井岡山地區苔蘚來源內生真菌多樣性和抗菌活性研究

劉文杰 張俊峰 何夢凡 唐佳慧 姜淑玲 郭文強

摘要： 目的 了解井岡山地區苔蘚內生真菌多樣性及其群落結構特點，為特殊生境來源內生真菌抗生素研究打下基礎。方法 本文采用可培養方法分離內生真菌，結合形態學特征和ITS-rDNA分子生物學數據對所分離的菌株進行鑒定，利用紙片擴散法進行抗菌活性篩選與分析。結果 從4種苔蘚樣品中共分離純化232株可培養內生真菌，其分離頻率和定殖率分別在1.84～2.88和95.65%～100%之間。分子生物學特征顯示內生真菌歸于38個分類屬，其中青霉屬是4種苔蘚植物的優勢內生真菌屬，但各類苔蘚的優勢種存在差異，部分內生真菌顯示出宿主專一性。生物活性篩選結果顯示其中50株內生真菌的靜置發酵產物具有抗菌活性，綜合活性率為21.55%。結論 本研究表明井岡山地區苔蘚內生真菌具有豐富的多樣性，其次級代謝產物良好的抗菌活性，預示著潛在的抗生素類天然產物研究價值。

關鍵詞：井岡山地區；苔蘚植物；內生真菌；多樣性；抗菌活性

中圖分類號：R915文獻標志碼：A

Diversity and antibacterial activity of endophytic fungi

from bryophyte species in Jinggangshan area

Liu Wenjie1， 2， Zhang Junfeng1， He Mengfan1， Tang Jiahui1， Jiang Shuling1， and Guo Wenqiang1

（1 Department of Medicine， Jinggangshan University， Ji'an 343009; 2 Office of Academic Research， Jinggangshan University， Ji'an 343009）

Abstract Objective To understand the diversity and community structure characteristics of endophytic fungi in mosses in the Jinggangshan area， and lay a foundation for the study of antibiotics for endophytic fungi from special habitat sources. Methods Culturable methods were used to isolate endophytic fungi. The isolated strains were identified based on morphological characteristics and ITS-rDNA， and the paper diffusion method was applied for antibacterial activity screening. Results A total of 232 cultivable endophytic fungi were purified from four bryophyte species， with isolation frequencies and colonization rates ranging from 1.84～2.88 and 95.65%～100%， respectively. Molecular biology characteristics showed that the endophytic fungi belonged to 38 species， among which penicillium was the dominant endophytic fungi genera of the four bryophyte species. However， the dominant species of each type in bryophytes were different， demonstrating host specificity. The biological activity results showed that the static fermentation products exhibited antibacterial activity， with a comprehensive activity rate of 21.55%. Conclusion This study indicated that the endophytic fungi had generous species diversities， and their secondary metabolites showed great antibacterial activity and potential research value for antibiotic products.

Key words Jinggangshan area; Bryophyte species; Endophytic fungi; Diversities; Antibacterial activity

苔蘚植物作為一類獨特的小型高等植物，沒有真正的根、莖、葉的分化，主要由孢子進行繁殖，多生長于陰濕環境之中。在植物界演化進程中，它代表著從水生逐漸過渡到陸生的典型物種[1]。苔蘚植物對環境有較強的適應能力，分布生態環境較為廣泛，全世界約有苔蘚植物189科1284屬22175種，中國已報道發現150科591屬3021種，是世界上苔蘚植物多樣性程度最高的國家之一[2]。研究表明苔蘚植物中廣泛定殖有內生菌，作為苔蘚適應陸生環境的一個重要過渡類型，內生菌在苔蘚植物的環境適應中發揮了重要的作用，能夠顯著提升對各種生物和非生物脅迫的抗性[3-4]。

有關苔蘚植物內生菌的研究多聚焦于極端環境，如沙漠和極地等[5-6]，而對溫帶和亞熱帶雨林等非極端環境苔蘚內生菌的研究報道卻相對較少[7-8]。因此全面了解各種生態環境來源內生真菌的多樣性組成及其次級代謝產物的生物活性，是苔蘚內生真菌來源藥物先導化合物開發研究的基礎。

井岡山國家級自然保護區位于江西省中南部的井岡山市，是以中亞熱帶濕潤常綠闊葉林生態系統及其生物多樣性為主的自然保護區[9]。保護區內峽谷瀑布眾多，并具有豐富的地表水徑流和地下水資源。獨特、優越的自然地理條件為苔蘚植物的生長提供了豐富多變的環境。現知共有苔蘚67科183屬418種8亞種6變種，其苔蘚植物種類繁多，生活型與群落類型豐富多樣，是井岡山自然保護區豐富的自然資源和生物多樣性的特色之一。因此，以該地區苔蘚來源內生真菌為挖掘對象的抗菌活性天然產物研究具有巨大的潛力。

