不同種植區庫爾勒香梨樹腐爛病菌Cytospora pyri營養體親和性研究

彭莎莎 王喆 沙帥帥 張怡雯 閆成才 王蘭

摘要 ［目的］使用Nit突變體體系，探索來自新疆香梨種植區不同地理來源的腐爛病菌遺傳多樣性。［方法］首次使用Nit突變株技術（抗氯酸鹽的硝酸鹽利用缺陷突變體）對來自南疆3個不同種植區的13株庫爾勒香梨樹腐爛病菌Cytospora pyri的營養體親和性進行了研究。［結果］13個菌株在含氯酸鹽培養基（KPS）培養出115個Nit突變體，其中41個沒有發生突變。在突變體穩定性鑒定中，鑒定出33個穩定的Nit突變體，82個不穩定的Nit突變體。產生的Nit突變體的表型85%被鑒定為NitD，15%被鑒定為NitB。［結論］獲得2個Nit突變體，說明C.pyri的氮同化途徑可能發生了2種突變。所有被檢測的分離株都能夠利用次黃嘌呤，使用次黃嘌呤的能力排除了鉬輔助因子位點被阻斷的可能性。

關鍵詞 香梨樹腐爛病菌；Cytospora pyri；Nit突變體

中圖分類號 S 436.612.1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）12-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.029

Study on Vegetative Compatibility of Cytospora pyri from Korla Fragrant Pear in Different Planting Areas

PENG Sha-sha1，WANG Zhe1，SHA Shuai-shuai2 et al

（1.Agricultural College，Tarim University/Key Laboratory of Southern Xinjiang Agricultural Pest Control Corps/National and Local Joint Engineering Laboratory of High-Efficiency and High-Quality Cultivation and Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang， Alar，Xinjiang 843300; 2. College of Modern Agriculture， Kashgar University， Kashgar，Xinjiang 844006）

Abstract ［Objective］ To use Nit mutant system to explore the genetic diversity of fragrant pear from different geographical sources in Xinjiang. ［Method］ In this study， Nit mutant technology （nitrate-resistant defective mutant） was used for the first time to study the nutritional affinity of Cytospora pyri， 13 strains of Korla pear tree rot from three different growing areas in southern Xinjiang. ［Result］ 115 Nit mutants were cultured in chlorate medium （KPS） from 13 strains， and 41 of them did not mutate. In the identification of mutant stability， 33 stable Nit mutants and 82 unstable Nit mutants were identified. The phenotype of the resulting Nit mutants was identified as NitD 85% and NitB 15%. ［Conclusion］ In this study， two Nit mutants were obtained， indicating that there may be two mutations in the nitrogen assimilation pathway of C. pyri. All isolates tested were able to utilize hypoxanthine， and the ability to use hypoxanthine ruled out the possibility that molybdenum cofactor sites were blocked.

Key words Pear Valsa Canker;Cytospora pyri;Nit mutant

基金項目 國家自然基金-新疆聯合基金重點支持項目（U1903206）；旱區作物逆境生物學國家重點實驗室開放課題項目（CSBAA2020009）；自治區研究生科研與創新項目（XJ2021G293）。

作者簡介 彭莎莎（1999—），女，陜西漢中人，碩士研究生，研究方向：植物保護。*通信作者，教授，博士，從事植物病理學研究。

收稿日期 2023-10-27

庫爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是國家地理標志產品之一，主要種植區有巴音郭楞蒙古自治州（簡稱巴州）、 阿克蘇地區、喀什地區等地，是新疆地區農業經濟發展的重要產業。香梨樹腐爛病（Pear Valsa Canker）嚴重危害庫爾勒香梨樹，近年來新疆庫爾勒香梨樹腐爛病病株率普遍在50%～100%，在南疆平均病株率高達85%［1-3］。腐爛病（Cytospora pyri）是由Valsa屬真菌引起。無性態為Cytospora屬，相近屬為Leucostoma，在世界范圍內導致產量損失，特別是對東亞、中國、意大利許多地區的梨果生產構成重大威脅，經常導致整個果園的樹木減產或死亡［4-6］。

自1976 年Cove［7］首次發現不能利用硝酸鹽的突變體［Nitrate Non-utilizing Mutants］而獲得構巢曲霉（Aspergillus nidulans）以來，國內外學者先后在多種真菌中使用誘導 Nit 突變體的方法進行研究。通過對半知菌亞門、子囊菌門等真菌的研究證實，硝酸鹽利用缺陷型突變體（簡稱Nit 突變體）的方法常用于研究真菌營養體親和性等方面［8-9］。1985 年 Puhalla［10］在進行互補試驗測定營養體親和性時，開辟了利用硝酸鹽營養缺陷型（Nit）突變體的方法，為分析病原菌的遺傳分析、親和群與轉化性、生理小種的相關性，以及病害生物防治等方面的研究提供了新的方向［11］。

筆者首次對庫爾勒香梨樹不同種植區的13株腐爛病菌C.pyri進行了營養體親和性測定，建立并使用Nit突變體體系，以探索來自新疆香梨種植區不同地理來源的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

13個香梨樹腐爛病菌株（Cytospora pyri）于2019年分別采自新疆的巴州、阿克蘇和喀什等庫爾勒香梨主產區，經單孢分離鑒定后獲得（表1）。

馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g；含氯酸鹽培養基（KPS）：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，氯酸鉀粉末50 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL；基本培養基（BM）：瓊脂20.00 g，KH2PO4 1.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，蔗糖30.00 g，微量元素液0.2 mL，蒸餾水1 000 mL。微量元素液（TES）：蒸餾水95 mL，硫酸銅250 mg，硫酸錳50 mg，檸檬酸5 g，硫酸亞鐵銨1 g。含硝酸鈉培養基（MM）：在1 000 mL的基本培養基中加入2.0 g 硝酸鈉。含亞硝酸鈉培養基（NM）：在1 000 mL的基本培養基中加入0.5 g 亞硝酸鈉。含次黃嘌呤培養基（HM）：在1 000 mL的基本培養基中加入0.2 g次黃嘌呤［12］。

