紅蓮型不育系綠3A原種商業化提純繁殖技術研究

高勝從　呂加林　崔會會　劉明健　蘇祥忠　朱昌棟　王傳軍　潘華　李濤　史昆

摘要：針對紅蓮型不育系綠3A在大規模繁殖時可能遇到的親本種子純度問題，創新地融合了“株系循環法”和“三系七圃法”進行提純，并開展了后期繁殖的商業化配套技術研究，成功實現了年產親本原原種10萬kg的目標，不僅解決了提純的技術難題，更為紅蓮型不育系的大規模商業化原種提純繁殖提供了寶貴的參考。

關鍵詞：紅蓮型；綠3A；提純復壯；商業化；株系循環；動態平衡

Research on Commercial Purification and Propagation Techniques of Original Seeds of Honglian-Type Sterile Line Lv3A

GAO Shengcong，LYU Jialin，CUI Huihui，LIU Mingjian，SU Xiangzhong，

ZHU Changdong，WANG Chuanjun，PAN Hua，LI Tao，SHI Kun

（Anhui Win-All Hi-Tech Seed Co.，Ltd. /Key Laboratory of Hybrid Rice New Variety

Creation of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Hefei 230088）

20世紀70年代開始，中國農業科技人員相繼成功實現“三系法”育種技術，促進了雜交水稻的大面積推廣種植，取得了舉世矚目的成就。由朱英國院士團隊育成的紅蓮型、野敗型和包臺型不育系被國際公認為雜交水稻三大細胞質雄性不育類型。近年來，紅蓮型雜交水稻在基礎研究、應用研究和產業化等方面均有突破[1]，但仍然面臨著親本提純制約大規模商業化推廣的問題。

紅蓮型三系中秈稻不育系綠3A（原名9912A）是安徽省農業科學院綠色食品工程研究所于2002年育成，并在安徽適宜地區建立了相應的原原種、原種和良種繁育體系，但只具有年產2萬kg的供種能力[2]。隨著繁育世代的增加，特別是用種量急劇增加后，綠3A種子出現了育性不穩定現象，變異株和同形可育株等雜株比例超標，影響了其商業化應用。本文針對綠3A在大規模繁殖時親本種子可能存在的純度問題，對其采用多方法集成的不育性提純及配套繁殖技術研究，成功地實現了親本原原種年產10萬kg。

1 綠3A提純的方法與基地選擇

1.1 提純與檢測的方法 綠3A（由安徽荃銀種業科技有限公司提供，以下簡稱荃銀科技公司），經多點田間鑒定純度為97.5%～98.9%，進行綠優1號（綠3A/綠稻24）等品種試制，收獲F1種子，純度為90.0%～94.8%，因此，綠3A 親本質量的提升迫在眉睫?！昂喴追ā薄爸晗笛h法”和“三系七圃法”都是原種提純的經典方法，經過多年摸索，本文采用了“株系循環法”和“三系七圃法”的融合，同時將“簡易法”設為對照，并開展了后期繁殖的商業化配套技術研究[3]。采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程 SSR分子標記法》中的48個水稻SSR標記，對水稻樣品進行DNA分析[4]。

1.2 基地的選擇與播期安排 基地選擇在江西省撫州市宜黃縣，利用春繁季節（7月12-20日）高溫時段，更有利于檢測淘汰和選擇高質量個體。春繁試驗播種時間：不育系播種時間（A）：4月8日；保持系Ⅰ期與Ⅱ期播種時間分別為（B1）：4月11日、（B2）：4月15日；移栽時間：5月10日；抽穗時段：7月12-17日；收割時間：8月5日。

2 不同方法提純的結果與比較

2.1 “三系七圃法”融合“株系循環法”實現對原種的精準提純 利用大批量成對雜交株對，通過株行和株系淘汰、選擇和鑒定，以動態平衡的方式，獲得合格的混系株對種子，從而穩定質量（純度），達到提純繁殖目標。第1輪篩選：2019年建立選種圃，經過典型性狀和育性檢測，完成成對交123對（編碼：綠3A19-n/綠3B19-n）。2020年正季種植株行圃選留29對。2021年種植株系圃，選留19對收獲株系種子（分系），于海南種植鑒定質量（純度），同年，抽穗前10d于分系田間取葉片進行室內真實性檢測；見穗前在田間進行A、B套袋自交；花期分系測交綠3A/R9311，收獲種子。第2輪篩選：2020年同步從第1輪株行圃和株系圃中選擇優良單株，建立選種圃，進行“株系循環法”第2、3……N輪篩選，截至2023年已經完成3輪篩選。3輪提純株系圃分系海南種植純度鑒定情況具體見表1。

