Ghrelin基因敲除對小鼠黑質區多巴胺能神經元突觸后電位的影響

劉靜 李煥煥 焦倩 陳曦 姜宏 杜希恂

［摘要］ 目的

探討胃饑餓素（ghrelin）基因敲除對小鼠黑質多巴胺能神經元突觸后電位的影響。

方法 分別選取10周齡雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-組）及其同窩雄性野生型（WT）小鼠（WT組）的黑質組織，采用轉錄組學測序（RNA-seq）技術篩選差異表達基因（DEGs），通過KEGG通路富集分析DEGs可能參與的神經元突觸活動相關信號通路，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法對篩選出的DEGs進行驗證，并應用蛋白免疫印跡（Western blotting）方法檢測神經元突觸活動相關基因的蛋白表達情況。

結果 與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠多巴胺能神經元突觸傳遞信號通路上的23個基因水平發生了顯著性變化，其中谷氨酸促離子型受體α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸型亞基3（GluA3）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）分別調控神經元突觸后膜上的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體和N-甲基-D-天冬氨酸受體；在ghrelin-/-組小鼠黑質組織中，GluA3和GSK-3β基因表達出現明顯的下調。RT-qPCR方法檢測結果顯示，與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠黑質組織當中GluA3和GSK-3β mRNA水平明顯下調（t=2.408、2.740，P<0.05）。Western blotting方法檢測結果顯示，與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠黑質組織中GluA3蛋白的表達水平明顯上調（t=2.530，P<0.05），GSK-3β蛋白的表達明顯下調（t=3.469，P<0.05）。

結論 Ghrelin基因敲除可能通過使小鼠黑質多巴胺能神經元突觸后電位長時程增強，從而增強興奮性突觸傳遞活動，參與運動調控。

［關鍵詞］ 胃促生長素；基因敲除技術；黑質；多巴胺能神經元；長時程增強；受體，離子型谷氨酸

［中圖分類號］ R338.1;R394??? ［文獻標志碼］ A

胃饑餓素（ghrelin）是一種胃底X/A樣細胞分泌的含28個氨基酸的腦腸肽，是生長激素促分泌素受體1a（GHS-R1a）的內源性配體，可刺激人和動物生長激素的分泌[1-4]。Ghrelin在機體中發揮著重要的生理學功能，如刺激腸道蠕動、調節壓力和焦慮、防止肌肉萎縮以及改善心血管功能等[5-7]。本實驗室前期研究發現，外源性ghrelin可通過激活GHS-R1a介導的信號轉導通路，拮抗神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的小鼠黑質多巴胺能神經元損傷，發揮神經保護作用[8-11]。Ghrelin通過調節中樞神經回路，如下丘腦、腹側被蓋和海馬回路的突觸可塑性，使機體對攝食、藥物成癮、學習記憶等方面做出反應[12]。本研究擬選用雄性野生型（WT）小鼠和雄性ghrelin基因敲除小鼠，對其黑質進行轉錄組學測序（RNA-seq），篩選差異表達基因（DEGs），通過KEGG通路富集分析DEGs可能參與的神經元突觸活動相關信號通路，并驗證富集在神經元突觸活動通路上的相關基因以及蛋白在黑質中的表達情況，探討ghrelin對小鼠黑質多巴胺能神經元突觸活動的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TRIzol、RT SuperMix for qPCR、SYBR qPCR預混液購買于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購買于北京康為世紀有限公司，GSK-3β抗體購自杭州華安生物技術有限公司，GluA3抗體購自武漢愛博泰克生物公司，ECL發光液購自德國Millipore公司，UVP BioDoc-It成像系統購自美國Upland公司，SDS-PAFE垂直凝膠電泳槽、S1000 PCR儀、CFX96TM Real-Time System購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗動物與分組

10周齡的雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-組）11只及同窩雄性WT小鼠（WT組）11只均由江蘇集萃藥康生物公司提供。所有小鼠在室溫（24±1）℃，濕度為（55±5）%條件下飼養，自由進食飲水。

1.3 方法

1.3.1 黑質組織的提取及RNA-seq分析 所有ghrelin-/-組和WT組小鼠麻醉后，迅速斷頭處死，取出腦組織，置于干冰中速凍3 min，剝離雙側黑質組織并置于標記好的EP管中，－80 ℃保存。每組隨機選取6只小鼠的雙側黑質組織用于測序。測序樣本低溫運輸至北京諾禾致源生物有限公司進行RNA-seq分析。

