黃連素合成中縮合/還原反應甲基雜質的分離與二維核磁解析

摘 要 黃連素是一種具有顯著抑菌作用的重要生物堿。利用柱層析對其合成中縮合/還原反應甲基雜質進行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR，二維核磁相關譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135 o對分離的甲基雜質進行了結構歸屬解析。

關鍵詞 黃連素 雜質 柱層析 核磁共振二維譜解析

中圖分類號：O657.61； O623.738 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）09-0118-04

引用本文 張祥明， 趙宗敏， 張小金， 等. 黃連素合成中縮合/還原反應甲基雜質的分離與二維核磁解析[J]. 上海醫藥， 2024， 45（9）： 118-121.

Isolation and 2D-NMR analysis of methylation impurity formed in the condensation/reduction reaction in the synthesis of berberine

ZHANG Xiangming， ZHAO Zongmin， ZHANG Xiaojin， GU Zhiguo（Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jingdezhen 333000， China）

ABSTRACT Berberine is an important alkaloid with significant antibacterial effects. The methyl impurity in the condensation/reduction reaction during its synthesis was isolated by column chromatography and analyzed by 1H-NMR， 13C-NMR， 1H-1HCOSY， HSQC， HMBC and DEPT135 o.

KEY WORDS berberine； impurity； column chromatography； 2D-NMR analysis

中藥黃連素是一種在我國應用很久的重要生物堿，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。黃連素能對抗病原微生物，對多種細菌如痢疾桿菌、結核桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌及白喉桿菌等都有抑制作用，其中對痢疾桿菌作用最強，常用來治療細菌性胃腸炎、痢疾等消化道疾病[1]，且其不良反應較小。目前，黃連素生產有提取法[2-3]和化學合成法[4-5]，大部分的合成路線是以胺（化合物A）和2，3-二甲氧基苯甲醛（化合物B）為起始物料經過縮合得到不分離的亞胺中間體C，再經過還原、后處理成鹽得到胺鹽酸鹽D（圖1），本研究過程中發現最終胺鹽酸鹽D中有一個未知雜質生成（后續經過分析，產生原因可能是起始物料化合物B中殘留的雜質甲醛繼續與產物D發生還原胺化反應產生此甲基雜質），此雜質的結構確證對于產品質量的控制具有重要意義。截止目前，未見該雜質化合物的核磁結構解析文獻報道。本研究利用柱層析對黃連素合成中縮合/還原反應的甲基雜質進行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR，二維核磁相關譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135 o對分離的甲基雜質進行了歸屬解析。

1 儀器、試劑和實驗方法

1.1 儀器與試劑

400 MHz NMR核磁共振儀（Bruker公司）；UTP-313電子天平（上海花潮電器有限公司）；Xevo G2-XS Tof質譜儀、E2695液相色譜（Waters公司）。

化合物A（上海柏際醫藥科技有限公司，98%）；化合物B（上海浙緣化工有限公司，98%）、還原劑雷尼鎳（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，≤150 mm，分散在水中）；片堿、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、硅膠（粒徑50～74 mm）（國藥集團化學試劑有限公司，溶劑級別均為分析純）。

1.2 實驗方法

1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135 o、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC均在Bruker公司400 MHz核磁共振波譜儀上測定。1H-NMR的觀測頻率為400 MHz，13C-NMR的觀測頻率為100 MHz。核磁共振實驗采用5 mm直徑核磁管，一維、二維核磁實驗均在控溫下進行。

2 甲基雜質的分離

參考專利[6]合成胺鹽酸鹽。取蒸干的26 g雜質粗品約5 g，加甲醇25 mL溶解，搖勻，加硅膠15 g，攪拌均勻，旋轉蒸發干燥，使呈粉末態，備用。

取玻璃柱（直徑8.5 cm，柱長110 cm），加入硅膠至約7/10柱體積。加入洗脫液，（正己烷-乙酸乙酯50∶1），至柱子中硅膠呈均一狀。然后，緩慢加入上述粉末，加入洗脫液開始過柱，常壓過柱，收集洗脫液，液相檢測。收集含有甲基雜質的料液，旋轉蒸發儀蒸干可得純度較好的固體0.2 g。經HPLC檢測其純度為98.2%（圖2，保留時間7.653 min的為甲基雜質洗脫峰）；質譜檢測其相對分子質量為330（[M+H]+）（圖3）。

