晉西北酸粥源短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）M-10安全性評估

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.005

引文格式：王琪，楊淑藝，劉鵬帆，等.晉西北酸粥源短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）M-10安全性評估.中國調味品，2024，49（7）：32-37.

WANG Q， YANG S Y， LIU P F， et al. Safety assessment of Levilactobacillus brevis M-10 isolated from sour porridge in northwestern Shanxi.China Condiment，2024，49（7）：32-37.

摘要：從晉西北酸粥發酵液中分離到一株短乳桿菌M-10，發現其具有耐酸、耐膽鹽、抗氧化、抗菌、降膽固醇等多種益生特性。為了更好地應用該菌株，該研究評價了其體外和體內的安全性，包括溶血活性檢測、明膠液化能力測定、硝基還原酶活性測定、吲哚和生物胺生成能力測定、SD大鼠急性毒性和亞急性毒性實驗。經檢測發現，短乳桿菌M-10缺乏溶血活性，不能液化明膠，缺乏硝基還原酶活性，不會生成吲哚，不能產生生物胺，包括酪胺、組胺、尸胺、腐胺等；該菌對SD大鼠的一般體征和血常規指標均無明顯不良影響。以上研究結果表明，短乳桿菌M-10具有很好的安全性。該研究可為后續短乳桿菌M-10作為發酵劑或益生菌的開發奠定基礎。

關鍵詞：晉西北酸粥；短乳桿菌；溶血活性；明膠液化活性；硝基還原酶活性；吲哚測定；生物胺測定；急毒亞急毒實驗

中圖分類號：TS201.3""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1000-9973（2024）07-0032-06

Safety Assessment of Levilactobacillus brevis M-10 Isolated from

Sour Porridge in Northwestern Shanxi

WANG Qi1， YANG Shu-yi1， LIU Peng-fan2， CAI Jin3， QIN Wen-jun4*

（1.School of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030031， China; 2.Jiangxi Lidu Liquor

Industry Co.， Ltd.， Nanchang 331725， China; 3.Institute of Applied Chemistry， Shanxi

University， Taiyuan 030006， China; 4.Department of Nutrition， Shanxi Traditional

Chinese Medical Hospital， Taiyuan 030012， China）

Abstract： A strain of Levilactobacillus brevis M-10 is isolated from the fermentation broth of sour porridge in northwestern Shanxi. It is found that it has various probiotic characteristics such as acid resistance， bile salt resistance， antioxidation， anti-bacteria， lowering cholesterol. In order to better apply this strain， in vitro and in vivo safety is evaluated， including hemolytic activity detection， gelatin liquefaction activity detection， nitroreductase activity detection， indole and biogenic amine production ability detection， acute and subacute toxicity experiments in SD rats. After detection， it is found that Levilactobacillus brevis M-10 lacks hemolytic activity， can't liquify gelatin， lacks nitroreductase activity， can't produce indole or biogenic amines， including tyramine， histamine， cadaverine， putrescine and so on. This strain has no obvious adverse effects on the general physical signs and blood routine indexes of SD rats. The results indicate that Levilactobacillus brevis M-10 has good safety. This study could lay

收稿日期：2024-02-07

基金項目：山西省自然科學研究面上項目（20210302123464）

作者簡介：王琪（1982—），女，山西忻州人，講師，博士，研究方向：微生物與功能食品。

*通信作者：秦文君（1970—），女，山西太原人，教授，碩士，研究方向：慢病及營養干預治療。

foundation for the subsequent development of Levilactobacillus brevis M-10 as fermentation agent or probiotic.

Key words： sour porridge in northwestern Shanxi; Levilactobacillus brevis; hemolytic activity; gelatin liquefaction activity; nitroreductase activity; detection of indole; detection of biogenic amines; acute and subacute toxicity experiments

發酵食品在全球各地都有著悠久的食用歷史。發酵食品易儲存，具有獨特的風味和較高的營養價值，并且部分微生物能夠產生活性物質，有益人體健康。傳統的發酵食品通常是在開放環境中進行自然發酵，其中，微生物的代謝活動與副產物的產生相伴而行，這些副產物可能具有潛在的生物危害，從而影響發酵食品的安全。因此，在制備發酵食品時，除了要注重食品的口感和風味外，還要保證所用微生物的安全性。所以，對發酵微生物進行安全性評價非常重要。

