北部灣植物內生真菌的分離及次級代謝產物鑒定

王詩怡 王玉妃 劉江曄 劉碩 李子林 劉金燕 孔凡棟 王聰

摘要：目的 對北部灣3株藥用植物的內生真菌進行研究，研究小葉海金沙內生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573次級代謝產物。方法 通過10倍稀釋法分離小葉海金沙、野牡丹和蓮子草的內生真菌，對小葉海金沙內生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的次級代謝產物進行分離純化，通過NMR、MS、ECD等方法進行結構鑒定，采用DPPH法進行化合物抗氧化活性檢測，采用微量二倍稀釋法進行抑菌活性測試。結果 從3株植物中分離到內生真菌171株，從Spegazzinia sp. MDCW-573的次級代謝產物中共分離得到異香豆素類化合物3個，其中化合物1為新化合物。化合物1對金黃色葡萄球菌及MRSA、化合物3對MRSA的抑菌活性MIC均為128 μg/mL。結論 化合物1～3都是首次從斯氏霉屬真菌的次級代謝產物分離獲得，化合物1是1個新化合物，化合物1和3具有抑菌活性。

關鍵詞：廣西北部灣；內生真菌；Spegazzinia sp.；次級代謝產物

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Isolation and secondary metabolites identification of endophytic fungi from plants in the Beibu Gulf

Wang Shiyi， Wang Yufei， Liu Jiangye， Liu Shuo， Li Zilin， Liu Jinyan， Kong Fandong， and Wang Cong

（Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， State Ethnic Affairs Commission， Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products， Key Laboratory of universities in Guangxi for Excavation and Development of Ancient Ethnomedicinal Recipes，

Guangxi Minzu University， Nanning 530006）

Abstract Objective The endophytic fungi of three medicinal plants in the Beibu Gulf were studied， and the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were also investigated. Methods The endophytic fungi Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.， Melastoma candidum D. Don and Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC. were isolated by the ten-fold dilution method. The secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were isolated and purified. The structures were identified by NMR， MS and ECD methods. The antioxidant activity of the compounds was detected by the DPPH method， and the antibacterial activity was tested by the micro-double dilution method. Results A total of 171 strains of endophytic fungi were isolated from these three plants. Three isocoumarin compounds were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573， among which compound 1 was a new compound. Compounds 1 and 3 displayed antibacterial activitiesagainst MRSA with the same MIC value of 128 μg/mL. The MIC of compound 1 against Staphylococcus aureus was 128 μg/mL. Conclusion Compounds 1～3 were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. for the first time. Compound 1 is a new compound， and compounds 1 and 3 showed antibacterial activity.

Key words Beibu Gulf of Guangxi; Endophytic fungi; Spegazzinia sp.; Secondary metabolites

內生真菌（endophyte）是一類生長在宿主植物體中而不引起明顯病害現象的共生微生物。內生真菌與宿主在長期協同進化的過程中互惠共生[1-2]，宿主為內生真菌提供營養物質，內生真菌產生生物活性物質使得宿主免受生物和非生物脅迫的影響，增強宿主在生存競爭中的優勢[3-5]。目前所知研究已報道的內生真菌次級代謝產物有酚類、醌類、萜類、生物堿、類固醇、黃酮類、香豆素類[6]， 具有抗癌[7]、免疫調節[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗結核[11]、抗糖尿病[12]、驅蟲[13]等諸多有益生物活性。此外，還有研究證明內生真菌可以與宿主植物產生相似的代謝物如類黃酮、皂苷、酚酸、萜烯等被認為是結構新穎、活性獨特化合物的重要來源[14]。

北部灣地處熱帶和亞熱帶，藥用植物資源豐富。蘇秀麗等[15]在黃花倒水蓮的1株鏈格孢屬HNLF-44內生真菌發酵液中發現黃酮類物質，DPPH清除率在80%以上，具有較強的清除活性。Luo等[16]在廣西地不容塊根的一株橘青霉DBR-9內生真菌的發酵物中鑒定出2種活性聚酮類化合物，對于病原真菌具有較強抑制作用。宋靜靜等[17]發現夾竹桃的內生真菌次級代謝產物具有抑制水產病原菌生長的作用。龔斌

