黃芩苷對單增李斯特菌誘導巨噬細胞炎性小體激活的抑制作用

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.04.008

摘要：為研究黃芩苷對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes， LM）活化的小鼠巨噬細胞炎性小體的影響，用四唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法確定黃芩苷最適質量濃度梯度，選用25、50、100 μg/mL的黃芩苷分別與LM處理巨噬細胞，檢測細胞炎性小體相關蛋白或mRNA表達水平以及乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase， LDH） 釋放量.結果顯示：黃芩苷劑量依賴性地下調了LM處理后的IL-1β、caspase-1 p10蛋白水平，LDH的釋放量以及NLRP3、NLRC4、NLRP10、NOD、AIM2、caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平.因此推測，黃芩苷可以通過抑制LM誘導巨噬細胞內不同炎性小體的激活，進而抑制巨噬細胞炎癥因子的釋放及細胞死亡.

關鍵詞：黃芩苷；單增李斯特菌；炎性小體；巨噬細胞

中圖分類號：R392.5文獻標志碼：A文章編號：10001565（2024）04039907

Inhibition of baicalin on macrophage inflammasome

activation induced by Listeria monocytogenes

LIU Wen， ZHANG Enhua， CHEN Yingying， ZHANG Zonghao， ZHANG Weiwei， LI Wenyan

（School of Basic Medical Sciences， Hebei University，Baoding 071000， China）

Abstract： In order to study the effect of baicalin on the inflammasome of mouse macrophages activated by Listeria monocytogenes （LM）， the optimal concentration gradient of baicalin was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide （MTT） method. Then macrophages were treated with LM and baicalin at concentrations of 25， 50 and 100 μg/mL， respectively， to detect the expression level of inflammasome-related protein or mRNA and lactate dehydrogenase （LDH） release. The results showed that baicalin reduced IL-1β， caspase-1 p10 protein levels， LDH release and mRNA levels of NLRP3， NLRC4， NLRP10， NOD， AIM2， caspase-1， IL-1β and IL-18 after LM treatment in a dose-dependent manner. Therefore， it is speculated that baicalin can inhibit the release of inflammatory factors and cell death in macrophages by inhibiting the activation of different inflammasome in macrophages induced by LM.

Key words： baicalin; Listeria monocytogenes; inflammasome; macrophage

單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes， LM） 是一種人獸共患病原菌，被世界衛生組織列舉為四大食源性病原菌之一［1-2］.LM也是李斯特菌眾多類型中唯一能引起人類李斯特菌病的病原體，其易感人群為孕婦、

收稿日期：20231225;修回日期：20240327

基金項目：河北省衛生健康委醫學科學研究課題計劃（20210111）；河北大學醫學學科培育項目（2022X02）；研究生創新資助項目（HBU2024SS003）；

第一作者：劉雯（1997—），女，河北大學在讀碩士研究生，主要從事生殖生物學方向研究.E-mail：liu273993@163.com

通信作者：李文艷（1973— ），女，河北大學副教授，博士，主要從事生殖生物學方向研究.E-mail：liwenyan358@163.com

老人、新生兒等免疫力低下的人群，感染后常導致細菌性敗血癥、腦膜炎、孕婦流產和新生兒細菌性腦炎等疾?。?-3］，目前的治療藥物主要是抗生素，但容易引發副作用和細菌耐藥性［4-5］.研究顯示，中藥成分黃芩苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗變態、促進 T 細胞增殖等免疫調節的特性［6-7］，同時炎性小體過度激活引發的炎癥反應和細胞死亡是LM致病的主要因素之一［8］，而黃芩苷對LM誘導的炎性小體激活和細胞損傷的影響鮮見報道.因此，本研究通過體外實驗分析了黃芩苷對LM誘導的巨噬細胞炎性小體激活和細胞死亡的抑制作用，為李斯特病的防治提供參考.

1材料與方法

1.1細胞系及菌株

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞Raw264.7購自北京中國醫學科學院基礎醫學研究所；菌株 Listeria monocytogenes EGD （serovar 1/2a） 由日本京都大學醫學研究科微生物系 Dr. Masao Mitsuyama 惠贈.

