PCR技術在食品微生物檢測中的應用研究

摘 要：PCR技術因具有高靈敏度、高特異性和快速性的特點，在食品微生物檢測領域廣泛使用。本文闡述食品中常見的致病微生物、PCR技術的基本原理、食品中常見致病微生物的PCR檢測方法，探討PCR技術在食品微生物檢測中的應用，并介紹PCR技術在食品微生物檢測中的發展趨勢。

關鍵詞：PCR技術；食品微生物；致病微生物；實時熒光定量PCR；多重PCR

Study on the Application of PCR Technique in Food Microbiological Detection

WANG Di

（Center for Disease Control and Prevention， Wujin District， Changzhou City， Jiangsu Province，

Changzhou 213100， China）

Abstract： PCR technology is widely used in the field of food microbiological detection because of its high sensitivity， high specificity and rapidity. This paper describes the common pathogenic microorganisms in food， the basic principle of PCR technology， the PCR detection method of common pathogenic microorganisms in food， discusses the application of PCR technology in food microbial detection， and introduces the development trend of PCR technology in food microbial detection.

Keywords： PCR technology; food microorganism; pathogenic microorganism; real-time fluorescence quantitative PCR; multiplex PCR

隨著食品工業的快速發展和人們生活水平的不斷提高，食品安全問題日益受到政府和公眾的高度關注。為保障食品安全、維護公眾健康，我國出臺了相關政策。食品微生物污染是導致食品安全問題的主要原因之一。傳統的食品微生物檢測方法，如培養法，存在檢測周期長、靈敏度低等缺點。PCR技術以其快速、靈敏、特異等優點，在食品微生物檢測領域展現出廣闊的應用前景。本文將詳細分析PCR技術在食品微生物檢測中的原理和應用，探討其未來發展趨勢，為食品安全保障提供新思路和新方法。

1 食品中常見的致病微生物

常見的食品致病微生物有沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌。沙門氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌，通常會導致腸道感染和食物中毒，主要在禽肉、蛋制品等食品中引起污染。李斯特菌是一種革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，在自然界中廣泛分布[1]。這種細菌會引發李斯特菌病，患者的死亡率相對較高。它主要通過污染生鮮食品，如乳制品和肉制品等，傳播給人們。大腸桿菌O157：H7是一種致病性細菌，能夠分泌志賀毒素，會導致出血性結腸炎和溶血尿毒癥綜合征。大腸桿菌O157：H7主要污染生牛肉和未經過巴氏殺菌的奶制品等食品。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性球菌，能夠產生腸毒素，主要污染食物包括乳制品和肉制品，可能引起食物中毒。彎曲桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，屬于微需氧或兼性厭氧生物，會導致食源性腸炎和菌血癥，主要在禽肉、未經徹底加熱的奶制品等食品中引發污染。這些病原微生物經常引起食品安全問題，對人體健康構成威脅。

2 PCR技術概述

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是一種在體外快速擴增特定DNA片段的技術。它基于DNA的半保留復制原理，通過反復循環的變性、退火、延伸過程，實現目標DNA的指數擴增。PCR反應體系主要包括模板DNA、一對特異性引物、熱穩定的DNA聚合酶（如Taq酶）、4種脫氧核苷酸和緩沖液等。PCR反應在特定的溫度程序下進行，通常包括94～96 ℃變性、50～65 ℃退火和72 ℃延伸這3個步驟，循環30～40次，每個循環使目標DNA片段呈指數增幅。PCR技術具有快速、高靈敏和高特異的特點，能夠迅速擴增微量DNA樣本，被廣泛運用于基因克隆、疾病診斷和法醫鑒定等領域[2]。隨著PCR技術的不斷進步和創新，包括多重PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR等在內的PCR技術在食品微生物檢測領域的應用不斷擴大，發揮著關鍵作用。

3 食品中常見致病微生物的PCR檢測方法

PCR檢測的關鍵在于引物和探針的設計、PCR反應條件的優化以及PCR產物的檢測和鑒定。引物和探針的設計需要根據目標微生物的特異性基因序列，如毒力基因、致病基因等，利用生物信息學軟件進行設計和優化，以提高PCR檢測的特異性和靈敏度[3]。PCR反應條件的優化包括反應體系的配制（如DNA聚合酶、鎂離子濃度等）、退火溫度和時間、循環數等，通過優化PCR反應條件，可提高PCR檢測的效率和重現性。PCR產物的檢測和鑒定主要采用凝膠電泳、測序、探針雜交等方法，凝膠電泳可根據PCR產物的大小進行定性分析，測序可對PCR產物進行準確鑒定，探針雜交可實現PCR產物的特異性檢測。

4 PCR技術在食品微生物檢測中的應用

4.1 多重PCR技術在食品微生物檢測中的應用

多重PCR技術是利用多對特異性引物，在相同的反應條件下，同時擴增多個目標基因片段，通過優化引物設計和反應條件，可有效避免引物間的相互干擾，提高檢測的特異性和靈敏度[4]。與傳統的單個PCR技術相比，多重PCR技術可顯著提高檢測效率，縮短檢測時間，降低檢測成本，適用于食品中多種致病微生物的同時檢測。多重PCR檢測食品中多種致病微生物的方法主要包括多重常規PCR和多重實時熒光定量PCR。多重常規PCR技術擴增的多個目標片段可通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離和鑒定。利用多重實時熒光定量PCR，可以通過多個熒光標記的特異性探針來同時檢測和量化多種致病微生物。例如，通過多重PCR技術，可以同時檢測食品中的沙門氏菌、李斯特菌以及大腸桿菌O157：H7等多種致病菌。

