稽留流產(chǎn)患者絨毛組織miR-19b與PTEN的表達及臨床意義

徐丹 謝君 劉佳 龔潔 彭宇婷 唐芳 鄒順 薛青

摘要：目的? 檢測稽留流產(chǎn)患者絨毛組織miR-19b與PTEN的表達水平并分析其臨床意義。方法? 選取2022年1月-5月在本院診斷治療的稽留流產(chǎn)患者30例作為試驗組，同期選取30例正常早孕并要求終止妊娠婦女為對照組，比較兩組絨毛組織中miR-19b、PTEN的表達水平及相關性。結果? 試驗組miR-19b相對表達量（1.792±0.905）高于對照組（0.538±0.443），PTEN mRNA相對表達量（1.909±1.099）低于對照組（6.316±2.597），PTEN蛋白相對表達量（0.036±0.016）低于對照組（0.084±0.013）（P<0.05）。相關性分析顯示，對照組絨毛組織中miR-19b與PTEN的表達呈負相關（r=-0.584，P=0.001）。結論? 稽留流產(chǎn)患者絨毛組織miR-19b表達升高，可能通過調控PTEN影響滋養(yǎng)細胞的增殖、凋亡及侵襲。

關鍵詞：稽留流產(chǎn)；絨毛組織；miR-19b；PTEN

中圖分類號：R714.21? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.12.018

文章編號：1006-1959（2024）12-0085-04

Expression and Clinical Significance of miR-19b and PTEN in Villus Tissue of Patients

with Missed Abortion

Abstract：Objective? To detect the expression levels of miR-19 b and PTEN in villus tissues of patients with missed abortion and analyze their clinical significance.Methods? A total of 30 patients with missed abortion diagnosed and treated in our hospital from January to May 2022 were selected as the experimental group， and 30 normal early pregnant women who required termination of pregnancy were selected as the control group. The expression levels and correlation of miR-19b and PTEN in villus tissues of the two groups were compared.Results? The relative expression of miR-19b was （1.792±0.905） in the experimental group， which was higher than（0.538±0.443）in the control group; the relative expression of PTEN mRNA was （1.909±1.099） in the experimental group， which was lower than （6.316±2.597） in the control group; and the relative expression of PTEN protein was （0.036±0.016） in the experimental group， which was lower than （0.084±0.013） in the control group（P<0.05）. Correlation analysis showed that there was a negative correlation between the expression of miR-19b and PTEN in villus tissues of control group （r=-0.584， P=0.001）.Conclusion? The expression of miR-19b in villus tissue of patients with missed abortion is increased， which may affect the proliferation， apoptosis and invasion of trophoblast cells by regulating PTEN.