晉西北酸粥是一種以糜米（Panicum miliaceum）為主要原料，在常溫下進行自然發酵得到的家庭作坊式傳統發酵谷物食品。晉西北酸粥具有上千年的食用歷史，不僅酸爽可口、風味獨特，而且具有消食健胃、生津止渴的作用，是當地居民的必備主食。本實驗室前期從晉西北酸粥中獲得一株短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）M-10，并證實其具有體外益生特性。乳酸菌具有長期的安全食用歷史，而且被美國食品藥品監督管理局（FDA）認定為一般公認安全（generally recognized as safe，GRAS），因此很少有人質疑乳酸菌的安全性。然而，近些年的研究報道發現，少數乳酸菌存在安全隱患。例如，乳酸菌在生長過程中會產生一些有害物質，部分菌株具有致病性和耐藥性。在傳統家庭作坊式發酵過程中，發酵環境復雜且不統一，導致同種乳酸菌不同菌株之間的特性可能存在差異。因此，將其投放于發酵生產前，應該評估其安全性，以綜合考慮其可能存在的安全風險。

該研究通過對體外有害代謝產物的檢測和對SD大鼠的影響實驗、體內有害代謝產物的檢測和對SD大鼠的影響實驗，從溶血活性、明膠液化能力、硝基還原酶活性、吲哚生成、生物胺生成、SD大鼠血常規等方面評價了短乳桿菌M-10的安全性。該項研究可為今后短乳桿菌M-10作為具有我國自主知識產權的發酵劑或益生菌的開發提供理論支撐。

1" 材料與方法

1.1" 菌株

短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）M-10是從晉西北酸粥發酵液中分離得到的，與甘油（30%，體積比）等體積混勻后保存于-80 ℃冰箱中。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2" 培養基

1.2.1" MRS液體培養基

參照文獻的制作方法。

1.2.2" MRS固體培養基

在1 L MRS液體培養基中加入20 g瓊脂制成。

1.2.3" 哥倫比亞血瓊脂平板

在1 L蒸餾水中溶解5 g氯化鈉、10 g酪蛋白胰酶消化物、1 g玉米淀粉、5 g酵母浸粉、5 g肉胃酶消化物、15 g瓊脂，將pH值調至7.3，在121 ℃下滅菌15 min。待培養基溫度降至約50 ℃后加入50～100 mL無菌脫纖維羊血，混勻制備平板。

1.2.4" 明膠培養基

將10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g氯化鈉和120 g明膠溶解于1 L蒸餾水中，pH 7.2～7.4，在115 ℃下滅菌30 min。

1.2.5" 生物胺檢測培養基

參照羅強等的方法配制。

1.2.6" 蛋白胨水培養基

將10 g蛋白胨和5 g氯化鈉溶解于1 L蒸餾水中，將pH值調至7.6，在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.7" 硝基還原酶活性檢測培養基

將蛋白胨10 g和硝酸鉀1 g溶解于1 L蒸餾水中，將pH值調至7.4，在121 ℃下滅菌15 min。

1.3" 試劑

組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、5′-磷酸吡哆醛、對二甲氨基苯甲醛、乙醇、濃鹽酸、對氨基苯甲磺酸、α-萘胺等：國藥集團山西有限公司。

α-萘胺（0.1%，質量百分比）：在100 mL乙醇中加入0.1 g α-萘胺，使之充分溶解。

吲哚試劑：在5 mL乙醇（95%，體積比）中加入0.1 g對二甲氨基苯甲醛，再加入2 mL濃鹽酸。現用現配，避光保存。

對氨基苯甲磺酸溶液：在100 mL稀鹽酸（9.5%～10.5%，體積比）中加入1.0 g對氨基苯甲磺酸，充分溶解。

1.4" 主要儀器

JC-100-SE型恒溫恒濕培養箱、YXQ-70A型實驗室高壓蒸汽滅菌鍋、PHS-3C臺式酸度計、U9雙光束紫外可見分光光度計、BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜" 青島精誠儀器儀表有限公司。