4.2 實時熒光定量PCR技術在食品微生物檢測中的應用

隨著PCR反應的進行，熒光信號強度不斷積累，通過實時監測熒光信號的變化，可獲得PCR產物的動態積累曲線，從而實現目標微生物的定量分析。與傳統的PCR檢測相比，實時熒光定量PCR具有更高的靈敏度、特異性和重現性，可實現目標微生物的絕對定量和相對定量，避免了PCR后處理的交叉污染風險[5]。在食品微生物定量檢測中，實時熒光定量PCR技術能夠精確測量食品中致病微生物的數量，評估食品的微生物安全風險，并指導制定食品安全管理和控制措施。例如，通過實時熒光定量PCR技術，可以迅速而準確地檢測食品中沙門氏菌、李斯特菌等病原菌的污染水平，從而為評估食品安全風險提供重要參考依據。

4.3 數字PCR技術在食品微生物檢測中的應用

數字PCR技術是將待測樣品與PCR反應液混合，通過微流控芯片或油包水乳液將其分隔為大量獨立的微反應腔，每個反應腔作為一個獨立的PCR反應單元。經過PCR擴增后，根據各反應腔的熒光信號，可判斷每個反應腔中是否含有目標微生物的DNA模板，并統計陽性反應腔的數量，通過泊松分布計算得到待測樣品中目標微生物的絕對含量[6]。與傳統的實時熒光定量PCR相比，數字PCR無須標準曲線，可直接實現目標微生物的絕對定量，具有更高的靈敏度、準確性和重現性，特別適用于低拷貝數模板的定量分析。在食品微生物檢測中，數字PCR技術可精確定量食品中致病微生物的含量，即使在復雜基質和低污染水平下也能實現準確定量。例如，數字PCR技術可以在食品樣品中高效地檢測出沙門氏菌、李斯特菌等病原微生物，為評估和控制食品安全風險提供了可靠的手段。數字PCR技術的高靈敏度、準確性和重現性使其成為食品微生物定量檢測的新選擇。

4.4 PCR技術與其他檢測技術聯用在食品微生物檢測中的應用

PCR-ELISA技術是一種結合了PCR擴增和ELISA檢測的方法，它利用特異性探針與PCR產物結合，并通過酶標記進行反應，從而產生可測量的信號，以實現對目標微生物的特異性檢測和定量分析。PCR-ELISA技術是一種比單獨使用PCR或ELISA更具敏感性和特異性的檢測方法，尤其適用于食品中低濃度致病微生物的檢測[7]。PCR-生物芯片技術是將PCR擴增和DNA微陣列芯片相結合，利用PCR擴增來富集目標微生物的核酸，然后利用芯片上固定的多種特異性探針進行雜交和檢測，從而實現對食品中多種致病微生物的同時檢測和鑒定。PCR-質譜技術是將PCR擴增和質譜分析相結合的一種方法。它首先使用PCR擴增特定微生物的核酸片段，然后利用MALDI-TOF-MS對PCR產物進行精確的分子量測定和序列分析。該技術可以快速、準確地鑒定食品中的致病微生物。將PCR技術與ELISA、生物芯片和質譜等技術結合起來，能夠充分發揮各種技術的優勢，為食品微生物的高靈敏、多重和快速檢測提供了新的解決方案。這種聯合運用在食品安全監測和風險控制領域具有廣闊的應用前景。

5 PCR技術在食品微生物檢測中的發展趨勢

PCR技術在食品微生物檢測中的發展趨勢主要體現在4個方面。①自動化、微型化和便攜化。利用微流控芯片技術和集成化技術，實現樣品制備、擴增反應和產物檢測等步驟的自動化和一體化，同時結合無線傳輸技術，實現檢測數據的實時傳輸和遠程監控[8]。②多重化和高通量化。多重PCR技術可在單個反應中同時檢測多種目標微生物，高通量PCR檢測平臺可同時處理數十至數百個樣品，極大地提高了檢測通量和效率。③定量化和數字化。實時熒光定量PCR和數字PCR技術可實現目標微生物的準確定量，為食品安全風險評估提供更加豐富和可靠的數據支持。④與其他檢測技術的聯用。將PCR技術與培養法、免疫學方法、生物傳感器等技術聯用，可發揮各種技術的優勢，實現食品微生物檢測的全流程優化和綜合效能提升，為食品安全和公眾健康提供更加全面、可靠、高效的保障[9]。

6 結語

PCR技術在食品微生物檢測中扮演著關鍵的角色，主要因其具備高度敏感性、特異性和快速性等優點。近年來，一系列新型PCR技術相繼推出，其中包括多重PCR、實時熒光定量PCR和數字PCR等。這些技術的出現進一步增強了對食品中病原微生物的檢測效能和準確性。將PCR技術、ELISA、生物芯片和質譜等多種技術相結合，可以為食品微生物的全面分析提供全新的研究方向。未來，食品微生物檢測領域將迎來PCR技術的自動化、微型化、便攜化、多重化、高通量化、定量化和數字化發展趨勢。這一技術將與其他檢測方法相結合，為食品微生物檢測提供更快速、更靈敏、更準確和更經濟的解決方案。隨著PCR技術的不斷發展和完善，它將在食品安全保障體系中扮演日益重要的角色，為維護人們健康提供更加有力的支持。

參考文獻

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