Key words：Missed abortion;Villous tissue;miR-19b;PTEN

稽留流產(chǎn)是一種特殊類型的自然流產(chǎn)，發(fā)生在妊娠12周之前為早期自然流產(chǎn)。該病發(fā)生的原因眾多，包括染色體異常、生殖道畸形、內分泌失調、感染因素、血栓前狀態(tài)、自身免疫因素等，但發(fā)病者中仍有半數(shù)以上原因未明。微小RNA（microRNA， miRNA）是由21～24個核苷酸組成的內源性非編碼小RNA，與mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結合，通過誘導目標mRNA的降解介導轉錄調節(jié)[1]。研究表明[2，3]，miRNA參與多種細胞生物學活動，如細胞分化、增殖、遷徙、侵襲和凋亡，其異常表達與流產(chǎn)密切相關。已有研究表明[4]，不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者胎盤組織中可檢測到多種與正常患者差異表達的miRNA，其中一些miRNA已被證明能夠通過參與靶基因的調控來影響URSA的發(fā)生及發(fā)展。目前研究miRNA在復發(fā)性流產(chǎn)中的作用主要包括促進滋養(yǎng)細胞凋亡，抑制增殖；改變免疫因素；通過單核苷酸多肽性（SNPs）或單倍體以及調控血管內皮，增加流產(chǎn)的易感性，促進機體對胚胎的吸收，進而參與流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。PTEN是一種抑癌基因，參與調節(jié)多種細胞的凋亡，PTEN可通過PI3K/AKT信號通過在細胞周期、生長、遷移和凋亡中發(fā)揮重要作用[5]。既往的報道顯示，PTEN基因在各種腫瘤組織中表達缺失或突變[6]，并且在正常胎盤組織、子宮內膜和蛻膜中也有表達[7]。一些研究表明[8]，PTEN在胚胎發(fā)育過程中可能是必不可少的，改變PTEN的表達可能與自然流產(chǎn)有關。本研究通過分析稽留流產(chǎn)患者絨毛組織miR-19b與PTEN的表達及其相關性，探討miR-19b可能通過PTEN參與滋養(yǎng)細胞增殖、凋亡過程，探尋自然流產(chǎn)的病因機制，旨在為自然流產(chǎn)的治療提供更多思路。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2022年1月-5月在岳陽市人民醫(yī)院接受治療的稽留流產(chǎn)患者30例納入試驗組，符合早期妊娠稽留流產(chǎn)診斷標準，患者年齡22～35歲，平均年齡（28.53±3.51）歲；停經(jīng)6～11周，平均停經(jīng)時間（8.00±1.20）周；孕次1～5次，平均孕次（2.23±1.19）次；產(chǎn)次0～3次，平均產(chǎn)次（0.57±0.77）次；體重指數(shù)（BMI）18.4～26.8kg/m2，平均BMI（22.06±2.56）kg/m2。另同期選取30例正常早孕并要求終止妊娠婦女為對照組，對照組所有對象經(jīng)臨床檢查顯示為正常宮內早孕，且宮內胚胎發(fā)育正常。年齡22～34歲，平均年齡（28.67±3.28）歲；停經(jīng)6～11周，平均停經(jīng)時間（8.07±1.17）周；孕次1～6次，平均孕次（2.37±1.47）次；產(chǎn)次0～2次，平均產(chǎn)次（0.53±0.63）次；BMI 17.6～26.4kg/m2，平均BMI（21.39±2.52）kg/m2。兩組年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次及BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可比較。兩組研究對象在標本獲取前均無激素類藥物服用史，無染色體異常，無生殖道畸形，無生殖器感染性疾病，無自身免疫性疾病，無內分泌異常，無內外科合并癥，無有害物質接觸史，無吸煙、酗酒、吸毒等不良生活習慣。本研究并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2人絨毛組織的收集及處理? 所有患者均行米非司酮+米索前列醇藥物流產(chǎn)，妊娠組織物排出后，采集絨毛組織標本，在生理鹽水中反復漂洗至無血色，每個樣本被分為3管，2管在液氮中保存24 h 后移至-80 ℃冰箱保存用于實時熒光定量PCR（qPCR）實驗，1管在4%多聚甲醛中固定24 h后實施常規(guī)脫水處理，石蠟包埋切片。

1.3實驗方法

1.3.1 qPCR檢測? miR-19b和PTEN表達? Trizol法（美國Thermo）提取絨毛組織中總RNA后測RNA的濃度及純度，按照中國北京康為世紀公司試劑盒（CW2569，CW2141）說明進行逆轉錄反應，以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.3.2免疫組織化學法（Immunohistochemical， IHC）檢測PTEN的表達? 將石蠟標本切片后二甲苯脫蠟、100%到75%乙醇梯度水化，于高壓枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中進行抗原修復。用1%高碘酸滅活內源性酶，滴加適當稀釋的一抗（PTEN），4 ℃過夜，再滴加50～100 μl抗-兔-IgG抗體-HRP多聚體37 ℃孵育30 min。再使用DAB溶液顯色，經(jīng)過蘇木精復染、脫水、透明和封片等處理后顯微鏡下觀察PTEN的染色情況。結果判定：細胞質或細胞核中有棕黃色顆粒沉著為PTEN蛋白陽性表達。高倍鏡下按隨機數(shù)字表法選取5個400倍視野，采用Image-Pro plus 6.0分析平均光密度（average optical density， AOD）值。

1.4統(tǒng)計學方法? 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson相關分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組絨毛組織內miR-19b的表達比較? qPCR檢測結果顯示，試驗組絨毛組織miR-19b相對表達量為（1.792±0.905），高于對照組的（0.538±0.443），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.816，P=0.000），見圖1。

2.2兩組絨毛組織內PTEN mRNA的表達比較? qPCR檢測結果顯示，試驗組絨毛組織PTEN mRNA相對表達量為（1.909±1.099），低于對照組的（6.316±2.597），差異有統(tǒng)計學意義（t=-8.559，P=0.000），見圖2。