3 甲基雜質的核磁共振解析

1H-NMR譜（圖4）中顯示分子中共有多組質子信號，共23個質子。δ4.89的質子為溶劑質子信號。13C-NMR（圖5）顯示樣品分子有多組C信號，分子中共含19個碳。DEPT135 o譜圖（圖6）顯示有4組仲碳、9組叔碳或伯碳，其余為季碳。依據HSQC譜圖（圖7）可以確認各組碳與氫的連接關系。1H-NMR譜圖中，δ 2.28（s，3H）為單峰，且為3個質子，根據甲基的出峰規律，歸屬為H10，對應的HSQC譜圖（圖7）中δ 41.21歸屬為C10。

根據DEPT135 o譜圖，可知δ 100.67為仲碳，HSQC中對應的質子為δ 5.89（s，2H），根據氧原子鄰位出峰規律，可歸屬為C3/H3。結合1H-NMR譜圖以及DEPT135 o，2.74～2.78（m，2H）為CH2，根據一般烷基的出峰規律，可以歸屬為H8，HSQC中對應的碳為δ 32.80。1H-1HCOSY圖（圖8）中2.58～2.63（m，2H）與H8相鄰，歸屬為H9，對應的碳為δ 59.08。根據DEPT135o譜圖，δ 100.67，δ 32.80，δ 59.08，δ 54.74為仲碳，δ 100.67，δ 32.80，δ 59.08已分別歸屬為C3，C8，C9，因此δ 54.74歸屬為C11，對應的質子3.62（s，2H）歸屬為H11。

HMBC（圖9）中，與H11相關的低場碳有δ131.19，δ 122.71，δ 147.86，根據DEPT135 o譜圖δ131.19與δ 147.86為季碳，因此δ 122.71，歸屬為C13，對應的質子6.92～6.94（m，1H）歸屬為H13。

1H-NMR譜圖中，δ 3.86（s， 3H）與δ 3.79（s，3H）為單峰，且均為3個質子，根據甲氧基的出峰規律，歸屬為H18或者H19，對應的碳δ 54.88，δ 59.77歸屬為C18或者C19。HMBC中，季碳δ 147.86與H11和δ3.79（s，3H）有相關，因此季碳δ 147.86歸屬為C17，而δ 3.79（s，3H）歸屬為H18、3.86（s，3H）歸屬為H19、δ 54.88歸屬為C19、δ 59.77歸屬為C18，δ 152.78歸屬為C16。

HMBC中，H9即2.58～2.63（m，2H）與季碳δ134.03有相關，因此δ 134.03歸屬為C7。根據HMBC中苯環間位強相關規律，6.70～6.72（m，1H）歸屬為H5，對應的δ 107.69歸屬為C5。1H-1HCOSY圖中，6.63～6.66（m，1H）歸屬為H6，對應的δ 121.22歸屬為C6。HMBC中，C8與6.68～6.69（d，1H）和H6有相關，因此6.68～6.69（d，1H）歸屬為H1，對應的108.70歸屬為C1。

HMBC中，δ 152.78即C16與δ 7.02～7.06（m，1H）有強相關，根據HMBC中苯環間位強相關規律，δ7.02～7.06（m，1H）歸屬為H14，對應的δ 123.50歸屬為C14；1H-1HCOSY圖中，δ 6.95～6.96（m，1H）歸屬為H15，對應的δ 111.60歸屬為C15。

HMBC中，與H11相關的低場碳有δ 131.19，C13，C17，因此δ 131.19，歸屬為C12。δ 145.89和δ 147.66與H3有相關，因此δ 145.89和δ 147.66歸屬為C2或者C4。

至此，甲基雜質的結構見圖1、氫譜和碳譜歸屬結果見表1。

4 討論

本研究采用柱層析制備分離了黃連素合成過程中縮合/還原反應產生的甲基雜質并用一維核磁和二維核磁1H-NMR、13C-NMR、DEPT135 o、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC技術解析了此雜質的分子結構，實現了對此雜質的氫譜和碳譜的全歸屬，后續可以對此雜質的進一步質量控制等方面進行研究。

參考文獻

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[6] 陳紹全， 林維鳳， 臧家惠， 等. 黃連素及其鹽類的制備方法：CN01106089[P]. 2001-01-19.