本研究對井岡山自然保護區內4種苔蘚來源內生真菌多樣性和次級代謝產物進行挖掘，研究結果不僅可以豐富不同生境苔蘚來源內生真菌的多樣性，還可為特殊生境來源內生菌次級代謝產物的結構多樣性及生物活性研究提供可靠的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

4種苔蘚樣品（直葉曲尾蘚Dicranum orthophylloides、小火蘚Schlotheimia pungens、中華細枝蘚Lindbergia sinensis和中華細指苔Kurzia sinensis）于2021年7月采集于江西省井岡山國家級自然保護區。每種苔蘚選擇5個采樣點，每個采樣點隨機采集苔蘚的光合作用部分和根部樣品，共得到100個樣本。樣品采集置于密封袋后4 °C冰箱保藏。

1.1.2 培養基

菌株分離培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，g/L）：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0，氯霉素0.1，去離子水1.0 L；孟加拉紅瓊脂培養基（RBC，g/L）：蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氫鉀1.0，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂20.0，1/3000孟加拉紅溶液 100.0 mL，氯霉素0.1，去離子水1.0 L。

菌株液體發酵培養基（2#，g/L）：甘露醇20.0，麥芽糖20.0，葡萄糖10.0，谷氨酸鈉10.0，KH2PO4 0.5，玉米漿1.0，酵母浸粉3.0，MgSO4·7H2O 0.3，去離子水1.0 L。

1.1.3 抗菌活性指示菌

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，BNCC109047）、草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，BNCC359483）、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，BNCC134980）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335）、大腸埃希菌（Escherichia coli，BNCC336902）均購于北納創聯生物科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（XFH-100CA，浙江新豐醫療器械有限公司）；超凈工作臺（SN-CJ-2FD，上海尚儀儀器設備有限公司）；生化培養箱（SN-SPX-350B，上海尚儀儀器設備有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；低溫冷卻液循環泵（DLSB-5/20，鄭州長城科工貿有限公司）；循環水真空泵（SHZ-DIII四氟型，上海力辰儀器科技有限公司）分析天平（FA224，上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌分離純化

每種苔蘚沖洗表面泥土后，依次經過75%酒精漂洗3 min、無菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉溶液漂洗2 min、無菌水沖洗3次。加水充分研碎并吸取上清液，分別置于PDA和RBC培養基上于24 ℃恒溫孵育5～25 d，從中分離出具有不同形態的真菌菌落，將其重新接種至PDA培養基上再孵育培養5～7 d。根據在PDA平板上的菌落形態特征（依據單菌落形態表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率、產孢方式、孢子形態特征和產孢結構特點等），將其分為不同的形態類型，最終得到內生真菌純菌株。

1.2.2 內生真菌種屬鑒定

實驗采用ITS通用引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]：ITS1（5'-AGAA GTCGTAACAAGGTTTC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'）擴增內部轉錄的間隔區[10-12]，PCR擴增產物1%瓊脂糖膠電泳檢測合格后，由北京睿博生物科技有限公司完成后續菌株測序工作。通過對其BLAST數據分析后，將鑒定出的菌株序列與GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的其他真菌序列進行比較分析，并在ClustalW中進行比對[13]。利用Godinho的標準來分析驗證GenBank數據庫的BLAST結果：對于覆蓋率和序列同一性大于98%，內生真菌種屬被確定；對于覆蓋率和序列同一性為95%～97%確定到種，而覆蓋率和序列同一性小于95%，則暫定為新菌[14]。

1.2.3 內生真菌發酵培養與抗菌活性測試

將內生真菌繼代培養后接種至2#液體發酵培養基中，參考文獻[15]中的菌株發酵條件和提取方法獲得粗提物。采用紙片擴散法進行抗菌活性篩選，以2 mg/mL氯霉素為陽性對照藥。制備含提取物紙片的方法參照文獻[15]，將藥敏紙片放置在指示菌瓊脂表面上，于37 ℃培養箱中培養24 h。通過測量抑菌圈直徑來評價其抗菌活性強弱。抗菌活性評價標準：抑菌圈直徑小于11.0 mm代表活性較弱；抑菌圈直徑11.0～15.0 mm代表中等活性；抑菌圈直徑15.0～