具體結果：第1輪篩選：完成成對交123對（編碼：綠3A19-n/綠3B19-n）；株行圃當選比率（合格比例）23.5%；株系圃成對交當選比率（合格比例）15.4%；收獲株系種子（分系）數量綠3A/綠3B：300kg/60kg，海南種植鑒定質量（純度）99.95%/100%。

2021年分系DNA檢測全部合格，田間檢測不育株率100%，不育度99.83%，套袋自交結實0.17%；2022年種植測交種子，株系（19個混系）恢復度86%～94%，恢復株率達100%。持續用“株系循環法”進行第2輪、第3輪篩選，提純原種，結果均較滿意（表2）。

2.2 “簡易法”繁殖原種，種子純度不穩定 2019-2021年連續3年安排進行小面積的原種繁殖，綠3A和綠3B同步進行（表3）。技術程序：（1）在當年的親本繁殖基地選擇肥力水平均勻、條件好的繁殖田0.13～0.20hm2，嚴格按照單株種植繁殖；（2）在苗期、分蘗期、生殖生長始期、見穗期、抽穗期至種子收割前，多次進行嚴格除雜除劣，將一切可疑的植株全部除掉，混收種子，作為原種；（3）在實施的過程中，注意對單株的選擇比較，嚴格把握親本的典型性標準，嚴禁肥水、激素、農藥和除草劑對性狀的影響，規避人為誤差[5]。通過技術人員持續的田間努力，混收種子質量（純度）較繁殖前有顯著提升，增幅較大，但是幾代循環疊加，獲得純度99.8%以上的高質量親本難度較大。

2.3 兩種方法結果比較 前者方法提純原種，能夠精準獲得高質量種子，可控制性較強，從成對交株對至株系（分系），直觀掌握每一系的質量情況，方便淘汰不合格成對交，混合保留的株系種子作為大田繁殖用種種源；操作過程中，每一季涵蓋成對交、株行和株系（分系）試驗圃。相比較后者簡便易于操作，但是無法收到高質量（純度）原種，而且存在高世代個體出現“同質恢”轉育結實的質量風險。

3 “三系七圃法”融合“株系循環法”需注意問題

3.1 選擇比率波動 第1輪2019年成對交株行圃淘汰比率大于70%，分析原因是選種圃篩選時親本種源的純度較低，母本選種圃種植3200株，雜株達80株，比例達2.5%，雜株類型有早熟、晚熟、紫色稃尖、圓粒形、長粒形和同形可育株。第2輪、第3輪趨于穩定，每一階段逐步淘汰和修整輕微變異的成對株對，株行圃和株系圃的選擇比例大于50%，達到正常標準。

3.2 高溫敏感株的自交結實 紅蓮型不育系屬于配子體不育，花粉表現為二核期敗育，敗育花粉粒呈現出中空圓形，1%碘—碘化鉀溶液下不著色，屬圓敗類型。幾年來，在27.03°～27.43°N區域開展提純研究，為篩選出高溫轉育株，通過分析該區域多年的氣象資料，7月中下旬會有35～40℃高溫天氣，所以母本的抽穗揚花期安排在7月下旬，使得母本育性敏感期處于高溫天氣，母本就會出現不同程度的高溫轉育，轉育個體俗稱同形可育株，人工套袋自交試驗，結實比例達1‰～2.5‰，而且自交后代為正常結實的早熟類型雜株。

3.3 選擇方法由傳統的限值選擇改進為眾數選擇[6] 育種上常用優中選優方法進行系統選擇，其田間淘汰率較高，操作時人為因素影響很大。利用“株系循環”良種繁育方法，以維持優良群體的穩定性為主要目標，掌握穩步求進的思路，可以使種子的質量和數量得到提高。在大田正常環境下選擇植株，務必注重品種的典型性和群體性，只要不是雜株、劣株和病株都可以選用。

3.4 降低不育系用種代數 株系圃鑒定后的種子（原原種）混合后繁殖原種，將原種種子直接作為大田用種親本用于制種生產，可以減少親本中“同質恢”恢復基因的可育個體，隨著 F1雜株及其分離后代的花粉進一步滲入到不育系和保持系中，產生大量的“同質恢”雜株，造成生物學混雜，導致恢復基因進一步擴散[7]。實踐中，采取循環進行“選擇—種植鑒定—選擇”的提純繁殖方式，持續獲得原種，提供合格大田用種供制種生產環節使用，是一種可行的策略。

