表達。采集外周血標本，患兒入院后2h內抽取外周血，進行血常規、生化全套、凝血功能、體液免疫、T淋巴細胞亞群等檢測。

1.2.2檢測方法

培養THP-1細胞，細胞生長至對數期時，調整細胞密度至1×106/mL，接種于24孔板上，后使用不同CARDSTX（北京義翹神州生物科技股份有限公司上海分公司）（0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）濃度刺激THP-1細胞，收樣后離心獲取THP-1細胞沉淀，提取總RNA，并逆轉錄成cDNA，進行RT-qPCR實驗，檢測不同濃度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表達。引物序列順序見表1。

1.3收集并統計臨床資料

收集入組患兒的血常規、生化全套、凝血常規及免疫等實驗室檢查結果。

1.4統計學方法

運用SPSS24.0軟件包進行統計學數據分析。計量資料滿足正態分布的，以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析，不滿足正態分布的，以中位數［M（Q1，Q3）］表示，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2結果

2.1實驗室檢查比較

MPP組淋巴細胞（lymphocyte，LYM）絕對值計數、前白蛋白（prealbumin，PA）、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+較對照組明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05或0.001）。C反應蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、D-二聚體、IgA、IgG、IgM較對照組升高，差異有統計學意義（P<0.05或0.001）。見表2。

2.2CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、RAGE和MyD88表達水平及相關性

MPP組患兒BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88的相對表達量較對照組升高，差異有統計學意義（P<0.001），兩組間TLR4、RAGE的相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。MPP組BALF中CARDSTX的表達量與HMGB1、TLR2及MyD88的表達量呈正相關，差異有統計學意義（P<0.05）；HMGB1的表達量與TLR2及MyD88的表達量呈正相關，差異有統計學意義（P<0.001）。見表3、表4。

2.3CARDSTX誘導THP-1細胞表達HMGB1、TLR2

不同濃度CARDSTX的刺激下，HMGB1、TLR2的相對表達量經方差分析差異均有統計學意義（P<0.05），在CARDSTX10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL濃度刺激下的HMGB1、TLR2相對表達量均較空白組升高，差異有統計學意義（P<0.001）。見表5。

2.4CARDSTX、HMGB1、TLR2間表達量的相關性分析

CARDSTX與HMGB1、TLR2表達量均呈正相關，差異有統計學意義（P<0.001），CARDSTX刺激THP-1細胞，HMGB1與TLR2表達量呈正相關，差異有統計學意義（P<0.001）。見表6。

3討論

MP是一種沒有細胞壁的微生物，可引起MPP，是引起CAP最常見的非典型病原菌。接受纖維支氣管鏡治療的下呼吸道感染患兒中，MP檢出率最高［2］。近幾年，MPP的發病率呈上升趨勢，且發展迅猛，病程長，易耐藥，還可能進展為難治性肺炎支原體肺炎（refractorymycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP）甚至引起皮膚損害、胃腸道功能紊亂、中樞神經系統損害及心血管系統病變等肺外組織改變，嚴重影響兒童的生活質量及生命健康。

MP感染促進機體細胞因子及炎癥因子的高表達，過度的炎癥反應可能導致淋巴細胞的快速凋亡以及臟器損害，從而使血循環表現為白細胞、中性粒細胞升高，淋巴細胞降低［3］，并引起CRP、LDH升高，PA下降。有研究表明［4］，LDH可以作為評估MPP病情嚴重程度及是否需要使用全身糖皮質激素治療的參考指標之一。D-二聚體是反映機體凝血功能的特異性指標，其增高反映了機體的高凝和纖溶狀態［5］。MPP患者中普遍存在D-二聚體水平的升高［6］，D-二聚體水平與病情密切相關，D-二聚體升高，MPP患兒病情加重。

MP引起的免疫反應是MP致病的重要原因，本研究中，MP感染后機體CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+水平下調，表明MP感染后機體免疫功能下降，免疫調節功能失衡，從而增加了機體對MP的易感性及抑制了MP的清除［7］。研究表明［8］，MP抗原與人體組織存在相似的抗原成分，可選擇性激活B細胞，產生特異性或非特異性的IgA、IgM、IgG，使體內免疫蛋白增高從而產生免疫效應，并可以產生自身抗體，最終導致多系統免疫損傷。這與我們研究中MPP組IgA、IgM、IgG升高的結果一致。

CARDSTX是MP產生的唯一外毒素，可以通過表面活性劑蛋白A和膜聯蛋白A2與氣道上皮細胞結合發揮ADP-核糖基化活性及空泡活性，誘導炎癥反應，在MP發病中發揮作用。CARDSTX可模擬類似于MP感染后的病理改變，可引起感染小鼠纖毛停滯、空泡化、核固縮和炎癥因子釋放等改變［9］。并且CARDSTX濃度與MP感染的小鼠肺組織病理學評分呈正相關［10］。MP感染的小鼠肺泡灌洗液中CARDSTX的濃度與MP基因表達量及小鼠肺部疾病的嚴重程度呈正相關［11］。MPP的CARDSTX表達量越高，患兒臨床癥狀越重，發熱熱程及住院天數越長，并且更易形成胸腔積液及支氣管黏液栓，更易發生肺外并發癥，是提示RMPP的重要指標［12］。同時，阻斷CARDSTX可以減輕MPP的嚴重程度［13］。可以推測CARDSTX可能是MP致病過程中的主要毒素。

HMGB1是一種具有促炎效應的細胞因子，可由壞死細胞被動分泌以及單核細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞主動分泌，可與TLR2、TLR4或RAGE受體結合激活MyD88依賴性信號通路引起炎癥因子IL-1、IL-6等的大量釋放，促進炎癥反應，從而在敗血癥、關節炎、肺炎等炎癥性疾病的致病過程中發揮重要作用。MP-DNA陽性的大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液HMGB1表達升高，且HMGB1與疾病嚴重程度呈正相關［14］。MPP患兒外周血HMGB1表達隨著疾病嚴重程度升高，恢復期明顯下降［15］。表明HMGB1在MPP的發生發展中發揮一定的作用。TLR2-MyD88信號通路是肺部感染中一條重要的炎性調控通路。通過對實驗小鼠鼻內接種MP發現，巨噬細胞表面的TLR，尤其是TLR2，可以通過識別MP特異性抗原，激活MyD88-核因子-B（nuclearfactor-B，NF-B）信號通路，從而將入侵肺部的MP清除，表明TLR-MyD88-NF-B通路參與了MP感染后肺部MP的清除過程［16］。本研究中MPP患兒BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88相對表達量明顯高于對照組，且CARDSTX、HMGB1與TLR2、MyD88的表達量呈正相關，進一步體外利用不同濃度的CARDSTX刺激THP-1細胞，發現HMGB1與TLR2的表達量呈正相關，均隨CARDSTX濃度的增加而增加，提示MP可能通過CARDSTX介導機體細胞損傷刺激HMGB1的釋放，進而通過HMGB1-TLR2-MyD88途徑參與MPP的發病。

綜上所述，MP感染后存在炎癥因子的過度激活、淋巴細胞再分配、血液高凝及免疫功能紊亂，進一步研究發現，MP感染后，可能通過CARDSTX刺激HMGB1的釋放，從而經TLR2-MyD88途徑激活下游的信號通路，發生免疫炎癥反應，為MP致病機制的研究及臨床診斷、治療提供一定的幫助。但本研究僅涉及體外細胞培養，未通過動物實驗驗證，且樣本量相對較小，體外不同濃度CARDSTX刺激THP-1細胞后未檢測MyD88表達，后期仍需更大樣本量及進一步基礎實驗驗證。

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