等[18]發現廣西柳樹桑寄生的1株擬盤多毛孢屬內生真菌次級代謝產物對A549和H460具有較強抑制作用。

本研究選取小葉海金沙[Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.]、野牡丹[Melastoma candidum D. Don]和蓮子草[Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC.] 3種廣西藥用植物為研究對象。小葉海金沙藥用成分包括黃酮類、酚酸及酚苷類、甾類、萜類、揮發油等，具有抑菌及抗氧化降血糖等藥理作用[19]。野牡丹藥用成分包括甾體、黃酮、有機酸、萜類、酰胺類、氨基酸、酯類等，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等藥理活性[20]。蓮子草藥用成分包括黃酮類、萜類、甾醇類、有機酸類、氨基酸類、生物堿、酰胺等，具有抗病毒、免疫調節、抗肝炎、抑菌等藥理作用[21]。通過10倍稀釋法對3種藥用植物樣品進行真菌分離，使用兩種培養基對獲得的菌株進行發酵。通過菌株形態排重結合化學排重（HPLC、TLC）共獲得171株真菌。從中選取小葉海金沙的內生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573為目標菌株，其次級代謝產物經分離鑒定后得到3個異香豆素類化合物，化合物1是新化合物，抑菌和抗氧化活性測試表明化合物1與化合物3有抑菌活性，化合物2抑菌活性不顯著，3個化合物均未表現出顯著的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

小葉海金沙、野牡丹和蓮子草均采自廣西北部灣，小葉海金沙（21°54′16′′，108°36′49′′）、野牡丹（21°54′14′′，108°36′48′′）、蓮子草（21°54′5′′，108°36′50′′）。

1.1.2 分離培養基（氯霉素添加量為5 mg/100 mL）

PDA培養基：馬鈴薯20.0 g/100 mL，葡萄糖2.0 g/

100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL。

真菌2號培養基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氫鉀0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏0.3 g/

100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，麥芽糖2.0 g/100 mL，葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

孟加拉紅培養基：瓊脂2.0 g/100 mL，孟加拉紅3.6 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，pH 7.0。

1.1.3 發酵培養基

真菌2號培養基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氫鉀0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏

0.3 g/100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，麥芽糖2.0 g/100 mL，

葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

大米培養基：大米80 g，海水120 mL。

1.1.4 試劑和儀器

HCB-1300V潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；Agilent 1260 HPLC（美國Agilent公司）；硅膠板（青島海洋化工廠）；AL104分析天平（瑞士梅特勒公司）；YXQ-LS-75SII 高壓滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；半制備C18柱（Nacalai tesque公司）; Brucker AVANCE 400 MHz核磁共振波譜儀（美國Brucker公司）；MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜（Thermo公司）；K3 TOUCH酶標儀（飛世爾實驗器材有限公司）；CR-080R 型春霖超聲波清洗機（深圳市春霖清洗設備有限公司）；LRH-500A生化培養箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）；Mariner API-TOF型質譜儀（美國應用生物系統公司）；Agilent Cary 60紫外可見光譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；提取分離用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（成都市科隆化學品有限公司）均為工業用化學純產品。

1.2 樣品預處理與菌株分離及保藏

樣品預處理：將樣品用自來水沖洗干凈后帶入超凈臺，用無菌水將植物樣品洗凈后取其根、莖、葉和花各部位的一小部分加入適量無菌水進行研磨，用無菌槍頭吸取10 mL于離心管作為母液。取1 mL母液加9 mL無菌水混合即得10倍稀釋液。

菌株分離：采用10倍稀釋法分離純化樣品真菌，各取1 mL稀釋液均勻地涂布于3種分離培養基平板（孟加拉紅培養基、真菌2號培養基、PDA培養基），每個稀釋度涂布兩個平板，放入28 ℃恒溫培養箱中培養3～4 d。挑取培養基中的單菌落進行純化，若出現染菌則挑取此菌落做進一步劃線分離，重復操作直至獲得單菌落。

菌株保藏：將純化得到的菌株接入PDA斜面培養基，28 ℃恒溫培養后于4 ℃冰箱進行斜面保藏; 將純化菌株接入含有20%甘油的PDA液體培養基甘油管，28 ℃恒溫培養后于-20 ℃冰箱進行甘油管保藏。