1.3.2 DEGs篩選 采用標準方法提取WT組和ghrelin-/-組小鼠腦組織中RNA，采用Subread軟件對基因表達水平進行定量分析，篩選兩組小鼠黑質組織的DEGs，篩選條件為P<0.05。

1.3.3 KEGG通路富集分析 采用Cluster Profiler軟件對DEGs進行KEGG通路富集分析，以P<0.05為顯著富集，P值越小表示富集越顯著，選取P值較小且參與突觸電活動通路的基因，用于后續小鼠的驗證。

1.3.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測小鼠黑質區α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸型亞基3（GluA3）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）mRNA的水平 將兩組小鼠剩余的雙側黑質組織（每組各5只），取其一側的全部黑質組織置于500 μL TRI-

zol中，應用TRIzol法提取組織總RNA。以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成互補的cDNA。配置PCR反應體系，經過40個循環完成擴增。引物由北京擎科生物股份有限公司合成，引物名稱及其序列見表1。采用SYBR法定量檢測目的基因GluA3、GSK-3β以及內參基因GAPDH的表達水平，根據2－△△CT法計算目的基因的相對表達水平。

1.3.5 Western blotting法檢測小鼠黑質區GluA3、

GSK-3β蛋白的表達水平 取兩組小鼠剩余的另外一側黑質組織，加入100 μL蛋白裂解液（蛋白磷酸酶抑制劑∶蛋白酶抑制劑∶RIPA強裂解液=1∶2∶100）充分研磨以后，冰上靜置30 min，4 ℃下12 000 r/

min離心20 min。上清液移至新EP管中， BCA法測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE電泳（濃縮膠電泳參數為恒壓80 V，分離膠電泳參數為恒壓120 V）后濕轉至PVDF膜上，將膜從濕轉盒中取出，加入TBST配置的10%脫脂奶粉中，室溫孵育2 h。再分別加入GluA3（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃下于搖床上過夜。將HRP偶聯的二抗用TBST按照1∶10 000比例進行稀釋，室溫下孵育2 h。用UVP BioDoc-It成像系統以及ECL高靈敏化學發光液試劑盒顯影，并采用Image J軟件進行灰度值分析，GluA3、GSK-3β蛋白相對表達量以GluA3、GSK-3β

2 結? 果

2.1 數據質量評估

12只小鼠的測序錯誤率均低于12.5%，GC含量分布穩定，WT組與ghrelin-/-組間基因表達量的Pearson相關系數均大于0.93，說明數據的可靠性高，基因相似性高，可進行后續分析。

2.2 兩組小鼠黑質組織中DEGs分析

WT組與ghrelin-/-組間共有2 355個DEGs，其中1 655個基因在WT組呈現高表達，700個基因在ghrelin-/-組呈現高表達。

2.3 兩組小鼠黑質組織中DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，有23個DEGs富集到多巴胺能突觸信號通路上，與WT組相比，ghrelin-/-組中表達上調的基因有5個，分別為原癌基因（Fos）、G 蛋白亞基γ3（Gng3）、蛋白磷酸酶1催化亞基α（Ppp1ca）以及蛋白磷酸酶2催化亞基（Ppp2r3a、Ppp2r5e）；表達下調的基因有18個，有多巴胺受體的D3亞型（Drd3）、鈉電壓門控通道α亞基1（Scn1α）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、cAMP反應元件結合蛋白1（Creb1）、谷氨酸離子型受體AMPA型亞基（GluA3、GluA4）、NMDA受體NR2亞基（Grin2b、Grin2a）、鈣電壓門控通道亞基（Cacna1a、Cacna1d）、絲氨酸/蘇氨酸激酶3（Akt3）等。其中GluA3和GSK-3β分別調節α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異[FK（W][XCzz5.tif][FK）]唑丙酸受體（AMPAR）和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）的活性，在突觸傳遞過程中發揮著重要的生理功能。

2.4 Ghrelin基因敲除對小鼠黑質組織中GluA3、GSK-3β mRNA表達的影響

RT-qPCR結果顯示，WT組小鼠黑質組織中GluA3 mRNA水平為1.129±0.230，ghrelin-/-組為0.552±0.068，兩組比較差異具有顯著意義（t=2.408，P<0.05）；WT組小鼠黑質組織中GSK-3β mRNA的水平為1.257±0.121，ghrelin-/-組則為0.921±0.089，兩組比較差異具有顯著性（t=2.740，P<0.05）。

