正交試驗優選藏藥肺熱普清配方中水溶性有效成分提取工藝

摘 要 目的：優選肺熱普清配方中水溶性有效成分的提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗法優選提取工藝，以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為指標，考察加水倍數、提取時間、提取次數3個因素對提取工藝的影響。結果：優選的最佳工藝為加12倍水，提取3次，每次1 h。結論：優選的工藝穩定可靠，有效成分轉移率高。

關鍵詞 肺熱普清 提取工藝 正交試驗 羥基紅花黃色素A

中圖分類號：R284.2； R29 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）09-0122-05

引用本文 宋麗莉， 采金金， 尼瑪次仁， 等. 正交試驗優選藏藥肺熱普清配方中水溶性有效成分提取工藝[J]. 上海醫藥， 2024， 45（9）： 122-126.

基金項目：西藏自治區科技廳中央引導地方科技發展項目（XZ202202YD0020C）

Optimization of extraction process of water-soluble active ingredients in the formula of Tibetan medicine Lotse Kunsel by orthogonal test

SONG Lili1，2， CAI Jingjing1，3，4， NIMA Ciren1，5， BAIMA Danzeng1，5， XIE Hebing1，3，4，5

（1. Jiangsu God Monkey Pharmaceutical Research Co.， Ltd.， Nantong 226000， China； 2. School of Pharmacy， Nantong University， Nantong 226000， China； 3. School of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China； 4. Yangtze Delta Drug Advanced Research Institute， Nantong 226000， China； 5. Tibet God Monkey Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shigatse 858300， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the extraction process of water-soluble active ingredients in the formula of Lotse Kunsel. Methods： The yield of dry extract， the transfer rate of hydroxysafflower yellow A and the yield of solid content extracted by ethyl acetate were used as indexes. The effects of water addition ratio， extraction time and extraction times on the extraction process were investigated. L934 orthogonal test was used to optimize the extraction process. Results： The best process was to add 12 times of water and extract three times for 1 hour each. Conclusion： The optimized process is stable and reliable and the transfer rate of active ingredients is high.

KEY WORDS Lotse Kunsel； extraction process； orthogonal test； hydroxysafflower yellow A

肺熱普清散（藏名：洛才更賽）收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥 第一冊》[1]中，為西藏神猴藥業有限責任公司生產的獨家藏藥復方制劑。肺熱普清散由天竺黃、紅花、力嘎都、甘草、鐵棒錘幼苗、訶子等14味藥味組方，具有清肺泄熱、消炎的作用，可用于小兒肺炎、流行性感冒、風熱、癘熱等病癥。本方已有400多年的臨床實踐應用歷史，始載于16世紀時的《驗方百編》，并沿用至今。本方中的檀香、力嘎都具有清熱涼血的療效；麝香、鐵棒錘具有清熱、消炎止痛的療效；訶子調和三因，治三因合并癥；木香、甘草、高山辣根菜具有清熱止咳、行氣止痛的療效。諸藥合用，清肺止咳，消炎止痛[2-5]。肺熱普清散為傳統散劑，全部藥味粉碎后直接入藥，存在易吸潮結塊、味苦、患者依從性較差的問題。為了進一步將其開發成一種安全、有效、依從性高的口服混懸劑，本試驗在對處方組成藥味所含有效物質和主要成分、藥材性質綜合分析的基礎上，將一部分藥材（檀香、木香、丁香、安息香、降香、銀朱、人工麝香）保持原先制備工藝直接粉碎入藥，一部分藥材（紅花、高山辣根菜、力嘎都、訶子、甘草、天竺黃、鐵棒錘幼苗）采用水回流提取浸膏入藥，本實驗以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為指標，采用正交試驗法優選水提取工藝，并進行了3批次的驗證，發現所得最佳提取工藝穩定可靠，有效成分轉移率高，可為該制劑的中試以及大生產提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XSR205DU/AC型十萬分之一天平（梅特勒-托利公司）。

天竺黃（批號220101）與甘草（批號210901）購于安徽援康中藥飲片股份有限公司；紅花（批號20200301）、鐵棒錘幼苗（批號20200301）、高山辣根菜（批號210901）、訶子（批號20200201）以及力嘎都（批號20200401）購自西藏神猴藥業有限責任公司；羥基紅花黃色素A對照品（批號111637-202111，含量96.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司）；磷酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，General Reagent公司）；屈臣氏蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 羥基紅花黃色素A含量測定方法

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 mm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液=30∶70；流速1.0 mL/min；檢測波長403 nm；進樣體積10 mL；柱溫30 ℃。

1.2.2 溶液制備

1）對照品溶液 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度；精密量取2 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇定容，即得。

2）供試品溶液 精密量取提取濾液5 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液。

1.2.3 干浸膏得率測定

精密移取水提取濾液20 mL置已干燥恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱干燥3 h，取出，置干燥器中放置30 min，迅速精密稱定重量；按下式計算干浸膏得率：干浸膏得率（%）=（W1/V1）/（Wt/V2）×100%。式中：W1為測定干浸膏重量（g），V1為取樣體積（mL），Wt為藥材總重量（g），V2為提取液體積（mL）。