1.2實驗試劑

黃芩苷、DMEM 高糖培養基、Western-blot所用試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；TransZol、EasyScript Frist-Strand cDNA Synthesis SuperMix、預染蛋白Marker購自北京全式金生物技術有限公司；乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase， LDH） 細胞毒性試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;β-actin 抗體、Goat Anti-Rabbit lgG （H+L） HRP抗體購自Abways公司;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1 （caspase-1） 抗體購自Abcam公司;MaxiLumin-WB皮克級化學發光底物購自北京百智生物科技有限公司;ELISA試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司.

1.3MTT法檢測黃芩苷對巨噬細胞的藥物毒性

待Raw264.7細胞密度達到80%～90%時，消化、離心、計數后按1×104/孔接種于96孔板，次日，對細胞給予不同質量濃度和時間梯度處理，處理質量濃度分別為0、25、50、100、200、400 μg/mL，作用24、36、48 h后用四唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理，酶標儀檢測450 nm的吸光度.

1.4細胞細菌共培養

將生長良好的Raw264.7按2×105/孔接種于6孔板，按實驗要求隨機分為6組，次日待細胞貼壁，黃芩苷+ LM感染組以換液的形式加入低/中/高劑量 （25、50、100 μg/mL） 黃芩苷，其余組進行正常換液處理并放入細胞培養箱繼續培養24 h.之后，control組換液處理，LM感染組和黃芩苷干預組用處在對數生長期的LM懸液以MOI = 1∶100細胞細菌共培養40 min后用含25 μg/mL慶大霉素的培養基培養細胞1 h，同時脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） +腺苷三磷酸（adenosine triphosphate， ATP）陽性對照組中加入LPS （終質量濃度為0.5 μg/mL），放入細胞培養箱中繼續培養4 h，再加入ATP （終濃度為5 mmol/L） 刺激1 h.

1.5ELISA實驗分析巨噬細胞中IL-1β的水平

黃芩苷和LM處理細胞后，收集培養基至無菌離心管中，捕獲抗體對96孔板包被過夜，封閉液37 ℃封閉2 h.每孔加入50 g/L的脫脂牛奶稀釋的離心后的培養基100 μL ，然后依次加入檢測抗體、酶標抗體分別孵育2 h，顯色后，采用酶標儀讀取450 nm波長的吸光度 （A450），繪制標準曲線，計算白細胞介素-1β （Interleukin-1β， IL-1β） 的濃度.

1.6蛋白免疫印跡實驗分析巨噬細胞中caspase-1 p10的水平

黃芩苷和LM處理后的細胞在4 ℃搖床裂解過夜，次日離心取上清液待用.樣品經質量分數10% SDS-PAGE電泳后，采用濕轉法將膠上分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后分別用稀釋500倍的羊抗鼠caspase-1抗體和稀釋1 000倍的堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase， AP） 標記的兔抗羊IgG-AP抗體進行抗原抗體反應，通過底物NBT和BCIP顯色，用掃描儀掃描結果.

1.7qPCR檢測巨噬細胞中炎性小體相關基因mRNA水平

黃芩苷和LM處理細胞，Trizol法提取總RNA，按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒要求反轉錄合成第1條cDNA，以此為模板，對混合的cDNA進行10倍稀釋、分析其熔解曲線和擴增效率，確定cDNA的最適稀釋倍數；按照確定的cDNA濃度對樣品分別進行qPCR擴增以檢測黑素瘤缺乏因子2 （absent in melanoma 2， AIM2）、核苷酸結合寡聚結構域NOD樣受體家族蛋白4 （the NOD-like receptor family CARD domain containing protein 4， NLRC4）、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 （NOD-like receptor pyrin domain containing 3， NLRP3）、富含亮氨酸重復結構域蛋白10 （NLR family pyrin domain containing 10， NLRP10）、核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2 （nucleotide-binding oligomerization domain 2， NOD2）、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平，引物序列如表1所示.采用2-ΔΔCt方法進行數據處理.

1.8LDH細胞毒性試劑盒檢測巨噬細胞死亡率

黃芩苷和LM處理細胞后，收集培養基以評估由于細胞死亡引起的LDH釋放量，用凍融法裂解細胞，在490 nm處測定吸光度，評估最大LDH活性，計算細胞死亡率.

細胞毒性或死亡率 =處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度細胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度×100%.

1.9統計學分析

所有實驗均需獨立重復3次，實驗數據用SPSS 22.0進行統計處理，結果用平均值 ± SEM （x±s） 表示，P＜0.05表示有統計學意義.