1.3 菌株的篩選

1.3.1 菌株發酵

保藏于斜面的菌株接種到滅菌的真菌二號培養基及大米培養基中靜置發酵30 d。

1.3.2 菌株鑒定

植物內生真菌MDCW-573菌株鑒定，包括基因組DNA的提取、擴增、純化和測序，均在上海生工生物工程股份有限公司進行。基于形態及生理生化特征、運用NCBI數據庫對真菌ITS序列進行比較，運用軟件MEGA（Version 7.0）對菌株系統進化樹進行繪制。

1.3.3 發酵產物的提取與分離

大米培養基下發酵：發酵結束后將大米搗碎，用等體積的乙酸乙酯浸泡并超聲萃取3次，經減壓濃縮得浸膏。真菌二號培養基下發酵：加入等體積乙酸乙酯并用破碎機破碎，超聲萃取3次后減壓濃縮得浸膏。

1.4 活性測試

1.4.1 抗氧化活性測試

采用DPPH法測定化合物的抗氧化活性[22]，評價其自由基清除能力。以MeOH為溶劑，分別配制

20 μmol/L樣品溶液（a）和VC溶液（b）及0.15 μmol/L的DPPH溶液（c）。將樣品+DPPH（160 μL a + 40 μL c）、樣品對照（160 μL a + 40 μL MeOH）、VC+DPPH（160 μL b + 40 μL c）、陽性對照（160 μL b + 40 μL MeOH）、陰性對照（160 μL MeOH + 40 μL c）、空白（200 μL MeOH）加至96孔板，每孔設置3個平行。使用酶標儀測量517 nm處的A值，自由基清除率采用以下公式計算：

清除率=[A陰性對照-（A樣品+DPPH-A樣品對照）]/A陰性對照×100%

1.4.2 抑菌活性測試

采用微量二倍稀釋法對化合物進行抑菌活性評價[23]， 96孔板中加入100 μL稀釋100倍的菌液，測試藥物濃度為256～0.5 μg/mL。使用環丙沙星為陽性對照，檢測化合物對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抑菌活性。

1.4.3 ECD計算

在Gaussian 09軟件中使用密度泛函理論（DFT）進行計算[24]。具體步驟為：使用hyperchem軟件進行初步構象搜索，在B3LYP/6-31G（d）水平上進行進一步的幾何優化，用SCRF/PCM方法在相同的DFT水平上評價了甲醇溶液的溶劑效應，用B3LYP/6-31G（d）下的TDDFT計算了化合物甲醇中的電子激發能和旋轉強度。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

采用10倍稀釋法從小葉海金沙、野牡丹和蓮子草等3種植物樣品中分離獲得171株真菌，形態見圖1，菌株分離情況統計見圖2。

（1）小葉海金沙（64株）： MDCW-428、MDCW-431、MDCW-440、MDCW-455、MDCW-458～460、MDCW-463～464、MDCW-475、MDCW-478、MDCW-479、MDCW-481、MDCW-484～485、MDCW-491～492、MDCW-496～497、MDCW-513～515、MDCW-517、MDCW-519、MDCW-522～523、MDCW-526～528、MDCW-532、MDCW-536～540、MDCW-541、MDCW-542、MDCW-545、MDCW-547、MDCW-548、MDCW-550、MDCW-554、MDCW-556～558、MDCW-560、MDCW-563、MDCW-565、MDCW-566、MDCW-571～575、MDCW-578、MDCW-581、MDCW-583～584、MDCW-586～588、MDCW-593、MDCW-595、MDCW-596～597。

（2）野牡丹（33株）： MDCW-433、MDCW-435、MDCW-468、MDCW-477、MDCW-480、MDCW-493、MDCW-495、MDCW-499、MDCW-502、MDCW-504、MDCW-505、MDCW-507、MDCW-511、MDCW-516、MDCW-525、MDCW-530、MDCW-543、MDCW-544、MDCW-546、MDCW-551、MDCW-552、MDCW-555、MDCW-559、MDCW-568、MDCW-579、MDCW-580、MDCW-582、MDCW-585、MDCW-589、MDCW-590、MDCW-591、MDCW-592、MDCW-605。