1.5" 菌株的活化

將短乳桿菌M-10接種于MRS固體培養基平板，于37 ℃培養24 h，活化3次后使用。

1.6" 溶血活性測定

將接種短乳桿菌M-10的哥倫比亞血瓊脂平板置于37 ℃培養，48 h后觀察菌落周圍情況。金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽性菌株。

1.7" 明膠液化測定

在MRS液體培養基中接種短乳桿菌M-10，于37 ℃培養24 h后，接種（20%，體積比）到5 mL明膠培養基中，在37 ℃培養48 h。于4 ℃放置2 h，觀察明膠是否有液化現象。若液化則為陽性反應。金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽性菌株。

1.8" 硝基還原酶活性測定

將接種短乳桿菌M-10的硝基還原酶活性檢測培養基于37 ℃培養48 h，依次加入α-萘胺溶液和對氨基苯甲磺酸溶液。若培養基由黃色變為藍黑色，則表明菌株具有硝基還原酶活性。大腸桿菌ATCC 25922為陽性菌株。

1.9" 生物胺測定

分別配制含有各種氨基酸（酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸）和5′-磷酸吡哆醛的MRS培養基，其中氨基酸的濃度為0.1%，5′-磷酸吡哆醛的濃度為0.005%。向其中接種短乳桿菌M-10，在37 ℃下培養48 h。連續轉接2次后，再分別劃線到含有氨基酸的生物胺檢測培養基中，觀察培養基在37 ℃下培養72 h后的顏色變化。若培養基呈紫紅色，則表示該菌株能產生胺類物質。大腸桿菌ATCC 25922為陽性菌株。

1.10" 吲哚測定

向蛋白胨水培養基中接種短乳桿菌M-10，于37 ℃培養48 h。向培養基中滴加吲哚試劑，若液面變為玫瑰紅色則代表菌株能產生吲哚。大腸桿菌ATCC 25922為陽性菌株。

1.11" SD大鼠的急毒和亞急毒實驗

將60只SD大鼠（6周，SPF級，（150±10） g，雌雄各30只）喂養1周，待其適應后，按平均體重無差別分為6組，每組10只，急毒實驗組30只，亞急毒實驗組30只。飼料均為普通飼料，每組均不限制飲食，并灌胃短乳桿菌M-10活菌，低劑量組、中劑量組和高劑量組對應的活菌數分別為1.0×108 ，1.0×109 ，1.0×1010" CFU/mL。

急毒實驗組和亞急毒實驗組分別持續1周和2周。每天觀察大鼠的生理活動、中毒狀況、死亡狀況，每周對大鼠的體重和攝食量進行記錄。若死亡，則解剖大鼠后檢查臟器是否受傷。用亞急毒實驗組來測定SD大鼠的血常規指標和臟器（心、肝、脾、肺、腎和胰腺）是否正常。

2" 結果與分析

2.1" 短乳桿菌M-10的溶血活性

溶血性微生物對人類健康的危害較大。聯合國糧農組織規定，食品用微生物不能有溶血活性。由于某些微生物具有溶血基因或者溶血素，不僅能使機體紅細胞溶解，而且會使多種細胞遭到破壞，甚至導致細胞凋亡，從而誘發許多疾病，嚴重者會出現敗血癥，這與菌株本身所攜帶的致病基因有關。大部分乳桿菌沒有溶血性，但是少部分的溶血現象在近些年被發現，例如Argyri等從發酵橄欖中檢測出的4株乳桿菌都有溶血性。因此，非常有必要對乳桿菌的溶血活性進行檢測。微生物有3種溶血類型，分別是紅細胞未完全溶解，菌落周圍有草綠色溶血圈，對人體致病性較低（α-溶血）；紅細胞完全溶解，菌落周圍有透明溶血圈，對人體致病性強（β-溶血）；紅細胞無損害，菌落周圍無溶血圈（γ-溶血）。

由圖1可知，透明圈出現在金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌落周圍，即β-溶血。但短乳桿菌M-10菌落周圍不僅沒有透明圈，而且也沒有草綠色環，說明短乳桿菌M-10不具有溶血活性。Nath等檢測分離自發酵乳制品中的植物乳桿菌，發現該菌無溶血環。萬倩等檢測的分離自傳統發酵食品中的38株乳酸菌均無溶血活性。閆肅等發現，分離自商品、發酵蘿卜和發酵面團的48株乳酸菌中，大部分沒有表現出明顯的溶血特性。可見，不同乳酸菌的溶血活性不同。