2結果與分析

2.1不同質量濃度的黃芩苷對巨噬細胞活性的影響

用不同質量濃度的黃芩苷 （0、25、50、100、200、400 μg/mL）處理Raw264.7細胞24、36、48 h，使用MTT法檢測各組細胞活性，結果如圖1所示.由圖1可知，與空白組 （0 μg/mL） 相比，質量濃度為25、50、#表示與24 h空白對照組相比差異顯著 （Plt; 0.05）;

*表示與36 h空白對照組相比差異顯著 （Plt;0.05）；

△表示與48 h空白對照組相比差異顯著 （Plt;0.05）

圖1黃芩苷對Raw264.7細胞活性的影響

Fig.1Effect of baicalin on Raw264.7 cell" viability100 μg/mL的黃芩苷在24 h后對細胞活性沒有明顯的影響，除25 μg/mL的黃芩苷作用36 h對細胞活性沒有明顯的影響外，其余質量濃度黃芩苷作用36、48 h后均明顯降低了細胞活性 （P＜0.05）.因此，實驗選取25、50、100 μg/mL作用24 h作為黃芩苷用藥質量濃度和作用時間.2.2黃芩苷對LM刺激的巨噬細胞炎性小體激活的影響

為研究LM對巨噬細胞炎性小體的激活，進而促進caspase-1 p10和IL-1β的釋放量，以及黃芩苷對LM刺激后的巨噬細胞的影響，用LM和不同質量濃度的黃芩苷處理Raw264.7細胞，通過ELISA和Western blot分別檢測培養基中IL-1β和細胞裂解液中caspase-1 p10的水平，結果如圖2所示.由圖2可知，與control組相比，LM組和LPS+ATP陽性對照組的IL-1β和caspase-1 p10的水平顯著升高，低＼中＼高質量濃度黃芩苷干預組與LM感染組相比，IL-1β和caspase-1 p10水平明顯降低 （P＜0.05）.a、b.分別為 caspase-1 p10相對水平的電泳圖和柱狀統計圖；c." IL-1β的相對水平

#表示與空白對照組相比差異顯著 （Plt;0.05）; △表示與LM組相比差異顯著 （Plt;0.05）

圖2黃芩苷和LM處理后Raw264.7細胞中caspase-1 p10水平和培養基中IL-1β水平

Fig.2Caspase-1 p10 levels in Raw264.7 cell and IL-1β levels in culture medium after treated with baicalin and LM

2.3黃芩苷對LM刺激后炎性小體介導的巨噬細胞死亡的影響

為驗證黃芩苷可通過炎性小體途徑抑制LM誘導細胞死亡，用LM、黃芩苷和caspase-1抑制劑VX-765處理Raw264.7細胞，檢測LDH釋放量.結果顯示：LM感染組和LPS+ATP陽性對照組的LDH釋放量明顯高于control組；黃芩苷干預治療組與LM感染組相比，雖然低劑量黃芩苷干預組LDH的釋放量沒有明顯差異，但中劑量和高劑量黃芩苷干預組LDH釋放量明顯降低 （圖3a）.說明LM誘導了Raw264.7細胞死亡，黃芩苷對LM誘導的Raw264.7細胞死亡具有抑制作用.為驗證LM誘導細胞的死亡與LM誘導caspase-1激活的關系，用caspase-1抑制劑VX-765和高質量濃度黃芩苷 （100 μg/mL）處理細胞后進行細胞細菌共培養，收集培養基，離心后檢測LDH含量.結果顯示：加入VX-765的LM感染組LDH釋放量明顯低于LM感染組 （圖3b），說明LM誘導的細胞死亡依賴于caspase-1的激活；與加入黃芩苷的LM感染組相比，加入VX-765的LM感染組和黃芩苷加VX-765共處理的LM感染組LDH釋放量沒有明顯變化 （圖3b），推斷黃芩苷可能是通過介導caspase-1途徑抑制了LM誘導的細胞死亡.a.黃芩苷和LM處理；b.加入VX-765處理