（3）蓮子草（74株）： MDCW-426～427、MDCW-429～430、MDCW-432、MDCW-434、MDCW-436～439、MDCW-442～462、MDCW-465～467、MDCW-469～474、MDCW-476、MDCW-482、MDCW-483、MDCW-486～490、MDCW-494、MDCW-498、MDCW-500～501、MDCW-503、MDCW-506、MDCW-508～510、MDCW-512、MDCW-518、MDCW-520～521、MDCW-524、MDCW-529、MDCW-531、MDCW-533～534、MDCW-539、MDCW-549、MDCW-553、MDCW-561～562、MDCW-564、MDCW-567、MDCW-569～570、MDCW-576～577、MDCW-594。

2.2 菌株鑒定

PCR擴增MDCW-573菌株的ITS序列長度為568 bp，與NCBI數據庫中的斯氏霉屬菌株在系統發育樹上處于同一分支如圖3所示，呈現出高度的相似性[25]。對其形態特征做進一步觀察，發現與斯氏霉屬菌株的形態特征一致。故初步鑒定菌株MDCW-573（GenBank 登錄號OR 121523）為斯氏霉屬菌株，并命名為 Spegazzinia sp. MDCW-573。

2.3 化合物的分離與鑒定

對Spegazzinia sp. MDCW-573 （來源：小葉海金沙；真菌二號分離培養基；10倍稀釋菌液）真菌二號發酵培養基（發酵6 L）中的次級代謝產物進行分離，采用凝膠柱色譜技術，以1：1的比例使用二氯甲烷和甲醇進行洗脫，并進行TLC檢測以合并共得到4個組分Fr.1～Fr.4。Fr.4通過HPLC半制備（C18半制備柱，甲醇：水 ＝ 45：55，流量4 mL/min）純化，得到化合物1 （21.2 mg，tR ＝ 9.0 min），2 （35.6 mg，tR ＝ 10.0 min），3 （11.3 mg，tR ＝ 20.0 min）。通過MS和NMR鑒定3個化合物分別為3-epi-lignicol，lignicol和6-demethylkigelin（圖4）。

化合物1：藍色固體；+47.6 （c 1.1， MeCN）；正離子高分辨質譜HR-ESI-MS在m/z 241.0703給出準分子離子峰[M+H]+，提示分子式為C11H12O6。紅外光譜給出羥基和羰基（3373 cm-1和1660 cm-1）等官能團的特征吸收峰。UV（nm）： 306 （0.16）， 272 （0.43）， 218 （0.82）nm，

該化合物與已知化合物lignicol（2）[26]具有相同的紫外吸收，初步判斷其也為異香豆素類化合物。化合物1的13C-NMR（表1）和HSQC譜圖給出1個羰基碳（δC 171.3）、6個苯環或雙鍵碳（δC 158.4， 157.3， 139.1， 136.2， 108.5， 101.3）、2個含氧sp3次甲基（δC/H 79.8/4.63， 67.6/4.41）以及2個甲基（δC/H 60.9/3.84， 16.3/1.48），包括1個含氧甲基。這些數據與化合物2的核磁共振波譜數據非常相似[26]，只是化合物1中C-2、C-3和C-4的化學位移（δC 16.3、79.8和67.6）與化合物2中（δC 18.1、81.3和69.4）相比均向高場位移。化合物1的1H-1H COSY給出H-2/H-3的相關信號；其HMBC譜圖給出H-2與C-3、C-4，H-3與C-2、C-4，H-4與C-3、C-5、C-9、C-10，H-5與C-1、C-4、C-6、C-7、C-9，以及H-11與C-7的相關信號（圖5）。以上數據提示化合物1和2具有相同的平面結構，區別僅是C-3和C-4位手性碳的相對構型不同，故化合物1的H-3和H-4被確定為同面，與化合物2中相反。1的絕對構型是通過量子化學ECD計算確定的，計算和擬合結果顯示化合物1的實測ECD譜圖和（3S，4S）-1的計算譜圖具有較好的吻合（圖6），證明化合物的絕對構型為3S和4S。化合物1的名字命名為3-epi-lignicol。

