GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析用于肺結核臨床診斷的效果

【摘要】 目的：觀察結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（GeneXpert MTB/RIF）聯合外周血細胞分析用于痰涂片陰性可疑肺結核（TB）臨床診斷的效果。方法：選取吉安市第一人民醫院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片陰性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細胞分析檢測，對CD45+CD3+、CD4+CD45+及CD163+進行分析，患者均經痰培養及菌種鑒定是否為肺結核。分析GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細胞分析診斷痰涂片陰性可疑TB的價值。結果：66例患者中，36例可疑肺結核經痰培養、菌種鑒定確診為TB患者（TB組），30例患者為非TB者（非TB組）。GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%。TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+高于非TB組，差異均有統計學意義（P<0.05）。受試者操作特征（ROC）曲線分析結果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的曲線下面積（AUC）高于單獨檢測，差異均有統計學意義（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度為92.87%。結論：GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細胞分析聯合診斷痰涂片陰性可疑TB的價值顯著，檢出率較高。

【關鍵詞】 核酸擴增體系檢測 肺結核 血細胞分析 診斷 痰涂片

Effect of GeneXpert MTB/RIF Combined with Peripheral Blood Cell Analysis for the Clinical Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis/GUO Douhua， YIN Yingying， LI Yue. //Medical Innovation of China， 2024， 21（19）： -147

[Abstract] Objective： To observe the effect of Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin resistance real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection （GeneXpert MTB/RIF） combined with peripheral blood cell analysis for the clinical diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis （TB） with sputum smear negative. Method： A total of 66 sputum smear negative suspected TB patients admitted to Ji’an First People's Hospital from October 2022 to September 2023 were selected. All patients underwent GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for CD45+CD3+， CD4+CD45+ and CD163+， and patients were identified by sputum culture and strain indentification for tuberculosis. The value of GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for diagnosing sputum smear negative suspected TB was analyzed. Result： Among 66 patients， 36 patients with suspected pulmonary tuberculosis were diagnosed as TB patients （TB group） by sputum culture and strain identification， and 30 patients were non-TB patients （non-TB group）. GeneXpert MTB/RIF was detected in 30 positive patients， with a detection rate of 83.33%. The CD45+CD3+ of TB group was lower than that of non-TB group， CD4+CD45+ and CD163+ were higher than those of non-TB group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The results of receiver operating characteristic （ROC） curve analysis showed that the area under the curve （AUC） of the combination of CD4+CD45+， CD45+CD3+， CD163+ and GeneXpert MTB/RIF detection was higher than that of single detection， the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of GeneXpert MTB/RIF combined with peripheral blood cell analysis （CD4+CD45+， CD45+CD3+ and CD163+） was 92.87%. Conclusion： GeneXpert MTB/RIF detection and peripheral blood cell analysis combined with sputum smear negative suspected TB has significant value and high detection rate.

[Key words] Nucleic acid amplification detection Tuberculosis Blood cell analysis Diagnosis Sputum smear

First-author's address： Department of Clinical Laboratory， Ji’an First People's Hospital， Ji’an 343000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.19.033

