西藏林芝蜂蜜與其他地區蜂蜜揮發性成分比較分析

曹旭珍 周志磊 歐霞 德央 張建峰 扎西措姆 毛健

摘要 ［目的］探究西藏林芝蜂蜜的特征揮發性成分。［方法］采用HS-SPME結合GC-MS對西藏林芝、陜西秦嶺、西藏山南、吉林長白山和云南香格里拉地區蜂蜜的揮發性成分進行分析，并結合化學計量學研究西藏林芝蜂蜜與其他4個產地蜂蜜揮發性成分之間的差異。［結果］5個地區蜂蜜中共鑒定了103種成分，其中西藏林芝蜂蜜61種，陜西秦嶺36種，西藏山南49種，吉林長白山31種，云南香格里拉42種。林芝蜂蜜揮發性成分種類最豐富，主要以酯類為主，且含量占比較大，其他4個地區則以醇類和醛類占比較大。單因素方差分析發現不同產地間有45種化合物含量存在顯著差異，正交偏最小二乘判別分析進一步鑒定出水楊酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛8種化合物是區別林芝蜂蜜和其他地區蜂蜜的關鍵物質，其中苯丙酸乙酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯僅在林芝蜂蜜中被檢測到。［結論］酯類物質對區別林芝蜂蜜與其他地區蜂蜜具有重要意義。

關鍵詞 西藏林芝蜂蜜；頂空固相微萃取；揮發性成分；正交偏最小二乘判別分析

中圖分類號 TS 207? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）12-0177-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.037

Comparative Analysis of Volatile Components Between Nyingchi Honey from Xizang and Honey from Other Regions

CAO Xu-zhen1，2，ZHOU Zhi-lei1，2，3，OU Xia4 et al

（1.National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122;3.Jiangnan University （Shaoxing） Industrial Technology Research Institute，Shaoxing，Zhejiang 312000;4.Department of Tibetan Medicine，Tibet Medical University，Lhasa，Xizang 850000）

Abstract ［Objective］To explore the characteristic volatile components of honey from Nyingchi，Xizang.［Method］HS-SPME combined with GC-MS was used to analyze the volatile components of honey from Nyingchi of Xizang，Qinling of Shaanxi，Shannan of Xizang，Paektu of Jilin and Shangri La of Yunnan.In addition，the difference of volatile components between Xizang Nyingchi honey and honey from other four producing areas was studied with Chemometrics.［Result］103 ingredients were identified in honey from five regions，including 61 species of Nyingchi honey in Xizang，36 species of Qinling honey in Shaanxi，49 species of Shannan honey in Xizang，31 species of Paektu Mountain honey in Jilin，and 42 species of Shangri La honey in Yunnan.The most abundant types of volatile components in Nyingchi honey were mainly esters，which accounted for a relatively large proportion，while alcohols and aldehydes accounted for a relatively large proportion in the other four regions.Analysis of variance found that there were significant differences in the content of 45 compounds among different habitats.Orthogonal partial least squares discriminant analysis further identified ethyl salicylate，n-hexanoic acid，octane，phenylpropanoic acid ethyl ester，ethyl pentanoate，ethyl octanoate eight compounds of phenethyl alcohol and octanal were key substances to distinguish Nyingchi honey from honey from other regions.Among them，ethyl phenylpropanoic acid，ethyl pentanoate and ethyl octanoate were only detected in Nyingchi honey.［Conclusion］Esters are of great significance in distinguishing Nyingchi honey from honey from other regions.

Key words Nyingchi honey in Xizang;HS-SPME;Volatile component;Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）

基金項目 西藏藏醫藥大學藏醫藥“十四五”規劃內涵建設一期項目（2021ZYYGH005）。

作者簡介 曹旭珍（1999—），女，江西九江人，碩士研究生，研究方向：食品風味化學。*通信作者，講師，碩士，從事功能食品研究。

收稿日期 2023-08-01

林芝蜂蜜是指在林芝市行政區域一定保護范圍內獨特的地理環境條件下，由喀爾巴阡蜜蜂、中華蜜蜂采集的符合一定質量要求的蜂蜜［1］。林芝市位于西藏自治區東南部，氣候溫和，雨量充沛，具有特殊的晝夜溫差，孕育出各類植被及大量珍稀藥材，如野黃連、野丹參、野菊花、益母草及桃樹、蘋果樹等，喀爾巴阡蜜蜂、中華蜜蜂通過采集這些花蜜而釀造出純天然的林芝蜂蜜。得天獨厚的環境和氣候條件使得林芝蜂蜜在風味上具有自然的花香味和淡淡的馨香味等特點，深受消費者喜愛。蜂蜜的風味主要與其揮發性成分有關，且主要來源于蜜蜂采集的花蜜，不同蜜源蜂蜜的揮發性成分間通常存在較大差異。