2.2" 短乳桿菌M-10的明膠液化

細菌若能產生明膠酶，就能將明膠分解成液態，從而使明膠培養基從半固態變成液態，稱為明膠液化。明膠酶又稱類蛋白水解酶，它可以將機體中的膠原蛋白等物質分解，從而影響機體正常的生理機能。能液化明膠的菌株大多為致病菌。因此，評價乳酸菌安全性的一個重要指標就是測定明膠的液化情況。

由圖2可知，陽性對照培養基呈液態，表面平整，流動性強，說明菌株具有明膠液化能力。與此相反的是，接種短乳桿菌M-10的培養基呈半凝固、不流動狀態，表面呈傾斜狀，表明短乳桿菌M-10缺失液化明膠的能力。萬倩等檢測的38株乳酸菌都沒有出現明膠液化的現象。 Goswami等分離了印度傳統發酵油菜籽中的LAB，并對其明膠液化能力進行了檢測，發現其也不能液化明膠。Olubode等證實分離自發酵牛乳中的LAB不能液化明膠。之前這些發現證明了來自食用歷史悠久的發酵食品的LAB不存在分解明膠的風險。但是閆肅等發現，羊奶、扇貝、牡蠣和發酵面團中的部分乳酸菌對明膠表現出較強的降解能力。

2.3" 短乳桿菌M-10的硝基還原酶活性

亞硝酸鹽可以與食品中蛋白質的中間產物仲胺反應，形成強致癌物亞硝胺，而亞硝酸鹽是由硝酸鹽被硝基還原酶還原后產生的。所以，評價菌株安全性的一個必不可少的環節就是檢測其是否具有硝基還原酶活性。

由圖3可知，大腸桿菌ATCC 25922的培養物在滴加α-萘胺溶液和對氨基苯甲磺酸溶液后，顏色由黃色轉為藍黑色，顯示硝基還原酶陽性。但接種短乳桿菌M-10的培養基顏色并未改變，說明短乳桿菌M-10不具有硝基還原酶活性，也不會產生亞硝酸鹽，危害人體健康。林楊等發現，新疆傳統發酵乳制品的12株乳酸菌中都不會產生硝基還原酶。

2.4" 短乳桿菌M-10的生物胺產生情況

生物胺是一類分子質量低的含氨基的堿性有機化合物，是乳酸菌發酵食品中的常見物質。適量的生物胺可以維持機體正常的生理功能，有效提升機體的免疫力，維持腸道的穩定性，因為它們是核酸、激素、生物堿等物質的前體。Yen等通過試驗發現，尸胺、亞精胺、腐胺、酪胺能有效清除自由基，從而發揮抗氧化作用，并且該抗氧化功效與濃度呈正相關。

生物胺的毒性閾值無確定數值，該物質毒性的大小與機體的健康水平相關。正常人攝入少量生物胺后，可以被自身產生的胺氧化酶降解，不會對機體產生毒性。但對有遺傳缺陷者、患有腸道疾病者、酒精過量攝入者而言，少量生物胺不能被快速清除，這會導致機體受到不同程度的損害。更嚴重的是，過量的生物胺對人體具有一定的毒性，產生如神經性疾病、盜汗、鼻腔灼熱等癥狀。已有研究證實，生物胺的攝入量為8～40 mg就會出現輕微中毒癥狀；當攝入量達到40 mg以上就會出現中等中毒癥狀；若攝入量超過100 mg則會導致嚴重的中毒反應，例如末梢血管擴張引起高血壓、通過控制胃酸產生促進胃腸道肌肉收縮進而引起腹部抽筋、嘔吐等。酪胺引起末梢血管收縮使心率加快，同時升高血糖濃度，降低去甲腎上腺素的含量，繼而誘發偏頭疼。尸胺和腐胺能誘導機體的血壓降低。酪胺是機體中的致突變前體物質。

若乳酸菌具有氨基脫羧酶活性，則會以氨基酸為前體生成生物胺，如組胺、腐胺、尸胺、酪胺等。對于發酵食品而言，生物胺含量過高會影響食品的風味。因此，檢測生物胺是評價乳酸菌安全性非常重要的指標。