肺結核（TB）是結核分枝桿菌（MTB）感染所致的慢性傳染性呼吸道疾病。全球結核病流行病學調查資料顯示，2017年全球有1 000萬新發結核病患者，其中中國占據9%，每年死于結核病的人數約為其他寄生蟲病及傳染病總和的2倍[1]。傳統的結核病實驗室診斷方式包括痰涂片鏡檢、比例法藥敏試驗及羅氏固體培養法等，敏感度較低且需要較長時間，無法及時為臨床提供有價值的參考依據[2-4]。隨著分子生物學技術的快速發展，在2010年世界衛生組織推薦核酸檢測作為TB診斷的創新技術，目前已在較多研究中應用[5]。美國在熒光定量檢測的基礎上率先開發了結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（GeneXpert MTB/RIF），它能在2 h內完成檢測，且檢出率高[6]。GeneXpert MTB/RIF操作簡單快速、對實驗條件要求低，世界衛生組織于2011年批準該檢測用于診斷結核病[7]。但目前對于痰涂片陰性TB，GeneXpert MTB/RIF診斷價值尚不清楚。近年來，外周血細胞分析逐漸被用于診斷TB[8]，但臨床報道比較少，其對于于痰涂片陰性TB診斷價值不明，本研究主要分析GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析用于痰涂片陰性TB臨床診斷的效果，為臨床診斷TB提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉安市第一人民醫院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片陰性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF及外周血細胞分析檢測；臨床診斷標準：具有肺結核可疑癥狀且有密切接觸史；痰涂片陰性[9]。（1）納入標準：痰涂片陰性疑似TB；臨床資料完整；年齡≥18歲；均經痰培養及菌種鑒定是否為肺結核。（2）排除標準：妊娠期或哺乳期；惡性腫瘤；免疫系統疾病；無法配合完成本研究；合并其他呼吸系統疾病；合并其他可能影響免疫功能的疾病。患者及患者家屬均知情本研究且簽署研究同意書。本研究獲得吉安市第一人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 痰培養及菌種鑒定 所有患者均進行痰培養及菌種鑒定確診TB：治療前采集清晨痰、夜間痰和即時痰標本，用無菌生理鹽水反復漱口2或3次后，取深部痰液咳出液并棄掉第1次痰液，取1或2口，將3次痰標本混合后留置無菌盒，30～60 min內立即送檢，取2 mL痰標本離心，隨后取0.5 mL沉淀物放置于MGIT培養管內，于37 ℃培養箱內進行培養；第2天起觀察MTB的生長情況，采用手工讀數儀讀取結果，陰性培養管繼續培養和讀管6周。菌種鑒定：通過硝基苯甲酸（PNB）生長實驗、耐熱觸酶實驗、28 ℃生長實驗、菌落顏色、細菌的生長速度等實驗鑒定。若PNB（+）、耐熱觸酶（+）、28 ℃（+）、菌落顏色有或無、生長速度為≤28 d，則為非結核分枝桿菌；若PNB（-）、耐熱觸酶（-）、28 ℃（-）、菌落顏色無、生長速度為>28 d，則為結核分枝桿菌。

1.2.2 GeneXpert MTB/RIF檢測 將痰取樣同時進行GeneXpert MTB/RIF檢測，全自動GeneXpert儀器及試劑盒均購自廣州達安公司，嚴格按照試劑盒說明書，取痰標本進行檢測，2 h后讀取結果。當內對探針的循環閾值≤40時判斷為陽性，若≥3個探針的循環閾值≤40為檢測出MTB。結核分枝桿菌的檢測結果分為未檢出、極低、低、中、高5個等級[10]。

1.2.3 外周血細胞分析檢測 采集清晨空腹靜脈抗凝血4 mL，加入混合抗體（CD45、CD3、CD163、CD4，購自深圳唯公生物有限公司），加入紅細胞裂解液2 mL，離心以2 000 r/min速度，離心5 min，離心半徑15 cm，去上清后加入磷酸鹽緩沖液2 mL，后采用流式細胞儀（廠家：美國BD公司，型號，BD-accuri-C6）對CD45+CD3+、CD4+CD45+進行分析，采用酶聯免疫吸附法對CD163+進行分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；定性資料用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗；受試者操作特征（ROC）曲線下面積（AUC）之間比較采用Z檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰培養及菌種鑒定結果

66例患者中，36例可疑TB經痰培養、菌種鑒定確診為TB患者（TB組），30例患者為非TB患者（非TB組）。

2.2 TB組與非TB組基線資料比較

非TB組30例中男15例，女15例；年齡28～86歲，平均（49.76±8.12）歲；平均體重指數（22.35±1.02）kg/m2。TB組36例中男17例，女19例；年齡28～85歲，平均（50.23±8.02）歲；平均體重指數（22.34±1.10）kg/m2。兩組性別、年齡及體重指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.3 GeneXpert MTB/RIF檢出情況

36例痰涂片陰性TB患者，GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%。

2.4 外周血細胞分析情況

TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.5 GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析結果診斷TB的效能

