姜黃素對帕金森病模型小鼠的神經保護作用及其機制

王子怡 毛華 金婷婷 張香凝 韓帥 梁永新

［摘要］ 目的

探究姜黃素對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的帕金森病（Parkinson disease，PD）模型小鼠的神經保護作用及其機制。

方法 將72只雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為Control組（A組）、MPTP組（B組）和MPTP＋姜黃素組（C組）。實驗前5 d，B、C組小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A組小鼠腹腔注射等量生理鹽水；第6天始，C組小鼠每天腹腔注射姜黃素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B組小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，連續7 d。給藥結束后，采用行為學實驗評估各組小鼠的運動、學習和記憶力功能。實驗第15天，取各組小鼠黑質區，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，蛋白印跡法檢測CD86和NF-κB的相對含量，熒光免疫組織化學染色檢測TH陽性神經元的數量。

結果 與B組相比，A、C組小鼠的下降時間明顯減少，脫落潛伏期和交替百分比明顯增加（F=17.29～19.28，P<0.05），黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯減少（F=31.73～80.97，P<0.05），黑質中CD86、NF-κB蛋白的表達明顯減少（F=24.93、55.61，P<0.05），黑質中TH陽性神經元的數量顯著增加（F=47.64，P<0.05）。

結論 姜黃素可有效改善PD模型小鼠的行為障礙，發揮神經保護作用，其機制可能與抑制NF-κB信號通路，致小膠質細胞活化抑制、炎性反應發生降低、多巴胺能神經元退化減輕有關。

［關鍵詞］ 帕金森病；疾病模型，動物；姜黃素；小神經膠質細胞；NF-κB；神經炎癥性疾病；神經保護

［中圖分類號］ R742.5??? ［文獻標志碼］ A

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一種常見的神經變性疾病。研究發現，PD患者黑質中存在神經炎癥，當小膠質細胞過多分泌炎性因子時，易對多巴胺能神經元產生毒性，并最終致其發生進行性死亡[1-2]。因此通過干預降低黑質區促炎因子的水平，減緩PD患者神經炎癥進展，是目前比較有效治療措施之一。目前臨床主要使用的一線藥物有左旋多巴和多巴胺受體激動劑，但效果并不滿意，長期服用患者可產生耐藥性，甚至出現異動癥、妄想和焦慮等不良反應[3]。姜黃素提取于姜黃的根莖，具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等作用，而且毒副作用小[4-6]。本研究通過腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）構建PD模型小鼠，觀察姜黃素對小鼠行為學習和記憶功能的影響，并進一步探究其作用機制，為PD患者的臨床治療提供實驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

姜黃素購于美國Sigma公司，小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒均購于上海江萊生物有限公司，MPTP購于美國GLPBIO公司，兔抗CD86抗體、兔抗p-NF-κB p65抗體和GAPDH均購買于英國Abcam公司，抗酪氨酸羥化酶抗體購于美國CST公司。轉棒測試儀和Y迷宮全自動測試儀購于美國Med Associates公司。

1.2 動物分組與處理

健康成年雄性C57BL/6J小鼠72只購自斯貝福（北京）生物有限公司（No.11032422010540776-5），隨機分為Control組（A組）、MPTP組（B組）和MPTP＋姜黃素組（C組），每組24只。實驗前5 d，B、C組小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A組小鼠腹腔注射等量生理鹽水；第6天始，C組小鼠腹腔注射姜黃素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B組小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，連續7 d[7]。

1.3 行為學實驗評估各組小鼠的運動、學習和記憶功能

1.3.1 爬桿實驗[8] 實驗第13天時，分別從各組小鼠中隨機選取8只，置于表面粗糙木桿頂部（直徑8 mm、高55 cm），測量小鼠自頂部至前爪到達地面的時間（下降時間）。每只小鼠隔30 min測量一次，連續測試3次，結果取平均值。每次實驗結束后均將小鼠放回。

1.3.2 轉棒實驗[9] 爬桿實驗結束后，間隔6 h，分別從各組中再隨機選取8只小鼠進行轉棒實驗。將各組小鼠放置于轉棒測試儀的轉棒上，從4 r/min到40 r/min勻速調節轉棒的速度，記錄脫落潛伏期（小鼠從轉棒上掉落的時間）。每只小鼠測試3次，每次測試的間隔時間大于30 min，結果取均值。每次實驗結束后均將小鼠放回。