20.0 mm代表活性較強；抑菌圈直徑大于20.0 mm代表活性顯著。

1.2.4 次級代謝產物分離純化

菌株JW-15-2在2#培養基條件下實驗室靜置發酵30 d，菌體甲醇浸泡，超聲破碎；發酵液乙酸乙酯萃取，減壓蒸餾，合并獲得粗浸膏6.8 g。粗浸膏采用甲醇為流動相的葡萄糖凝膠LH-20進行分離，所得6個組分進行抗菌活性測定。其中組分3表現出較好的抗菌活性且化合物較為單一，進一步利用正相硅膠柱（流動相為二氯甲烷：甲醇=10：1）其進行純化，并采用ODS-C18半制備柱（YMC-Pack ODS-A， 10 mm×

250 mm， 5 μm， 4 mL/min），采用流動相：甲醇/水=55/45進行制備，獲得化合物1（tR=18.0 min）。

1.2.5 數據統計分析

內生真菌的分離頻率（isolation rate， IR）和定殖率（colonization rate， CR）可以衡量苔蘚組織中內生真菌的豐富程度和組織塊受侵染的頻率，相對分離頻率（relative frequency，RF）則可以衡量苔蘚組織中內生真菌的優勢度[16]，其分別按以下公式（1～3）計算得出。

2 結果與討論

2.1 內生真菌種屬分析與鑒定

通過組織研磨分離法從井岡山地區來源苔蘚的各個樣品中獲得內生真菌232株，對其歸類分析發現涵蓋子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群，統計分析發現青霉屬和曲霉屬真菌為占比最高，分別為39.66%和6.47%（圖1）。

基因序列對比結果顯示部分菌株與數據庫最接近的種屬具有較高的相似度，初步推斷其中225株內生真菌分別隸屬于13個目26個科38個屬（表1），其中7株內生真菌因與GenBank數據庫中的序列覆蓋率和序列同一性小于95%，因而暫時不能確定其種屬歸類。

2.2 內生真菌的分離頻率和定殖率

從井岡山地區來源的直葉曲尾蘚、小火蘚、中華細枝蘚和中華細指苔的100個樣本中分別得到內生真菌72、46、60和54株，分離結果顯示其內生真菌分離頻率在1.84～2.88之間，平均分離頻率為2.32（圖2）。其中直葉曲尾蘚內生真菌的分離頻率最高為2.88，小火蘚內生真菌的分離頻率最低為1.84。內生真菌的定殖率在不同苔蘚種類間存在一定的差異性，其分布在95.65%～100%之間（圖3）。實驗結果顯示，不同種類苔蘚內生真菌的分離率和定殖率趨勢一致，但存在各自的種群差異性，其中直葉曲尾蘚的分離率和定殖率都最高，小火蘚的分離率和定殖率最低。

2.3 內生真菌的相對分離頻率

苔蘚樣品中優勢菌屬為青霉屬，其相對頻率分別為39.66%。各種苔蘚植物中不僅內生真菌的種類不同，其優勢內生真菌種群也存在差異。其中直葉曲尾蘚樣品中內生真菌種類最多，有31種；小火蘚樣品中內生真菌種類最好，僅有22種。中華細枝蘚和中華細指苔樣品中內生真菌分別有26種和28種。統計發現青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢霉屬（Cladosporium）、木霉屬（Trichoderma）是該地區苔蘚來源內生真菌的優勢屬，其相對分離頻率分別為39.66%、6.47%、5.60%和4.74%（圖1）。由此可見，不同苔蘚的內生真菌群落組成各不相同，且內生真菌群落的多樣性因苔蘚種類差別而異。

2.4 內生真菌的抗菌活性評價

將所有菌株采用真菌2號培養基靜置發酵30 d后，獲得232個代謝粗提物。在對其進行5種鑒定菌的抗菌活性篩選后，發現50株內生真菌的次級代謝產物表現出較好的抗菌活性，綜合活性率為21.55%。其中部分菌株表現出廣譜的抗菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌顯示出顯著的抑制活性（表2），預示潛在的活性代謝產物研究價值。

2.5 內生真菌代謝主產物分析

結合抗菌活性篩選與代謝產物分析結果，發現活性菌株JW-15-2（Penicillium sp.）具有較好的研究潛力，逐對其的次級代謝產物進行抗菌活性追蹤分離純化研究，從中獲得了1個代謝主產物（化合物1），其NMR數據與文獻報道的已知化合物一致[17]，確定化合物1為苯二氮卓類生物堿circumdatin B（圖4）。