ROC分析結果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的AUC高于單獨檢測，差異均有統計學意義（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度為92.87%。見圖1、表2。

3 討論

TB是由一類獨立于麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌外的MTB復合群引起，廣泛分布于水源、灰塵等自然環境中，可誘發人體肺、中樞神經、皮膚等組織或器官感染，尤以肺部感染癥狀顯著，可導致患者出現胸悶、咯血等嚴重呼吸道癥狀，危及患者的生命安全[10-12]。隨著醫療科技的不斷進步與完善，TB感染的檢出率逐年升高，但臨床診療中仍存在較高的誤診、漏診率[13]。既往研究證實，Xpert MTB/RIF檢測法應用于痰涂片陰性結核病的診斷價值較高[14]。本研究發現，36例TB患者中，GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%，提示GeneXpert MTB/RIF檢出TB的價值較高，符合既往研究[11]。

CD45+CD3+是指在免疫細胞表面上同時表達CD45和CD3的一類淋巴細胞。CD45是一種常見的白細胞抗原，CD3則是T細胞受體復合物的一部分，主要存在于成熟的T細胞表面。在肺結核的情況下，免疫細胞可能會發生變化，包括T細胞的活化和增殖[15-16]。CD45+CD3+細胞的增多可能反映了機體對MTB的免疫應答，在結核病的發病過程中，T細胞參與了由宿主的細胞因子介導的免疫應答，這也是肺結核病理過程中的一個重要方面，因此，CD45+CD3+細胞可以反應肺結核患者免疫狀態[8]。CD4+CD45+T細胞屬于調節性T細胞，CD45存在于所有有核造血細胞中，而CD4是輔助性T細胞表面的一種共受體蛋白[17]。CD4+T細胞是一種在適應性免疫應答中起關鍵作用的免疫細胞[18]。它們通過分泌細胞因子和激活其他免疫細胞來幫助協調和調節免疫反應，當患者被MTB感染后，CD4+CD45+細胞的數量和活性也會發生相應改變[19]。CD163是一種Ⅰ型膜蛋白受體，主要表達于單核細胞和M2型巨噬細胞[20]。它參與多種免疫功能，包括調節炎癥和清除細胞碎片，也是巨噬細胞的標志物，巨噬細胞在組織修復和重塑中起著至關重要的作用，與多種疾病有關，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染病[21]。在研究和診斷環境中，CD163常被用作識別和研究巨噬細胞的特異性標志物。隨著入侵時間變長，結核桿菌會通過一系列的策略干擾巨噬細胞向M1型轉變，以獲得巨噬細胞的免疫逃逸，肺結核患者體內M2型巨噬細胞數量增多，與此同時，CD163+的表達數量和活性也會發生變化，通過外周細胞血對CD163的檢測結果，可以判斷患者被MTB的感染狀況。本研究結果顯示：TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB組。ROC分析結果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的AUC高于單獨檢測，提示聯合檢測檢出痰涂片陰性TB的價值高，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+單獨檢測只是免疫細胞表面標志物的一種表達情況。

需要注意的是，單憑血細胞分析的檢測結果不能作為肺結核的確診依據，通過GeneXpert MTB/RIF聯合外周血細胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+），對痰涂片陰性TB敏感度為92.87%，提示GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細胞分析聯合診斷痰涂片陰性可疑TB的價值顯著，而綜合上述指標可全面評估感染肺結核后免疫狀態的改變，值得在臨床上推廣使用。GeneXpert MTB/RIF法操作快捷簡便，出結果只需2 h左右，且試劑盒獨立儲存，受細菌污染的風險較小[22]。從生物安全角度來看，GeneXpert MTB/RIF是一種基于核酸檢測的方法，使用該法檢測標本對于實驗室生物安全防護的要求也與其他檢測方法的要求相當[20]，該方法的結核檢出率高，能夠更快地檢測出結核病原體。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細胞分析聯合診斷痰涂片陰性可疑TB的價值顯著，檢出率較高。

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（收稿日期：2024-01-09） （本文編輯：白雅茹）