1.3.3 Y迷宮實驗[8] 實驗第14天時，分別從各組中再隨機選取8只小鼠進行Y迷宮實驗。將各組小鼠放置在Y迷宮全自動測試儀的一臂末端，并允許其在每個臂上自由爬行。記錄小鼠8 min內入臂次數（當小鼠的后爪完全進入其余任何手臂時，認為完成一次入臂過程）和自發交替次數（小鼠依次進入不同臂認為完成一次交替）。交替百分比=[（自發交替次數）/（入臂次數－2）]×100%。

1.4 ELISA法檢測各組小鼠黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

實驗第15天時，將每組24只小鼠隨機分為3份，每份8只。隨機取其中的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，剝離出小鼠腦組織，用濃度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）沖洗后，分離出黑質并測量其質量后，按照1∶9比例（1 g腦組織對應0.01 mol/L的PBS 9 mL）加入PBS溶液，置于冰上充分研磨、離心后，收集上清液。按照ELISA試劑盒的說明檢測黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.5 蛋白印跡法檢測各組小鼠黑質中CD86以及NF-κB的相對含量

再隨機取其中的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，剝離出腦組織，用濃度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）沖洗后，分離出黑質并測量其質量后，取20 mg的黑質組織依次加入400 μL的RIPA裂解液、4 μL 蛋白酶抑制劑和4 μL colktail后，置于冰上充分研磨、離心后，收集上清液。提取黑質的蛋白樣本，樣本經過電泳、轉膜、封閉等操作后，分別與一抗抗CD86（1∶1 000）、抗p-NF-κB p65（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）在4 ℃下孵育過夜。TBST沖洗3次后，將膜分別與相應的二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。TBST沖洗3次后顯影，以Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 熒光免疫組織化學染色檢測各組小鼠黑質中TH陽性神經元數量

剩余的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，將腦組織經過剝離、固定、脫水等操作后。參考小鼠腦圖譜[10]，將其沿冠狀面以10 μm厚進行切片。選擇其中含有黑質組織的切片，經過沖洗、通透以及封閉等操作后。用抗酪氨酸羥化酶（TH）抗體（1∶200）孵育切片并于4 ℃下過夜。第2天用0.01 mol/L的PBS沖洗切片3次，共計15 min，以熒光二抗（綠色，1∶100）在室溫下孵育1 h。用BX53熒光顯微鏡和DP50數碼相機觀察并拍攝黑質中TH陽性神經元數目。

2 結? 果

2.1 姜黃素對各組小鼠運動、學習以及記憶功能的影響

三組小鼠的下降時間、脫離潛伏期、交替百分比比較差異有顯著性（F=17.29～19.28，P<0.05），各組間兩兩比較，差異也均具有顯著意義（P<0.05）。見表1。

2.2 姜黃素對各組小鼠黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

三組小鼠黑質中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較差異均有顯著性（F=31.73～80.97，P<0.05），各組間兩兩比較，差異也均具有顯著意義（P<0.05）。見表2。

2.3 姜黃素對各組小鼠黑質中CD86和NF-κB表達的影響

蛋白印跡法檢測結果顯示，A～C組小鼠黑質中CD86蛋白的相對表達量分別為1.00±0.00、1.78±0.33、1.37±0.17，p-NF-κB p65蛋白的相對表達量分別為1.00±0.00、1.44±0.12、1.22±0.13。各組間上述指標比較差異均具有統計學意義（F=24.93、55.61，P<0.05），各組間兩兩比較，上述兩個指標差異也均具有顯著性（P<0.05）。見圖1。

2.4 姜黃素對各組小鼠黑質中TH陽性神經元數量的影響

A～C組小鼠黑質中TH陽性神經元數目分別為（60.62±10.29）、（25.25±4.83）、（39.00±5.55）個，各組間比較差異有顯著性（F=47.64，P<0.05），各組間兩兩比較，差異均具有顯著意義（P<0.05）。見圖2。

3 討? 論

PD是一種多因素導致的以黑質中多巴胺能神經元進行性死亡為特征的疾病。目前的治療方案不能有效阻止或減緩PD的神經退行性病變[11]。因此，需要進一步探索PD發生發展的相關機制，并找尋有效的治療藥物。大量研究表明，神經炎癥參與PD的病理生理過程。在PD患者的大腦中，均發現小膠質細胞的活化以及促炎因子的過度表達[12-14]。