國內外學者對蜂蜜香氣成分的研究開始較早，且主要集中在探求單一種類蜂蜜的特征香氣成分并建立相應的指紋圖譜，對于蜜源環境復雜的百花蜜揮發性成分卻鮮有報道。目前已有超過600 種揮發性物質從不同蜂蜜中鑒別出來［2］，如桉樹蜂蜜中最具特征的揮發性化合物是羥基酮（尤其是3-羥基-2-丁酮）［3］；柑橘類蜂蜜的特點是芳樟醇衍生物、檸檬醇和α-4-二甲基-3-環己烯-1-乙醛含量較高［4］；脫氫芳樟醇是所有Erica蜂蜜的特征化合物［5］。已有學者得出林芝蜂蜜相較于西藏其他地區的蜂蜜具有更高的新鮮度和品質［6］，但對林芝蜂蜜揮發性成分的研究鮮見報道。蜂蜜揮發性成分的種類不僅取決于其蜜源種類，與揮發性成分的萃取和鑒定技術也有很大的關系［7］。研究蜂蜜常用的前處理手段已從早期的溶劑萃取［8］、超聲波輔助萃取（ultrasound-assisted extraction，USE）發展到頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）［9-10］等，常用的鑒定技術包括氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、嗅聞儀（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和電子鼻等。由于HS-SPME具有操作簡單、靈敏性高、需要的樣品量少、成本低等優點，常與GC-MS聯用用于蜂蜜和其他食品中香氣成分的鑒定［11］。筆者采用HS-SPME結合GC-MS對林芝蜂蜜的揮發性成分進行解析并明確其主要風味特點，對同樣產自深山的云南香格里拉、吉林長白山、陜西秦嶺和西藏山南地區的蜂蜜也進行了相同的分析并與林芝蜂蜜進行對比，篩選出能鑒別出林芝蜂蜜的關鍵揮發性成分，為市場上打擊偽劣低品質林芝蜂蜜、甄別野生高品質林芝蜂蜜提供依據，也為進一步完善林芝蜂蜜的感官特點和食用價值、推動西藏地區野生資源的開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。共收集西藏林芝蜂蜜樣品18個，編號LZ1～LZ18；云南香格里拉地區蜂蜜樣品6個，編號YN1～YN6；吉林長白山地區蜂蜜樣品8個，編號JL1～JL8；陜西秦嶺地區蜂蜜樣品8個，編號QL1～QL8；西藏山南地區蜂蜜樣品2個，編號SN1～SN2。所有樣品均從原產地采集，樣品來源地區分布如表1所示。

1.1.2 試劑。二苯甲酮、己醛、正己酸乙酯、辛醛、正己醇、壬醛、2-乙酰基呋喃、苯甲醛、芳樟醇、5-甲基糠醛、苯甲酸乙酯、茶香酮、正己酸、苯甲醇、苯乙醇、2，5-二甲酰基呋喃、辛酸、棕櫚酸乙酯、癸酸、 苯丙酸乙酯、庚酸、異佛爾酮、丁二酸二乙酯、糠醛、辛酸乙酯、庚酸乙酯、正戊醇、戊酸乙酯、乙酸異戊酯，純度＞98%，上海麥克林生化科技有限公司；C7～C30正構烷烴，色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉、乙醇，分析純，中國國藥集團化學試劑上海有限公司。

1.1.3 試驗儀器。

Trace 1300氣相色譜儀、ISQ 7000質量檢測器，美國Thermo Fisher公司；SPME 手動進樣手柄、50 μm/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（CAR/DVB/PDMS）纖維萃取頭，美國 Supelco 公司；ME104電子天平，梅特勒-托利多精密儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理。

參照任佳淼等［12］的研究進行。在20 mL 的頂空瓶中加入3 g蜂蜜樣品（對于固態蜂蜜先置于50 ℃水浴中加熱至完全溶解，混勻后再取樣）和10 μL的內標（用甲醇配制的10 μg/mL二苯甲酮溶液），加氯化鈉至飽和，再置于50 ℃下磁力攪拌混勻，平衡30 min。