由圖4可知，陽性菌株培養基的顏色由黃色變成了紫紅色，說明其產生了生物胺，可見其具備氨基脫羧酶活性；短乳桿菌M-10菌落周圍培養基的顏色并未發生改變，說明其不會產生對人體有害的生物胺，即沒有氨基脫羧酶活性。現有分類學觀點認為，物種之間的親緣關系越近，其生理特性越相似。Chen等用L. brevis CICC 6239發酵越橘汁，發現生物胺的產量很少，其中組胺是主要的種類，而產生它們的氨基酸在發酵第3天就被完全利用。盡管如此，由于同一物種的不同菌株之間的遺傳特征多樣，在對微生物安全性進行評估時，應充分考慮菌株之間的差異。在不同乳酸菌菌株之間，遺傳多樣性差異則更明顯。Bao等發現，發酵豆腐過程中添加L. brevis不僅不會產生生物胺，反而會減少組胺的產生。閆肅等發現，分離自商品、發酵蘿卜和發酵面團的48株乳酸菌中，只有2株菌不產生物胺。林楊等發現，新疆傳統發酵乳制品的12株乳酸菌中，只有2株產生物胺。

2.5" 短乳桿菌M-10的吲哚產生情況

大腸桿菌等細菌由于具有色氨酸酶從而能分解色氨酸，產物是吲哚。色氨酸是機體的必需氨基酸，若其代謝受阻，可誘發肝功能衰退、惡性腫瘤發生等。所以，通過觀察吲哚與對二甲基氨基苯甲醛作用后是否出現玫紅色來判斷菌株能否分解色氨酸。

由圖5可知，液面出現玫瑰紅色的陽性對照大腸桿菌具備分解色氨酸、產生吲哚的能力。而短乳桿菌M-10在生長過程中液面無任何變化，未出現分解色氨酸產生吲哚的現象，即無色氨酸酶。萬倩等檢測的38株乳酸菌均沒有產生吲哚。Lin等對中國臺灣地區傳統發酵芥菜中的LAB產生吲哚情況進行檢測，結果是陰性。王夢姣等檢測了傳統發酵馬奶中的腸球菌屬，發現其不會產生吲哚。

2.6" SD大鼠的一般體征觀察和血常規結果

急毒性實驗用來判斷樣品毒性的強弱，是樣品安全性評價的第一步。通過短乳桿菌M-10對SD大鼠進行急毒和亞急毒實驗，結果表明SD大鼠的生長正常，毛色干燥光亮，精神良好，排泄無異常，無死亡病例。對照組和活菌組在心、肝、脾、肺、腎和胰腺的顏色、性狀和重量方面均無顯著差異（Pgt;0.05），即短乳桿菌M-10無急性毒性，這一結果與胡金麗等、熊江等和劉博等的結果一致。

血常規和身體健康息息相關。灌胃短乳桿菌M-10后SD大鼠的血常規結果見表1。在白細胞指標中，活菌組（高劑量組、中劑量組和低劑量組）的白細胞數、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比和白細胞單核細胞比例與對照組并無明顯差異（Pgt;0.05），表示大鼠免疫功能無異常。對于紅細胞，其攜帶氧的多少取決于血紅蛋白的多少，若血紅蛋白過低則會出現貧血癥狀。本研究結果顯示，活菌灌胃組與對照組大鼠在紅細胞指標方面均未出現明顯差異（Pgt;0.05）。由于血小板的作用，血液凝固的時間能縮短。本研究結果中，活菌灌胃組與對照組大鼠在平均血小板體積指標上沒有統計學差異（Pgt;0.05）。綜上，短乳桿菌M-10對大鼠的免疫功能和血小板均無不良影響。

3" 結論

本研究首次初步評估了短乳桿菌M-10的安全性。研究顯示，短乳桿菌M-10在不產生生物胺（酪胺、腐胺、組胺、尸胺）和吲哚的同時，不具有溶血活性，無液化明膠能力，缺失硝基還原酶，對SD大鼠的一般體征和血常規無任何副作用。綜上所述，該菌是安全的，可為其作為益生菌的下一步應用打下基礎。

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