3.5 建立基礎群體，用“株系循環法”逐步淘汰育種剩余變異[6] 根據單株選擇理論，自花授粉作物只須進行一次單株鑒定選擇，就可最大程度地除雜去劣，對生育期、株高等數量性狀加以有效控制，就能選留到具有品種典型性和整齊一致的數個株行小區。工作人員在操作的過程中，首先將成對交進行株行比較鑒定試驗，合格后的成對株行，再進行一季株系試驗，就建立了株系循環基礎群體。株系循環基礎群體的株系數量一般不低于100個，以保證基因庫的完整和穩定。依據該品種在一定的栽培條件和生態條件下自然形成的特性，田間選擇時，保留群體中符合本品種典型性的多數或大多數個體，通過逐年的少量淘汰，有目的地提高有利基因頻率。

4 商業化配套技術研究

4.1 增加專業技術力量，持續開展親本育性研究 穩定在高溫生態區域建立和發展原種提純繁殖試驗基地，利用高溫氣候環境誘導不育系中高溫敏感株個體表現型顯現，逐步淘汰不利基因型，穩步年產優良株系種650kg，分系海南種植鑒定檢測，混系使用，繁殖用種純度99.95%，制種用種純度99.80%。

4.2 穩固適宜的生態繁殖基地 依托國家政策農業項目支撐，在江西省撫州市發展1～2個縣、4～5個鄉鎮，建立起穩固的水稻親本種子提純繁殖基地，不育系年繁殖面積達133.3hm2。

4.3 采用“公司+基地+農戶”的產業化模式 派駐專業技術人員全程督導；基地組建除雜專業隊伍，人均除雜面積小于0.26hm2，保障繁殖質量；對農戶進行繁殖過程技術監控和技術指導，確保環節合格。

4.4 繁殖過程中嚴格把關 抽穗授粉期安排在低溫季節，以春繁、秋繁和海南春繁為主；實施空間隔離，杜絕用時間和距離隔離；及時清除田間再生苗；抽穗前組織人員去除明顯雜株；花期重點拔除同形可育株，務必在散粉前完成，當天露雜當天去除；父本授粉完成立即低位割除，反復檢查直至驗收合格；收割母本前進行最后驗收；收割機械仔細檢查，防止機械混雜。

5 總結和展望

綠3A原種大規模商業化提純繁殖遇到的問題，是很多紅蓮型雜交水稻同樣面臨的問題，也反映出當前我國雜交水稻研究重育種、輕提純繁殖的現狀。以產業化思維為引領，通過對親本特征特性及前人相關研究進行深入了解，并腳踏實地去投入、去攻關，才能保質保量生產出合格種子，才能實現大規模產業化推廣。當前，紅蓮型雜交稻在國內種植面積已達200多萬hm2，并已逐步打開國外市場，在越南、老撾、孟加拉、非洲幾內亞等國家種植均表現優異[8]。希望通過本文的研究，能夠為大家提供一些借鑒，共同實現雜交水稻產業未來更大的發展。

參考文獻

[1]黃文超，胡駿，朱仁山，李紹清，王坤，余金洪，李陽生，章志宏，朱英國．紅蓮型雜交水稻的研究與發展．中國科學：生命科學，2012，42（9）：689-698

[2]朱啟升，楊前進．安徽紅蓮型細胞質的應用研究//中國科協，湖北省人民政府．2007中國科協年會專題論壇“紅蓮型雜交水稻學術專題研討會”論文匯編．北京：中國科協，2007：179-182

[3]陸作楣，陶瑾，孫榮才．論我國雜交稻親本繁育技術的演變．雜交水稻，1993（2）：1-3

[4]國家市場監督管理總局，中國國家標準化管理委員會．GB/T 39917—

2021 主要農作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測 稻．北京：中國標準出版社，2021

[5]張春慶．玉米水稻雜交種子生產技術．濟南：山東科學技術出版社，2015

[6]陸作楣，陶瑾．論“株系循環法”．種子，1999（4）：3-5，8

[7]王際鳳，陸作楣．恢復基因的滲入對紅蓮型不育系粵泰A純度的影響．中國水稻科學，2007，21（5）：500-506

[8]朱仁山，余金洪，丁俊平，杜成波，李紹清，胡駿，黃文超，王坤，李陽生，楊代常，章志宏，朱英國．紅蓮型雜交水稻的研究與實踐．雜交水稻，2010，25（S1）：12-16

（收稿日期：2024-03-01）