蹄葉橐吾萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌消炎作用研究

張春艷 郭明飛 烏仁高娃 吳麗娟 烏吉木 胥向紅 劉萬(wàn)全

摘要：目的? 研究蹄葉橐吾醇化乙酸乙酯萃取物（EEOLF）對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌消炎作用。方法? 測(cè)定EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）；取正常培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RAW264.7為空白組，采用金黃色葡萄球菌作用于RAW264.7細(xì)胞建立體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停Ｐ徒M）。細(xì)胞活/死染色觀察EEOLF（劑量為5 μg/ml）作用于模型組后細(xì)胞的損傷情況，ELISA法測(cè)定EEOLF（劑量為1.25、2.5 及5 μg/ml）作用于模型組后IL-1β及TNF-α的釋放量。結(jié)果? EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)有抑制作用，最小抑菌濃度為1300 μg/ml；當(dāng)金黃色葡萄球菌作用于RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)IL-1β及TNF-α的分泌量增加（P<0.05）。對(duì)金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞給藥后，藥物濃度為1.25 μg/ml和2.5 μg/ml時(shí)，炎癥因子的分泌量沒(méi)有明顯減少（P>0.05），當(dāng)藥物濃度為5 μg/ml時(shí)，炎性因子L-1β及TNF-α的分泌量下降（P<0.05），同時(shí)細(xì)胞損傷情況改善。結(jié)論? EEOLF能夠抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，也能緩解金黃色葡萄球菌引起的炎癥反應(yīng)，其抗菌消炎作用值得深入研究。

關(guān)鍵詞：蹄葉橐吾醇化乙酸乙酯萃取物；金黃色葡萄球菌；抗菌消炎

中圖分類號(hào)：R259? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.12.019

文章編號(hào)：1006-1959（2024）12-0089-05

Study on the Antibacterial and Anti-inflammatory Effects of Ligulariafischeri Extract

on Staphylococcus Aureus

Abstract：Objective? To study the antibacterial and anti-inflammatory effects of ethanolic extract of ligulariafischeri （EEOLF） on Staphylococcus aureus.Methods? The minimum inhibitory concentration （MIC） of EEOLF against Staphylococcus aureus was determined. Normal cultured macrophages RAW264.7 were taken as blank group， and Staphylococcus aureus was applied to RAW264.7 cells to establish cell inflammation model group in vitro （model group）. The cell damage after EEOLF （5 μg/ml）? in the model group was detected by living/dead staining， and the release of IL-1β and TNF-αafter EEOLF （1.25， 2.5 and 5 μg/ml） in the model group was determined by ELISA.Results? EEOLF could inhibit the growth of Staphylococcus aureus， and the MIC was 1300 μg/ml. When Staphylococcus aureus acted on RAW264.7 cells， the cells were severely damaged， and the secretion of IL-1β and TNF-α was increased （P<0.05）. When the drug concentration was 1.25 μg/ml and 2.5 μg/ml， the secretion of inflammatory factors was not significantly reduced （P>0.05）. When the drug concentration was 5 μg/ml， the secretion of inflammatory factors L-1β and TNF-α was decreased （P<0.05）， and the cell damage was improved.Conclusion? EEOLF can inhibit the growth of Staphylococcus aureus and alleviate the inflammatory response caused by Staphylococcus aureus， and its antibacterial and anti-inflammatory effects are worthy for further study.

Key words：Ligulariafischerialcoholized ethyl acetate extract;Staphylococcus aureus;Antibacterial and anti-inflammatory