化合物2：白色固體，ESI-MS： m/z 241.0 [M+H]+，分子式為C11H12O6，比旋光值+38.6 （c 2.8， MeCN）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.60（1H，s，H-5），4.44（2H，m，H-3，4），3.83（3H，s，H-11），1.44（3H，d，J = 5.9 Hz，H-2）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz） δ： 170.4（s，C-1），158.7（s，C-6），157.3（s，C-8），140.2（s，C-10），135.6（s，C-7），106.5（d，C-5），100.8 （s，C-9），81.3（d，C-3），69.4（d，C-4），60.9（q，C-11），18.1（q， C-2）。以上數據與文獻[26]對比，鑒定化合物2為 lignicol。

化合物3：白色固體，ESI-MS： m/z 225.0 [M+H]+，分子式為C11H12O5，比旋光值-35.3 （c 0.9， MeOH）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.28（1H，s，H-5），4.68～4.63（1H，m，H-3），3.82（3H，s，H-11），2.90～2.75（2H，m，H-4），1.46（3H，d，J= 6.2 Hz，H-2）；13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ： 171.8（s，C-1），158.4（s，C-8），157.6（s，C-6），137.5（s，C-10），135.0（s，C-7），107.8（d，C-5），102.2（s，C-9），77.6（d，C-3），60.9（q，C-11），35.1（t，C-4），20.8（q，C-2）。以上數據與文獻[27]對比，鑒定此化合物3為6-demethylkigelin。

2.4 活性測試結果

2.4.1 抗氧化活性測試結果

在20 μmol/L的濃度下3個化合物均不顯示明顯的抗氧化活性，其DPPH清除率分別是6.9%、26.1%和13.5%，陽性對照VC的清除率為92.1%。

2.4.2 抑菌活性測試結果

對3個單體化合物進行抑菌活性測試后，發現化合物1、3對金黃色葡萄球菌有抑制活性，此外化合物1還對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抑制活性。化合物1、3的最小抑菌濃度（MIC）如表2所示。

3 討論

本研究通過10倍稀釋法從來源于廣西北部灣的3種藥用植物小葉海金沙、野牡丹、蓮子草中分離獲得了171株真菌，其中10倍稀釋液分離真菌數量多于母液。對從小葉金海沙中分離的內生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的真菌2號液體發酵次級代謝產物進行分離鑒定，獲得3個異香豆素類化合物且化合物1為新化合物。化合物1對金黃色葡萄球菌及MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL。化合物3對MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL。化合物1～3均不顯示明顯的抗氧化活性。

4， 6， 8-三羥基-7-甲氨基-3-甲基二氫異香豆素（lignicol）首次分離于柱頂孢霉屬Scytalidium sp.，而后又在Parapyenchaeta sp. SGSF449的發酵物中被分離。本研究首次從斯氏霉屬Spegazzinia sp.菌株中分離得到lignicol。以往研究證明lignicol對于丁香假單胞菌（P. syringae）、水稻黃單胞菌（X. oryzae）、青枯勞爾菌（R. solanacearum）有微弱的抗菌活性，MIC為500 μg/mL。本研究進一步發現在藥物濃度為256～0.5 μg/mL下其對金黃色葡萄球菌和MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）無明顯抑菌活性。

6-demethylkigelin可作為植物生長調節劑抑制高濃度下IAA對植物根生長的抑制作用。以往研究表明該化合物對丁香假單胞菌（P. syringae）、青枯勞爾菌（R. solanacearum）、甘藍黑腐黃單胞菌（X. campestrus）、水稻黃單胞菌（X. oryzae）具有微弱的抑菌活性MIC為500 μg/mL。本研究發現其對MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL。

目前對于廣西北部灣植物內生真菌次級代謝產物活性研究相對較少，以前的研究多數停留在菌株分離鑒定及粗提物活性初篩上，對菌株次級代謝產物的研究尚不深入。迄今為止，針對斯氏霉屬真菌的次級代謝產物研究很少，本研究得到的3個化合物均為首次從斯氏霉屬真菌中分離得到，本研究結果極大豐富了斯氏霉屬內生真菌的次級代謝產物多樣性研究，為進一步開發利用北部灣真菌資源打下了基礎。

參 考 文 獻

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