1.2.2 試驗條件。

1.2.2.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）條件。

將萃取頭在240 ℃進樣口老化至無雜峰后插入平衡好的頂空瓶中，50 ℃下吸附40 min，取出后插入GC進樣口，240 ℃下解析5 min，進行GC-MS分析。

1.2.2.2 色譜條件。

色譜柱為TG-WAX MS（30 m×0.25 μm×0.25 mm）極性柱；升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持0 min，然后以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min；載氣（He）流速1.2 mL/min，不分流進樣。

1.2.2.3 質譜條件。

電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；無溶劑延遲；質量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.3 定性分析。

使用2種方法定性，一是利用質譜數據庫對揮發性成分進行定性分析，二是計算保留指數輔助定性，即測定相同條件下C7～C30的保留時間，再通過公式（1）計算各化合物的保留指數（RI），并與標準譜庫中的進行對比，取差值相差80以內的化合物。

RI=100×n+100（t-tn）tn+1-tn（1）

式中：tn為正構烷烴Cn的保留時間；tn+1為正構烷烴Cn+1的保留時間；

t為某一化合物的保留時間，t必須在tn和tn+1之間。

1.2.4 定量分析。

對于有標樣的物質建立校正曲線進行定量：配制一定濃度的標準品溶液（以乙醇作為溶劑）作為蜂蜜儲備液，以40%果糖和20%葡萄糖溶液作為蜂蜜模擬液，選擇9個梯度濃度對其進行稀釋。HS-SPME-GC-MS的條件與樣品相同，以不同濃度下色譜峰面積繪制標準曲線并代入樣品峰面積計算其含量。 對于無標樣的物質，采用半定量的方法，忽略響應因子，假定目標物質與內標的面積與濃度成正比進行計算。

1.3 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel進行統計分析，樣品中各揮發性成分含量的平均值均由3個平行樣品的相應數據計算而來；origin 2021軟件繪制柱狀圖；SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 作為存在顯著性差異的條件；SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）并計算預測變量重要性投影值 （variable importance in projection，VIP）。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜樣品揮發性成分鑒定

從表2可以看出，5個產地蜂蜜共鑒定出103種香氣成分，其中林芝蜂蜜鑒定出61種，陜西秦嶺36種，西藏山南49種，吉林長白山31種，云南香格里拉42種，各地區揮發性成分按官能團種類分布結果如圖1所示。林芝蜂蜜揮發性成分總離子流圖如圖2所示。從化合物的種類上看，5個地區共有的化合物有13種，分別是丁酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸烷、辛烷、辛醛、正己醇、壬醛、苯甲醛、芳樟醇、二氫芳樟醇、苯乙醇、辛酸。林芝蜂蜜揮發性成分種類最多，但從其他4個地區的蜂蜜中均鑒定出了林芝蜂蜜中沒有的醚類物質和烯烴類物質。含硫化合物在林芝蜂蜜中未檢出，但在山南蜂蜜中檢測到。酯類物質種類數在林芝、秦嶺、山南和云南蜂蜜揮發性成分中占比最大，但在吉林蜂蜜中卻以醛類為主。

2，5-二甲酰基呋喃和2-乙酰基呋喃在林芝和山南蜂蜜中均檢測出，其中云南蜂蜜中也檢測出2-乙酰基呋喃，其余均未檢出呋喃類物質。糠醛和5-羥甲基糠醛在許多蜂蜜中都被檢測到［13-14］，但它們的存在一般與熱處理有關，加熱和不當的儲存方式會使蜂蜜中揮發性成分的氨基和羰基在酸性條件下發生美拉德反應，從而生成5-羥甲基糠醛［15］，而固相微萃取離不開加熱環節，所以它們對鑒別不同產地蜂蜜具有的意義不大，但可以作為評價蜂蜜新鮮度的指標［12］。辛酸在5個產地的蜂蜜中均檢測到，十五烷僅在林芝蜂蜜中檢測到，但粟有志等［16］對4種新疆單花蜜的揮發性成分檢測中這2種物質均存在，因此可能對林芝蜂蜜的特殊香氣貢獻不大。在Vzquez等［3］的報道中提到的芳香化合物苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇和苯乙醛等在此次研究中也檢測到，它們普遍存在于蜂蜜及蜂蜜制品中，并且在一些單花蜂蜜中有報道過。

2.2 蜂蜜樣品揮發性成分定量分析

對所有鑒定出的揮發性成分進行定量分析，單個物質含量結果如表2所示，按官能團進行分類的各類別含量結果如表3所示。由表3可知，林芝蜂蜜中揮發性成分總含量最大，為16.474 2 μg/g，其次是云南、秦嶺、吉林，分別為6.138 3、5.354 4、4.831 1 μg/g，山南最小，為3.429 1μg/g。種類數最多的化合物不一定含量