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起皮膚和軟組織感染的主要病原體之一[1]，若感染控制不佳可能造成大面積感染或菌血癥等不良后果。抗生素是治療金黃色葡萄球菌感染的首選藥物。但是隨著抗生素的應(yīng)用，金黃色葡萄球菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus， MRSA）出現(xiàn)并在全球范圍內(nèi)散播[2]，是導(dǎo)致乳腺炎以及醫(yī)院和社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病率、死亡率居高不下的主要原因，嚴(yán)重危害著社會(huì)公共衛(wèi)生[3]。目前，MRSA感染引起的相關(guān)疾病尚無(wú)最佳治療方案。如何治療耐藥性逐漸增高的金黃色葡萄球菌引起的感染是目前研究的熱點(diǎn)之一。中藥對(duì)細(xì)菌感染的治療作用被認(rèn)為類似于抗生素的作用[4-6]，從中草藥中尋找新型藥物用來(lái)抵抗或治療耐藥菌株引起的感染已成為解決細(xì)菌耐藥性的有效途徑。蹄葉橐吾（Ligulariafischeri， LF）為菊科（compasitae）蹄葉橐吾屬（Ligularia）多年生草本植物，多生長(zhǎng)于海拔1400～3300米的河流、山川及森林[7]。LF的根、莖、葉及全草均有很強(qiáng)的藥用價(jià)值。其根和根莖可用于于治療慢性支氣管炎、咽喉炎癥、肺癰咳血等，已收入吉林省藥材標(biāo)準(zhǔn)，全草用于治療丹毒性炎癥和關(guān)節(jié)膿腫，地上部分外敷用于捻挫傷，水煎服可治療痔疾[8]。LF葉片提取物在抗炎，抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價(jià)值[9-11]。根據(jù)中國(guó)《中藥材記錄》記載，LF除了上述作用外還有抗菌作用[12]，但關(guān)于LF抗菌作用的研究較少，EEOLF是否對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有抑制作用還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。因此，本研究初步探究EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)的作用，并建立金黃色葡萄球菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，探討EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌感染的功效，為解決金黃色葡萄球菌的臨床耐藥性問(wèn)題提供新思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑? 細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。菌種金黃色葡萄球菌（ATCC29213）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周銳教授饋贈(zèng)。藥品LF為齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院李濤教授在延邊市安圖縣采摘并饋贈(zèng)。試劑包括：FBS胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），乙二胺四乙酸（EDTA，美國(guó)Sigma公司），四甲基二乙胺（TEMED，美國(guó)Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基干粉（美國(guó)Gibco公司），L-1β及TNF-α ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司），活死染色試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2儀器? DY5000X倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司），BIO-RAD 680全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司），超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），VS-1300L-U凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3方法

1.3.1 EEOLF制備? 干燥的LF葉片8.5 kg，粉碎后，室溫下，每次用無(wú)水乙醇15 L浸泡3 d后過(guò)濾，重復(fù)3次，合并醇提液，減壓濃縮至小體積（約1.0 L），加水1.5 L，用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯1.5 L，合并乙酸乙酯層濃縮至恒重，得率為0.61%，減壓濃縮，真空干燥，每克相當(dāng)于10 g生藥。使用時(shí)DMSO溶解后用PBS稀釋，濾過(guò)除菌，并分裝儲(chǔ)存。

1.3.2抗菌藥物最低抑菌濃度試驗(yàn)（MIC）? 將EEOLF制成10400 μg/ml的原液，增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金黃色葡萄球菌液用生理鹽水或LB肉湯培養(yǎng)基校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1×108～2×108 CFU/ml。取無(wú)菌試管6支，排成一排，除第1管加入1.6 ml LB肉湯外，其余每管加入LB肉湯1 ml，依次倍比稀釋，第6管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管藥物濃度依次為5200、2600、1300、650、325、0? μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 ml，使每管最終菌液濃度約為5×105 CFU/ml。將接種好的稀釋管塞好塞子，置37 ℃搖床培養(yǎng)16～20 h后用分光光度計(jì)測(cè)定OD600。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理? 取RAW264.7巨噬細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2 d、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)1×PBS清洗2次，每次3 ml，用刮刀刮取細(xì)胞，并用細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個(gè)/ml，接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待巨噬細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且形成致密融合單層后分組處理。先前研究采用噻唑藍(lán)比色法（MTT法）測(cè)得EEOLF作用于密度為5×104個(gè)/ml的RAW264.7細(xì)胞24 h后，藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度為5 μg/ml，故本實(shí)驗(yàn)采用的最大藥物濃度為5 μg/ml。空白對(duì)照組，加入不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；模型組，先加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)7 h（感染復(fù)數(shù)MOI為4），建立感染模型；EEOLF處理組，向模型組加入EEOLF（終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)5 h。

1.3.4活/死染色試驗(yàn)? 取空白對(duì)照組、模型組及EEOLF處理組（終濃度為5 μg/ml），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活/死（綠/紅）染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活力，綠色表示活細(xì)胞，紅色表示死細(xì)胞[1]。

1.3.5細(xì)胞因子檢測(cè)? 取空白對(duì)照組、模型組、EEOLF處理組（終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml），用ELISA試劑盒檢測(cè)上清TNF-α和IL-1β分泌情況。將8、400、200、100、50、25、12.5 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μl依次加入孔中，另取1孔只加細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)90 min；依次加入生物素抗小鼠IL-1β抗體100 μl；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)60 min；洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min左右（每孔洗液至少300 μl）；將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔100 μl依次加入；酶標(biāo)板加上封板膜，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1～2 min左右（每孔洗液至少300 μl）。分別加入顯色劑A和B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；加終止液，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)量各孔的吸光度A。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 通過(guò) GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用? 在金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)基中加入不同濃度的EEOLF后培養(yǎng)，置37 ℃搖床培養(yǎng)16～20 h后用分光光度計(jì)測(cè)定OD600，發(fā)現(xiàn)在藥物濃度為1300 μg/ml時(shí)OD600值降低，說(shuō)明EEOLF對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且最小抑菌濃度為1300 μg/ml，見表1。