2.3兩組絨毛組織內PTEN蛋白的表達比較? 免疫組化顯示，PTEN在稽留流產(chǎn)滋養(yǎng)細胞胞質中少量表達，呈淺棕黃色，絨毛間質少許染色，PTEN在正常妊娠滋養(yǎng)細胞胞質和細胞核及絨毛間質中均有表達，表達量較多，呈深棕色，見圖3。平均光密度值顯示，試驗組絨毛組織PTEN 蛋白相對表達量（0.036±0.016）低于對照組絨毛組織（0.084±0.013），差異有統(tǒng)計學意義（t=-7.156，P=0.000），見圖4。

2.4兩組絨毛組織中miR-19b與PTEN表達的相關性分析? 將組內絨毛組織中miR-19b與PTEN表達進行Pearson相關性分析，顯示正常妊娠組中miR-19b與PTEN的表達呈顯著負相關性（r=-0.584，P=0.001），見圖5。

3討論

近年來，稽留流產(chǎn)的發(fā)病率呈上升趨勢，極大的影響女性身心健康。因此，尋找確切的病因以及有效的診斷標志物，對于稽留流產(chǎn)的診斷以及治療具有非常重要的臨床意義。目前稽留流產(chǎn)的發(fā)病機制尚不清楚，其研究多集中于滋養(yǎng)細胞侵襲力下降及過度凋亡、胎盤血管生成障礙、母胎界面免疫耐受平衡失調，以及基因多態(tài)性改變等。

已有研究證實[9-11]，miRNAs調節(jié)許多生化途徑，如細胞增殖、分化和凋亡，miRNAs表達失調與許多疾病有關，包括不孕癥、子宮內膜異位癥、先兆子癇、腫瘤發(fā)生以及神經(jīng)、心血管和代謝疾病。自然流產(chǎn)胎盤絨毛組織中存在miRNA的異常表達[4]，這些異常表達通過細胞增殖、凋亡及免疫調節(jié)參與了流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miRNA-23-3p、miRNA-29a-3p可抑制滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo侵襲性[3]，miRNA-149-3p可能通過上調MAPK信號通路和Notch信號通路影響細胞的增殖、分化和凋亡，干擾胚胎發(fā)育、血管生成和胎盤血管等生理變化[12]。Liu HN等[13]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)與正常女性相比，復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中miRNA-93顯著升高，進一步實驗證明上調miRNA-93可通過靶向調節(jié)因子BCL2L2，抑制滋養(yǎng)細胞增殖、遷徙以及侵襲。Ding J等[14]實驗發(fā)現(xiàn)在復發(fā)性流產(chǎn)患者中miRNA-27a-3p通過負性調控USP25表達，抑制滋養(yǎng)細胞上皮間充質轉化、侵襲和遷移能力，參與復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。本研究顯示，試驗組絨毛組織miR-19b表達升高，而miR-19b有報道在多種腫瘤細胞中高表達[15]，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲與凋亡，妊娠前3個月人類滋養(yǎng)細胞和腫瘤細胞具有相似的內在侵襲特性。因此，推測miR-19b可能參與了滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲和凋亡過程，進而參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。

PTEN參與了許多細胞增殖和凋亡過程，許多miRNAs與PTEN有功能性相互作用，并抑制其表達。在卵巢癌中，miR-19b的過表達顯著降低了PTEN的表達[16]。miR-19b可以靶向PTEN來調節(jié)宮頸癌細胞的增殖、侵襲和自噬[17]。miR-19b通過靶向PTEN抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡，促進增殖[18]。除了腫瘤相關疾病外，miR-19b與PTEN在其他疾病中也存在相互作用。miR-19b可通過下調PTEN激活AKT信號通路，保護心肌細胞凋亡[19]。研究表明絨毛滋養(yǎng)層的PTEN表達隨著妊娠的進展而減少。本研究顯示試驗組絨毛組織PTEN mRNA及蛋白表達下降，證明PTEN參與了滋養(yǎng)細胞的異常作用。先前在動物實驗中顯示，PTEN基因缺失的小鼠表現(xiàn)出異常的外胚層和中胚層，以及有缺陷的胎盤形成[20]。此外，異常的PTEN表達可能通過與其miRNA的互補序列結合而參與miRNA的調節(jié)。本研究顯示miR-19b與PTEN呈負相關，因此推測miRNA可能通過靶向PTEN調節(jié)滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲和凋亡，從而參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織miR-19b過表達，PTEN低表達，呈負相關，miR-19b可能通過PTEN參與了滋養(yǎng)細胞增殖、凋亡過程。

參考文獻：

[1]Lu TX，Rothenberg ME.MicroRNA[J].J Allergy Clin Immunol，2018，141（4）：1202-1207.