1.2.4 乙酸乙酯萃取粗品得率

精密移取水提取液20 mL，每次加入乙酸乙酯60 mL至分液漏斗，萃取3次，振蕩，放置分層，合并有機相，置已恒重的蒸發皿中，放于水浴鍋蒸干，余同1.2.3。

1.2.5 提取工藝正交試驗

分別稱取天竺黃10 g、甘草10 g、力嘎都10 g、紅花10 g、訶子5 g、高山辣根菜5 g、鐵棒錘幼苗1 g，共9份，每份51 g。以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為考察指標，對加水倍數（A）、提取時間（B）、提取次數（D）進行L9（34）正交設計考察，采用綜合評分為考察指標，其中干浸膏得率權重系數0.4、羥基紅花黃色素A轉移率權重系數0.3、乙酸乙酯萃取粗品得率權重系數0.3，即綜合評分=干浸膏得率×40%+羥基紅花黃色素A轉移率×30%+乙酸乙酯萃取粗品得率×30%。因素水平設計見表1。

2 結果

2.1 含量測定方法學驗證

本方法經過方法學驗證，計算得羥基紅花黃色素A線性回歸方程：y=13.711x-23.216（r=1.000）；儀器精密度RSD為0.46%（n=6）；羥基紅花黃色素A重復性的平均含量為0.062 48 mg/mL，RSD為0.70%（n=6）；供試品和對照品溶液在常溫24 h的溶液穩定性實驗中，羥基紅花黃色素A峰的峰面積RSD分別為0.67%、0.58%；加樣回收的平均回收率為100.3%，RSD為0.44%（n=6）。

另外，本方法的專屬性良好，供試品的色譜圖中與對照品相應的位置有相同的色譜峰，相鄰峰之間互不干擾，可作為本工藝的提取方法進行研究（圖1）。

2.2 正交試驗結果

采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，P<0.05提示差異有統計學意義。正交試驗結果及極差R顯示，3個因素的影響大小依次為D>A>B；根據K值可以看出D3>D2>D1，A3>A2>A1，B2>B1>B3（表2）。方差分析結果顯示，加水倍數（A）、提取次數（D）對提取工藝有顯著影響（P<0.05），而提取時間（B）無顯著影響（表3）。B2和B1的K值很接近，從節能與實際工藝生產等方面考慮，結合極差和方差結果，在保證充分提取的前提下，最終確定最佳提取工藝為C3B1A3，即加12倍水，提取3次，每次1 h。

2.3 提取工藝驗證

以最佳工藝進行公斤級3批驗證試驗，結果顯示，3批的平均干浸膏得率為31.34%，RSD為3.52%，羥基紅花黃色素A平均轉移率為66.62%，RSD為1.43%，乙酸乙酯萃取粗品得率為4.72%，RSD為2.15%（表4）。表明此提取工藝合理、穩定可行。

3 討論

3.1 提取工藝的選擇

肺熱普清散的原料藥材有14種，通過對各原料藥材的有效物質和主要成分、藥材性質進行綜合分析，本方的有效物質主要包括難溶性的無機鹽類、難溶性的揮發油以及水溶性的生物堿、黃酮、皂苷、多糖成分。針對水溶性的有效物質，本實驗將部分藥材進行水提取后發現，該工藝穩定、可行，且有效成分轉移率高。而針對難溶性的揮發油，本實驗嘗試了提取揮發油并采用β-環糊精包合的工藝進行固化，結果發現工藝復雜，揮發油的轉移率較低，這可能與本方中所含揮發油的成分較為復雜有關，因此，需要進一步地將揮發油進行分離、精制，得到不同的揮發性成分，再針對性地研究優選環糊精的型號與包合工藝。考慮到工藝的復雜性、產業化的成本、注冊的難易等因素，最終，選擇了一部分藥材水提取浸膏入藥，另一部分藥材保持原粉入藥的工藝不變。

3.2 水提取工藝研究指標的選擇

本試驗進行L9（34）正交設計正交試驗，采用綜合評分為考察指標[6-9]，其中干浸膏得率權重系數0.4、羥基紅花黃色素A轉移率權重系數0.3、乙酸乙酯萃取粗品得率權重系數0.3。干浸膏得率是考察中藥提取工藝的傳統指標且不容忽視，浸膏量不僅決定日服用劑量，還會影響有效成分含量并影響療效，因此將干浸膏得率賦予40%的權重。紅花藥材總量占提取藥材總量約19.6%，占比大；羥基紅花黃色素A是紅花中最具藥理活性的水溶性成分，研究表明羥基紅花黃色素A可顯著降低氣道阻力，改善動態肺順應性和減少炎癥因子等作用；2020版中國藥典明確規定以該成分為含有量測定和質量控制的指標，因此將羥基紅花黃色素A的轉移率賦予30%的權重[10-13]。黃酮類化合物廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中，具有廣譜抑菌性，且不易產生耐藥性；其易溶于諸如甲醇、乙醇和乙酸乙酯等有機溶劑中，水提法提取的黃酮類化合物雜質多，須用乙酸乙酯進一步純化[14]；通過乙酸乙酯萃取粗品得率來反應提取液中黃酮類化合物的含量，因此將乙酸乙酯萃取粗品得率賦予30%的權重。本研究使用多指標評分，避免單一因素對中藥復方提取工藝篩選的局限性和片面性，使分析結果更準確、可靠，保證了提取工藝的合理性。通過正交試驗結果分析，最終確定提取工藝為加12倍水，提取3次，每次1h。經公斤級3批驗證，優選的提取工藝穩定可靠、重復性好，可為肺熱普清混懸劑的中試、大生產提供實驗依據。

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