2.2 EEOLF減輕金黃色葡萄球菌感染造成的RAW264.7細(xì)胞損傷? 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活/死染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細(xì)胞損傷較少，見圖1A～圖1C；金黃色葡萄球菌刺激后（模型組）細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重，見圖1D～圖1F；加入終濃度為5 g/ml的EEOLF后，細(xì)胞損傷減輕，說(shuō)明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌感染造成的細(xì)胞損傷，見圖1G～圖1I。

2.3 EEOLF降低金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)? 與空白對(duì)照組相比，模型組TNF-α和IL-1β的分泌量升高（P<0.05）。加入終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml的EEOLF分別作用于模型組的RAW264.7細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)5 μg/ml組TNF-α和IL-1β的分泌量減少（P<0.05），表明EEOLF能降低炎癥細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的釋放，見圖2。

3討論

抗生素耐藥性問(wèn)題對(duì)于全球公共衛(wèi)生來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)巨大的威脅和挑戰(zhàn)，特別是MRSA的出現(xiàn)給社會(huì)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。金黃色葡萄球菌肺炎是一種流行的社區(qū)和醫(yī)院獲得性傳染病，發(fā)病率和死亡率都很高[14]。因此，現(xiàn)亟需替代療法來(lái)對(duì)抗耐藥細(xì)菌的感染。

中藥可通過(guò)破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)或毒力因子降低細(xì)菌致病性；在與抗生素聯(lián)用下，中藥通過(guò)改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、減弱外排泵外排作用等增強(qiáng)抗生素功效；此外，中藥通過(guò)消除炎癥反應(yīng)提高機(jī)體免疫功能而抗細(xì)胞感染[15，16]。所以，從中草藥中挖掘新型抗菌消炎藥物已成為解決當(dāng)今細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題有效途徑。

LF為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，主要分布在我國(guó)東北長(zhǎng)白山、內(nèi)蒙古等地，因其藥理作用廣泛、廉價(jià)易采摘等優(yōu)勢(shì)而具有很大的開發(fā)價(jià)值[9]。研究發(fā)現(xiàn)LF地上部分乙醇提取物可通過(guò)JNK、p38MAPK通路和NF-κB等通路達(dá)到抗炎的作用[17-20]。除此以外，LF對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)也有一定的調(diào)節(jié)作用，如通過(guò)抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加小鼠血清溶血素含量，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖從而增強(qiáng)體液免疫功能[21]。

根據(jù)我國(guó)《中藥材》專著描述LF還具有抗菌作用[12]，但是目前關(guān)于LF在這方面的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)EEOLF對(duì)金黃色葡萄球的生長(zhǎng)有抑制作用，MIC為1300 μg/ml，說(shuō)明LF地上部分具有抑菌作用，具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，介導(dǎo)了炎癥過(guò)程中各種免疫病理的發(fā)展，金黃色葡萄球菌感染巨噬細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并釋放各種炎性因子[22]。TNF-α位于炎癥瀑布的上游，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并聚集多種炎性因子和氧自由基，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)，參與局部炎癥反應(yīng)，TNF-α釋放量的多少直接反應(yīng)炎癥的輕重[23]。IL-1一般產(chǎn)生于炎癥早期，具有介導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的作用[9]。本研究通過(guò)活/死染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEOLF濃度為5 μg/ml時(shí)，細(xì)胞損傷情況有所好轉(zhuǎn)，說(shuō)明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌引起的小鼠巨噬細(xì)胞損傷。通過(guò)ELISA檢測(cè)濃度為1.25、2.5、5μg/ml的EEOLF作用于金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞時(shí)，TNF-α和IL-1的釋放量，發(fā)現(xiàn)5 μg/ml的藥物能夠抑制TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，說(shuō)明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌引起的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。。

先前研究已測(cè)得EEOLF作用于密度為5×104個(gè)/ml的RAW264.7細(xì)胞24 h后，藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度為5 μg/ml[17]，因而本研究選擇的最大藥物濃度為5 μg/ml，在此劑量下，EEOLF不具備抑菌作用，主要發(fā)揮抗炎作用，如何使EEOLF更好的發(fā)揮抑菌消炎雙重作用還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，EEOLF不但可以通過(guò)抑制炎性因子的釋放減輕金黃色葡萄球菌引起的感染，而且對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用。

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