2.5 Ghrelin基因敲除對小鼠黑質組織中GluA3、GSK-3β蛋白表達的影響

WT組小鼠黑質組織中GluA3蛋白表達水平為0.141±0.012，ghrelin-/-組為0.290±0.058，兩組比較差異具有顯著性（t=2.530，P<0.05）；WT組小鼠的黑質組織中GSK-3β蛋白的表達水平為0.670±0.056，ghrelin-/-組為0.422±0.040，兩組比較差異具有顯著性（t=3.469，P<0.05）。見圖1。

3 討? 論

突觸后電位持續增強或減弱的現象稱為長時程增強（LTP）或長時程抑制（LTD），LTP和LTD的改變都會導致神經系統疾病的發生，如帕金森病、阿爾茨海默病、神經性疼痛、抑郁癥等[13]。在中樞神經系統中，興奮性神經傳遞主要是由谷氨酸及其離子型受體介導的，包括介導中樞神經系統快速興奮性突觸傳遞的AMPAR和維持長期突觸可塑性的NMDAR。在哺乳動物中，AMPAR主要負責大腦中的興奮性突觸傳遞，由成孔亞基GluA1～GluA4的各種組合形式組成[14-16]。在小鼠海馬CA1錐體神經元中，表達有GluA3亞基的AMPAR存在于突觸和細胞表面，基礎條件下，GluA3處于低電導狀態，當細胞內cAMP水平升高時，GluA3介導的電流會顯著增加[14]。AMPAR激活后，GluA3亞基能引起大量的Na＋和Ca2＋由胞外流到胞內，從而介導中樞神經系統的興奮性突觸傳遞。研究表明，創傷性腦損傷后小鼠海馬區GluA3的表達水平上調，該蛋白的上調能夠引起神經元損傷以及學習和記憶功能的下降甚至喪失[17]。本研究結果顯示，與WT組小鼠相比，ghrelin-/-組小鼠黑質組織中GluA3的mRNA水平降低，但是GluA3蛋白表達水平顯著升高，這種現象通常稱為mRNA和蛋白質水平之間的解偶聯。翻譯和翻譯后修飾以及mRNA結合蛋白和非編碼RNA都可導致mRNA和蛋白質表達水平的差異，另外蛋白降解的途徑被抑制也會導致這一現象[18-19]。而上調的GluA3蛋白通過引起突觸后膜Na＋和Ca2＋的內流，從而引發興奮性突觸傳遞[17，20]。

GSK-3是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化調節糖原合酶的活性，在中樞神經系統中大量表達。該酶具有兩種形式，即GSK-3α和GSK-3β，體內研究表明GSK-3α基因缺失對小鼠胚胎存活沒有顯著影響，但GSK-3β的完全敲除能夠引發小鼠胚胎死亡[21]。GSK-3β功能異常與各種疾病有關，包括阿爾茨海默病、抑郁癥、雙相情感障礙和藥物成癮等。因此，GSK-3β被認為是多種腦部疾病的主要治療靶點。該激酶被證實可參與NMDAR依賴性LTP和LTD的調節。研究表明，GSK-3抑制劑能夠阻止大鼠海馬CA1神經元LTD的誘導，且可挽救因GSK-3β過表達而引起的LTP損傷。因此GSK-3β是誘導大鼠海馬CA1神經元LTD所必需的，在LTD期間被激活[22]；大鼠海馬中的LTP被誘導以后，GSK-3β受到抑制[23-24]。在本研究中，與WT組小鼠相比，ghrelin-/-組小鼠黑質中GSK-3β mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，這進一步提示ghrelin敲除后，可能會引起小鼠NMDAR依賴性LTP增加。

綜上所述，在ghrelin基因敲除小鼠中，中腦黑質區GluA3蛋白表達水平增加，GSK-3β蛋白表達水平降低，這可能會引起多巴胺能神經元AMPAR以及NMDAR介導的LTP的發生，從而增強興奮性突觸傳遞活動。本研究結果為ghrelin在神經元突觸調控中的研究提供了一定的實驗依據。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫學倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2023135）。所有實驗過程均遵照《青島大學實驗動物操作標準》的條例進行。

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