姜黃素具有顯著的抗炎、抗氧化以及抗癌的特性[15-17]。最近的一些研究指出，姜黃素在PD、阿爾茲海默癥和多發性硬化等神經系統疾病中，具有神經保護作用[18-20]。另有研究顯示，姜黃素可以通過抑制NLRP3炎癥小體的活化，以及緩解Drp1介導的線粒體功能障礙，發揮對PD患者的神經保護作用[21]。本研究采用MPTP構建經典PD模型小鼠，通過爬桿實驗、轉棒實驗和Y迷宮實驗，對小鼠的運動、學習以及記憶功能進行測試，結果表明，與MPTP組小鼠相比，經姜黃素治療的PD模型小鼠，下降時間縮短、脫離潛伏期增加和交替百分比提高。提示姜黃素可有效改善PD模型小鼠的運動、學習和記憶功能障礙。雖然目前已經有大量研究證實，姜黃素具有神經保護作用，然而姜黃素治療PD的機制尚不清楚。

在本研究中，首先鑒定了姜黃素對促炎因子的影響，再進一步研究其對MPTP誘導的小鼠黑質中小膠質細胞的作用。ELISA法檢測結果顯示姜黃素能夠減少黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6的過度釋放，驗證了姜黃素對神經炎癥的調控作用。蛋白印跡法結果表明，姜黃素可以抑制MPTP誘導的小鼠黑質中小膠質細胞表面標記物CD86的表達，表明姜黃素可以抑制小膠質細胞的活化。為了進一步探討姜黃素調控小膠質細胞活性的分子機制，本研究還采用蛋白印跡法檢測了小鼠黑質中NF-κB通路相關蛋白，發現姜黃素抑制了MPTP誘導的小鼠黑質中NF-κB通路相關蛋白的表達。以上結果表明姜黃素抑制小膠質細胞，減輕神經炎癥可能通過調控細胞中NF-κB信號通路蛋白的表達來實現的。

研究表明，小膠質細胞可以促進神經炎癥的發生發展。在黑質中可使多巴胺能神經元發生退化，因此抑制黑質中小膠質細胞介導的神經炎癥，也許可以作為一種治療PD的方案[22]。小膠質細胞長期持續活化，會分泌如TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子。研究發現PD患者血清、黑質和腦脊液中的炎性因子濃度較正常人群明顯升高。TNF-α是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質。研究發現TNF-α主要由小膠質細胞產生，也能激活小膠質細胞產生IL-6等炎癥因子，誘導黑質中多巴胺能神經元的漸進性喪失。IL介導了神經炎癥的惡性循環過程，對炎癥起主導作用。當過度激活IL-1β和IL-6時，就會引起膠質細胞活化并對神經元產生損傷[23]。此外，NF-κB是炎性細胞因子的關鍵轉錄因子。研究表明，NF-κB這一經典信號轉導通路已被證明可以促進小膠質細胞介導的神經炎癥，抑制NF-κB的活化可以改善小鼠的運動遲緩癥狀[24]。NF-κB的激活可增加小膠質細胞對IL-6和IL-1β等促炎因子的釋放，并且在6-OHDA介導的PD動物模型中，NF-κB信號通路的活化參與黑質中多巴胺能神經元的死亡過程[25]。

TH代表黑質-紋狀體通道的初始階段。此通路為大腦中比較重要的多巴胺傳遞途徑，因此TH在多巴胺合成中發揮不可或缺的作用。TH作為多巴胺能神經元標志物，其水平與多巴胺能神經元的活性有關。黑質中TH陽性神經元的表達隨PD的發展進行性減少，也是PD進展的標志[26]。本研究中姜黃素治療可顯著抑制MPTP誘導的小鼠黑質中TH陽性神經元的減少。這些結果證實姜黃素對PD具有顯著的神經保護作用。

綜上所述，姜黃素可有效改善PD模型小鼠的運動、學習、記憶障礙，降低黑質中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制黑質中小膠質細胞活化，減緩黑質中多巴胺能神經元退化，從而發揮神經保護作用，其機制或與抑制NF-κB信號通路相關。本研究為姜黃素應用于PD治療提供了理論和實驗支持。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2023116）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》進行。

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