#表示與空白對照組相比差異顯著 （Plt;0.05）; △表示與LM組相比差異顯著 （Plt;0.05）

2.4黃芩苷對LM刺激的巨噬細胞炎性小體相關基因mRNA表達水平的影響

為探究黃芩苷對LM激活的炎性小體的抑制途徑，用黃芩苷和 LM 處理小鼠巨噬細胞后，通過qPCR技術檢測炎性小體相關基因mRNA表達水平，結果如圖4所示：LM能促進巨噬細胞中炎性小體感受器分子NLRP3、NLRC4、NLRP10、NOD2、AIM2和炎性小體相關基因caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表達水平；黃芩苷干預組的上述mRNA表達水平均呈質量濃度依賴性降低 （P＜0.05），說明LM能促進巨噬細胞NLRP3、NLRC4、NLRP10、NOD2及AIM2等炎性小體mRNA的表達，而黃芩苷對LM誘導的上述炎性小體mRNA的表達具有抑制作用.a. caspase-1 mRNA; b. IL-18 mRNA ;c. IL-1β mRNA; d. AIM2 mRNA; e. NLRC4 mRNA;

f. NLRP3 mRNA; g. NLRP10 mRNA; h. NOD2 mRNA

#表示與空白對照組相比差異顯著 （Plt;0.05）; △表示與LM組相比差異顯著 （Plt;0.05）

3討論

當機體受到病原菌入侵或內環境紊亂時，機體的固有免疫細胞能通過模式識別受體感應相關配體受體，防御危險因素入侵和維持機體穩態.炎性小體是細胞內固有免疫系統的關鍵哨兵，是細胞內的模式識別受體感受分子相關模式后形成的多蛋白復合體［9］，由信號受體、ASC和pro-caspase-1組成［10］.信號受體識別病原體相關分子模式和危險信號分子后，通過ASC招募并激活pro-caspase-1，激活的caspase-1誘導炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，產生免疫應答，但過度激活會誘發細胞死亡和機體產生疾病［11-12］.已有研究［8］證實LM可通過激活巨噬細胞炎性小體誘發疾病，但黃芩苷對LM誘導的炎性激活是否有影響鮮見報道.因此，本實驗用黃芩苷和LM處理巨噬細胞，通過檢測炎性小體激活的2種代表性蛋白IL-1β和caspase-1 p10水平，研究了黃芩苷對LM誘導的巨噬細胞炎性小體激活的抑制作用，從炎性小體的角度分析了中藥成分黃芩苷對李斯特病的防治作用，為李斯特病的中醫防治提供了新思路.

炎性小體的激活會誘導細胞的死亡從而誘發疾病，細胞死亡過程伴隨著細胞膜的破壞，從而導致細胞質內酶活性較為穩定的LDH釋放到細胞外［13］，因此可通過檢測釋放到培養基中的LDH對細胞存活量進行定量分析.前期實驗已經證實，LM激活炎性小體可誘導巨噬細胞的死亡，但黃芩苷是否對LM誘導的巨噬細胞死亡具有保護作用還不清楚，為驗證黃芩苷是否通過抑制LM誘導的炎性小體激活來抑制巨噬細胞死亡，實驗在LM和黃芩苷處理細胞的同時，加入caspase-1抑制劑VX-765，通過LDH釋放量檢測細胞存活率.已知VX-765是一種安全有效的caspase-1分子抑制劑，它能通過抑制caspase-1的活化，減弱細胞膜的通透性，抑制促進炎性因子的釋放，從而抑制細胞死亡和炎癥反應的擴大［14-15］.結果表明，黃芩苷與VX-765作用效果相似，推斷黃芩苷可通過抑制LM誘導的炎性小體激活抑制巨噬細胞死亡，從而對LM誘發的李斯特病起到防治作用.

目前已被發現的炎性小體信號受體大致包括3類：NLRs家族的部分成員、AIM2和 RIG-I［16-17］.根據信號受體的不同，炎性小體可分為多種，如NLRP3、NLRC4、AIM2等［18］.有大量研究［8-9］已證實LM感染宿主能激活NLRP1、NLRP3、NLRP6、AIM2等炎性小體引發機體炎癥反應誘導疾病的發生，但黃芩苷通過抑制LM誘導的哪些炎性小體激活發揮作用還鮮見報道，因此通過qPCR實驗檢測了炎性小體相關基因的mRNA表達水平，實驗結果顯示，LM能夠上調巨噬細胞中NLRP3、NLRC4、NLRP10、NOD2、AIM2，caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表達水平，黃芩苷干預組降低了上述炎性小體相關基因的表達水平.推測黃芩苷可通過抑制NLRP3、NLRC4、NLRP10、NOD2、AIM2等基因mRNA的表達水平抑制LM誘導炎性小體的激活，從而抑制caspase-1的切割和炎性因子IL-1β的成熟，改善細胞死亡現象，進而對李斯特病的防治發揮作用.

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（責任編輯：趙藏賞）