[2]Dong F，Zhang Y，Xia F，et al.Genome-wide miRNA profiling of villus and decidua of recurrent spontaneous abortion patients[J].Reproduction，2014，148（1）：33-41.

[3]Yang Q，Gu WW，Gu Y，et al.Association of the peripheral blood levels of circulating microRNAs with both recurrent miscarriage and the outcomes of embryo transfer in an in vitro fertilization process[J].J Transl Med，2018，16（1）：186.

[4]Qin W，Tang Y，Yang N，et al.Potential role of circulating microRNAs as a biomarker for unexplained recurrent spontaneous abortion[J].Fertil Steril，2016，105（5）：1247-1254.e3.

[5]Hu M，Zhu S，Xiong S，et al.MicroRNAs and the PTEN/PI3K/Akt pathway in gastric cancer （Review）[J].Oncol Rep，2019，41（3）：1439-1454.

[6]?lvarez-Garcia V，Tawil Y，Wise HM，et al.Mechanisms of PTEN loss in cancer： It's all about diversity[J].Semin Cancer Biol，2019，59：66-79.

[7]Chen H，Ye D，Xie X，et al.PTEN promoter methylation and protein expression in normal early placentas and hydatidiform moles[J].J Soc Gynecol Investig，2005，12（3）：214-217.

[8]Tokyol C，Aktepe F，Hüsniye Dilek F，et al.Comparison of placental PTEN and beta1 integrin Expression in early spontaneous abortion， early and late normal pregnancy[J].Ups J Med Sci，2008，113（2）：235-242.

[9]Raja MHR，F(xiàn)arooqui N，Zuberi N，et al.Endometriosis， infertility and MicroRNA's： A review[J].J Gynecol Obstet Hum Reprod，2021，50（9）：102157.

[10]Lv Y，Lu C，Ji X，et al.Roles of microRNAs in preeclampsia[J].J Cell Physiol，2019，234（2）：1052-1061.

[11]Ali Syeda Z，Langden SSS，Munkhzul C，et al.Regulatory Mechanism of MicroRNA Expression in Cancer[J].Int J Mol Sci，2020，21（5）：1723.

[12]Tang L，Gao C，Gao L，et al.Expression profile of micro-RNAs and functional annotation analysis of their targets in human chorionic villi from early recurrent miscarriage[J].Gene，2016，576（1 Pt 2）：366-371.

[13]Liu HN，Tang XM，Wang XQ，et al.MiR-93 Inhibits Trophoblast Cell Proliferation and Promotes Cell Apoptosis by Targeting BCL2L2 in Recurrent Spontaneous Abortion[J].Reprod Sci，2020，27（1）：152-162.

[14]Ding J，Cheng Y，Zhang Y，et al.The miR-27a-3p/USP25 axis participates in the pathogenesis of recurrent miscarriage by inhibiting trophoblast migration and invasion[J].J Cell Physiol，2019，234（11）：19951-19963.

[15]Hu X，Liu H，Li C.MiRNA-19b-3p downregulates the endothelin B receptor in gastric cancer cells to prevent angiogenesis and proliferation[J].Acta Biochim Pol，2023，70（2）：363-370.

[16]Liu DT，Yao HR，Li YY，et al.MicroRNA-19b promotes the migration and invasion of ovarian cancer cells by inhibiting the PTEN/AKT signaling pathway[J].Oncol Lett，2018，16（1）：559-565.

[17]Wang W，Liu L，Tian Y.miR-19-3p Targets PTEN to Regulate Cervical Cancer Cell Proliferation，Invasion，and Autophagy[J].Genet Res （Camb），2023，2023：4784500.

[18]Yuan J，Su Z，Gu W，et al.MiR-19b and miR-20a suppress apoptosis， promote proliferation and induce tumorigenicity of multiple myeloma cells by targeting PTEN[J].Cancer Biomark，2019，24（3）：279-289.

[19]Xu J，Tang Y，Bei Y，et al.miR-19b attenuates H2O2-induced apoptosis in rat H9C2 cardiomyocytes via targeting PTEN[J].Oncotarget，2016，7（10）：10870-10878.

[20]Di Cristofano A，Pesce B，Cordon-Cardo C，et al.Pten is essential for embryonic development and tumour suppression[J].Nat Genet，1998，19（4）：348-355.