占比最高，林芝蜂蜜中揮發性成分種類以酯類為主，但含量最高的化合物是2，5-二甲酰基呋喃，達到了3.414 8 μg/g。其次是醇類，含量為2.916 3 μg/g，醛類和酯類含量次之。除林芝外，其余地區蜂蜜揮發性成分中的醇類物質含量也很豐富，其中秦嶺和吉林地區蜂蜜揮發性成分主要以醇類為主，含量分別高達2.538 7和1.997 9 μg/g，占其各自總揮發性成分含量的40.00%以上，秦嶺蜂蜜中含量最高的化合物是二氫芳樟醇（1.295 6 μg/g），也屬于醇類。陳廷廷等［17］在對4種川西高原蜂蜜的研究中也發現醇類物質含量較高，說明醇類物質可能對蜂蜜揮發性成分具有一定的貢獻，同時其也可能成為區別林芝蜂蜜和其他蜂蜜的關鍵成分。醛類物質為云南蜂蜜的主要揮發性成分，占比37.80%，其在林芝和山南蜂蜜中含量也較高，占比在15.00%以上。酸類物質在各地區蜂蜜中含量占比也較高，同樣對蜂蜜揮發性成分具有一定的貢獻。

2.3 林芝蜂蜜與其他產地蜂蜜的揮發性成分差異分析

對林芝蜂蜜的61種香氣成分定量結果進行單因素ANOVA分析和組間差異分析，結果表明，有45種化合物在林芝與其他4個地區蜂蜜間存在顯著差異。其中乙酸乙酯、4-甲基癸烷、糖醛、乙酸異戊酯等30種化合物在此次檢測中僅在林芝蜂蜜中被鑒定出來。丁酸甲酯、

壬酸甲酯、辛烷、苯乙醇和辛酸這5種化合物在林芝蜂蜜和其他產地蜂蜜中均檢測到，但在林芝中的含量更大。由此可見，相較于其他4個地區的深山百花蜜，林芝蜂蜜中的揮發性成分種類更多，且多種化合物的含量高于其他產地，這可能與西藏林芝獨特豐富的蜜源環境有關。

為了進一步篩選出林芝蜂蜜的代表性化合物，使用OPLS-DA對45種有顯著差異的物質進行多變量統計分析。OPLS-DA作為一種有監督的多變量分析，可以有效探究引起組間差異的關鍵化合物。OPLS-DA分析的載荷-得分圖如圖3所示，林芝蜂蜜與其他4個地區的蜂蜜被有效區分開來。在OPLS-DA模型中，Q2 表示模型的預測能力，且 R2 和Q2 越接近 1.0說明模型越好，越低說明模型的擬合準確性越差，但一般情況下R2 和Q2 高于0.5則表示較好［18］。此次模型的R2X=0.934，R2=0.782，Q2=0.805，R2和Q2均大于0.5且接近1.0，表明該模型具有良好的可解釋度和擬合度。又對45種有顯著差異的物質進行了200次的置換檢驗，結果如圖4所示，圖4中Q2點回歸線與橫坐標交叉或小于0，截距為負值，統計模型有效，沒有過擬合。

VIP 值可以反映風味物質對模型分類的貢獻程度，將 VIP > 1 作為篩選關鍵風味物質的標準，各化合物的VIP值如圖5所示。由圖5可知，水楊酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙

酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛的VIP > 1，表明

這8種揮發性物質在區分林芝和其他4個地區蜂蜜起著關鍵作用。其中苯丙酸乙酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯是林芝蜂蜜獨有的成分；苯乙醇在幾個產地蜂蜜中都存在，但在林芝蜂蜜中檢測到的含量最高。

3 結論

林芝蜂蜜相比其他幾個產地，揮發性成分的種類更豐富，多種成分含量明顯高于其他產地，尤其是酯類物質，說明林芝蜂蜜在自身揮發性成分組成上具有鮮明的特點。林芝蜂蜜揮發性成分種類以酯類、醛類和醇類為主，酯類物質是林芝蜂蜜中數量最多的揮發性物質，含量占比為12.68%。通過化學計量學篩選出水楊酸乙酯、正己酸、辛烷、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇和辛醛這8個能夠區分林芝蜂蜜與其他4個地區蜂蜜的特征揮發性成分，其中有4個酯類物質，且3個酯類物質僅在林芝蜂蜜中檢出。這也進一步說明酯類物質對林芝蜂蜜風味獨特性具有一定的貢獻。該研究為建立基于揮發性成分的林芝蜂蜜質量控制及產地鑒別提供了思路和借鑒基礎。

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