化合物1 ?淡黃色粉末；ESI-MS： m/z 388.3 [M+Na]+（C20H19N3O4Na）；UV（MeOH）λmax（log ε）230（3.15），270（3.23），320（3.68）nm；1H NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ： 7.83，7.65，7.59，6.41，5.74，5.71，4.54，3.63，2.03，1.97，1.76，1.23； 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6）δ： 163.7，162.4，158.7，157.7，157.1，145.6，132.9，132.3，130.9，129.6，129.4，129.1，115.8，110.4， 95.6，58.4，55.5，46.7，26.6和23.7。

3 討論

3.1 內生真菌的物種多樣性

井岡山國家級自然保護區氣候屬于亞熱帶濕潤山地氣候，地表水和地下水資源非常豐富，水質良好，森林土壤類型豐富，孕育著豐富的生物資源。苔蘚植物對水分、礦質營養等特殊的體表吸收方式，利用孢子進行遠距離傳播的能力和多樣化的營養繁殖方式，使其能廣泛地分布于保護區的絕大部分生境中，形成大片極具地域特色的苔蘚群落[9]。

有研究表明，許多苔蘚植物具有特殊的芳香氣味，且不易被微生物、昆蟲等侵蝕破壞，且其中的化學成分也表現出廣泛的生物學活性，比如植物生長調節、抗氧化、抗炎、抗真菌和細胞毒活性等，這些現象表明苔蘚中存在著活性物質來參與化學防

御[18]。由于苔蘚植物所形成的特殊內部微環境，生活在其中的微生物迫于多種因素的壓力，同時經過與宿主植物的長期協同進化，可能存在獨特的生物合成代謝途徑，能夠產生擁有新穎結構骨架的天然產物。內、外生存環境的特殊性，極有可能造就井岡山自然保護區來源苔蘚內生真菌異于普通生境下真菌的特殊基因簇及合成特殊化合物的能力，是抗生素類活性天然產物潛在的資源庫。

本研究從井岡山地區4種苔蘚中分離獲得232株苔蘚內生真菌，內生真菌的分離頻率分布在 1.84～2.88之間，與研究報道的熱帶和溫帶生態環境中的提燈蘚、地錢、鞭苔及合葉苔的內生真菌分離頻率具有一定的相似度，但遠高于極端生態環境苔蘚植物內生真菌的分離頻率，如發現于極端干熱環境的白發蘚和角齒蘚內生真菌分離頻率僅為0.15和0.21[6，19-20]。文獻調研結果表明，苔蘚植物來源內生真菌的豐富程度不僅與宿主植物種類密切相關，其所處的生態環境也是造成豐度差異的一個潛在因素，說明相對適宜的氣候溫度和營養環境能夠顯著提升苔蘚來源內生微生物的數量和種群類型。與此同時，本研究中4種苔蘚植物內生真菌的定殖率在95.65%～100%之間，也遠高于極端低溫環境來源苔蘚植物內生真菌8.7%～12.3%的定殖率[21]。由此表明，井岡山地區濕潤多雨的亞熱帶季風氣候環境，造就了其苔蘚來源內生真菌豐富的物種多樣性。

3.2 內生真菌良好的生物活性和代謝潛力

近幾十年來，植物內生真菌作為特殊生境來源的微生物受到越來越多的關注，已成為生物活性物質重要的資源庫[22]。研究發現，植物內生真菌已經進化出適應植物微環境的遺傳和代謝機制，這意味著該特殊生境的真菌具有產生結構類型獨特的代謝產物的潛力[23]。本研究利用紙片擴散法對井岡山地區苔蘚來源內生真菌次級代謝產物的抗菌生物活性進行篩選研究，發現了50株具有抗菌活性的菌株，綜合活性率為21.55%。生物活性結果顯示，該來源的內生真菌具有較好的研究潛力，是抗生素研發潛在的資源庫。

通過對活性菌株JW-15-2次級代謝產物研究獲得了苯二氮卓類生物堿類化合物1。苯二氮卓類藥物作為一類臨床使用廣泛的鎮靜類處方藥物，許多該類型的化合物已被全合成獲得，而大多數天然存在的苯二氮卓類藥物則主要來自于絲狀真菌，如青霉屬和曲霉屬真菌[24]?；衔?抗菌活性篩選發現其具有較弱的抑菌活性，但該類化合物具有復雜的生物合成途徑，后續利用基因調控策略（如OSMAC、表觀遺傳修飾等）激活活性菌株沉默的生物合成基因簇，可能能夠獲得結構更為多樣的活性抗生素類天然產物。

綜上研究表明，井岡山地區來源苔蘚內生真菌具有豐富的物種多樣性，表現出良好的抗菌活性，其潛力菌株為后續抗生素類藥物先導化合物的開發研究奠定了實驗基礎。

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