1.2 Nit突變體誘導與分離

先將供試菌株接種在PDA上于27 ℃黑暗培養4 d，之后接種于含5%的氯酸鹽（KPS）培養基中誘導突變。菌株生長后在不規則突變區邊緣挑取菌絲，接種于MM培養基中培養。在MM培養基中，出現菌絲稀薄、匍匐生長或不產生氣生菌絲的菌落，則說明其形成抗硝酸鹽利用缺陷型突變體，即Nit突變體，用甘油保存于-80 ℃冰箱中［13］。

1.3 Nit突變體穩定性鑒定

初次篩選的突變體可能因突變不穩定導致其返回原生狀態，即回復突變，需要鑒定其穩定性。將篩選的Nit突變體接種至PDA中27 ℃黑暗培養4 d，再接種到MM培養基中。若產生氣生菌絲或呈野生型生長，則說明突變體可能因突變不穩定返回原生狀態，應丟棄；若菌落很稀薄或仍不產生氣生菌絲，則說明形成穩定的Nit突變體，用甘油保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 突變體表型鑒定

將篩選出的 Nit突變體接種于唯一氮源分別是硝酸鹽、亞硝酸鹽和次黃嘌呤的基本培養基（BM）上進行培養，通過突變體在3種培養基上的生長情況，判斷突變體對2種氮源的利用情況，確定Nit突變體的生理表現類型（表2）。

2 結果與分析

2.1 Nit突變體的誘導與分離

菌絲接種于KPS培養基后的 2～3 d，菌落幾乎不生長，整體生長狀態受到嚴重抑制。在7～11 d 后，部分菌落一側開始出現氣生菌絲，后逐漸發展成茂盛的扇形菌落（角變區），此為抗氯酸鹽突變體。突變體在含有硝酸鈉的培養基上生長較緩慢，菌絲呈無色透明膠質狀，無氣生菌絲產生，且只有很稀疏的菌絲匍匐于培養基表面生長，初步確定其為可選用的Nit突變體（圖1A）。

單個菌株取12個重復于KPS培養基中誘導突變，共156個突變點位，在KPS培養基上均有不規則菌落（扇形菌落）生長，取邊緣菌絲接種于MM培養基中進行穩定性篩選，有115個位點未產生氣生菌絲或菌落很稀薄，說明形成了硝酸鹽利用缺陷型突變體，即Nit突變體。

2.2 Nit突變體穩定性鑒定

將篩選的115個Nit突變體接種于PDA培養基中培養，再接種到MM培養基中培養，觀察記錄其生長情況。結果表明，有33個菌株不產生氣生菌絲或菌落很稀薄（圖1B），說明形成了穩定的Nit突變體，保留其菌株。

2.3 Nit突變體的篩選與鑒定

在含硝酸鈉、亞硝酸鈉、次黃嘌呤3種不同氮源的培養基上生長，鑒定Nit突變體表型。結果表明，所有在不同氮源差異培養基上的培養突變體在含次黃嘌呤和硝酸鹽培養基上生長無氣生菌絲，在亞硝酸鹽上生長較差，部分有氣生菌絲。從13個菌株中獲得的33個突變體，根據突變體在不同氮源培養基的生長特征鑒別出NitB（圖1C）與NitD（圖1D）2種類型，不同菌株產生的各種突變類型差異較小。根據含有不同氮源的差異培養基上的生長，未檢測到其他類型的Nit突變體，NitA、NitB、NitC和NitD表型頻率分別為0、15%、0和85%（表3）。

3 討論

硝酸鹽利用缺陷型Nit突變體已被廣泛用于區分VCGs和研究許多絲狀真菌種內及種間的種群遺傳多樣性［14］。該研究首次利用Nit突變體研究C.pyri的營養親和性。結果表明，通過在不同氮源培養基上進行Nit突變體表型鑒定，Nit突變體在含次黃嘌呤和硝酸鹽培養基上生長無氣生菌絲，在亞硝酸鹽上抑制生長，僅有少數有氣生菌絲產生，被鑒定為NitB、NitD突變體，說明C.pyri的氮同化途徑可能發生了2種突變。C.pyri在亞硝酸鹽上抑制生長，可能是一種無功能的硝酸鹽還原酶起作用，而這是氮同化途徑的必需酶。所有被檢測的分離株都能夠利用次黃嘌呤，使用次黃嘌呤的能力排除了鉬輔助因子位點被阻斷的可能性［15］。

研究表明，對不同種類的菌株誘導產生Nit突變體的條件不同［16］。盡管所研究的菌株具有地理多樣性，但該試驗只獲得2種類型的Nit突變體。原因可能在于C.pyri的繁殖階段中無性繁殖占主導地位，這直接導致了占據特定寄主或特定生態區域的C.pyri種內的基因流動，在氮同化方面，基因流導致了不同種植區香梨樹腐爛病菌C.pyri的同質化，因此，推測大多數C.pyri菌株對氮的利用具有相同的模式。

利用Nit突變體的方法能夠使研究者對殼囊孢屬真菌在世界范圍內的營養體親和性進行比較，為這種普遍發生的植物病害的遺傳多樣性提供有價值的信息。后期可以在不同氯酸鹽改良培養基上篩選更多的分離株，甚至在硒酸鈉改良的培養基上產生其他種類的硫酸鹽突變體，如硫酸鹽非利用突變體（sul），可能有助于更好地了解C.pyri分離株的營養親和性。

參考文獻

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