基于響應面法的枇杷葉總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

摘 要 為優化枇杷葉中總黃酮提取工藝，探明總黃酮的抗氧化活性，以枇杷葉總黃酮提取量為考察指標，以提取方式、甲醇與乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，采用單因素和BoX-Behnken響應設計試驗，同時檢測枇杷葉總黃酮對DPPH·清除能力和ABTS+清除能力。乙醇超聲提取效果最好，4個因素對枇杷葉總黃酮提取量的影響排序為提取時間＞提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數，其中4個因素均有極顯著影響（p＜0.01），料液比與提取時間的交互作用影響極顯著（p＜0.01）；乙醇體積分數與提取時間交互作用影響顯著（p＜0.05）。枇杷葉總黃酮最佳提取工藝參數：乙醇體積分數48%，料液比1∶26，提取時間66 min，提取溫度63 ℃，實際測得枇杷葉總黃酮提取量為69.389 mg·g-1，與理論值差異小。在該工藝下，枇杷葉總黃酮對DPPH·與ABTS+最大清除率分別為34.396%、27.680%，雖然比Trolox清除率低，但仍有一定的清除能力。

關鍵詞 枇杷葉；總黃酮；響應曲面法；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.001

枇杷葉為薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.]的干燥葉，具有清肺止咳、降逆止嘔的功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴[1]?，F代研究表明，枇杷葉中含有黃酮成分[2]，是其主要藥效成分。藥理研究表明，枇杷葉具有抗氧化、抗炎、降血脂、止咳、增強免疫[3-5]等作用，同時枇杷葉也是藥食同源植物，其保健功能越來越受到健康產業的關注[6-7]。目前，對于枇杷葉的研究多集中在三萜酸[8]，文獻報道顯示，枇杷葉中總黃酮類化合物對減少自由基的產生和清除自由基都有良好的作用，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂的功效[9-12]。因此，優化枇杷葉總黃酮提取工藝，提高總黃酮提取量對枇杷葉有效成分開發利用具有重要意義[13]。目前提取枇杷葉總黃酮的方法主要為熱浸法，但提取時間過長、成本高且黃酮在提取過程中易分解[14]。超聲波提取中藥材中的黃酮，具有破碎時間短、提取率高、提取時間短的優點[15-17]。

本研究采用響應面法優化超聲輔助提取枇杷葉總黃酮工藝，并檢測枇杷葉總黃酮對DPPH清除能力和ABTS+清除能力，探討其抗氧化能力，為枇杷葉開發利用提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

枇杷葉采于重慶市萬州區（經度108.451 5°，緯度30.754 3°，海拔395 m），樣品鑒定為薔薇科植物枇杷的葉，洗凈，45 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過60目篩，備用。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 總黃酮含量測定

總黃酮含量測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法[13]。吸取一定量的樣品溶液于試管中，加入0.3 mL5% NaNO2溶液，搖勻；6 min后加入0.3 mL10% A1（NO3）3溶液，靜置6 min，加入4.0 mL 4% NaOH溶液，用60%乙醇定容至10 mL，靜置10 min，于510 nm處測定吸光值。以吸光值A（x）和蘆丁含量C（y），繪制總黃酮含量標準曲線y=13.916x-0.002 7（R2= 0.999 2）。

P=n×ρ×v/m （1）

式中，P為總黃酮含量，mg·g-1；ρ為蘆丁質量濃度，mg·mL-1；v為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數。

1.2.2" 提取方式試驗

超聲供試品溶液制備，稱取枇杷葉粉末10 g，置于150 mL錐形瓶中，與60%乙醇50 mL混勻（盡量潤濕粉末），60 ℃下超聲提取60 min（超聲功率300 W，工作頻率40 kHz），搖勻，紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中，即得。

回流供試品溶液制備，稱取枇杷葉粉末10 g，置于150 mL燒瓶中，與60%乙醇50 mL混勻（盡量潤濕粉末），60 ℃水浴鍋中回流提取1 h，搖勻，紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中，即得。

索式回流供試品溶液制備，稱取枇杷葉粉末10 g，用濾紙包裹置于索氏提取器中，精確加60%乙醇50 mL，50 ℃下提取4 h，紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾，濃縮液以60%定容至25 mL量瓶中，即得。

1.2.3" 單因素試驗

在乙醇體積60%、料液比1∶15（g·mL^-1）、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min的基本工藝條件下，考察這4個因素對枇杷葉總黃酮提取量的影響。

1.2.4" 響應面設計

根據單因素試驗結果，采取4因素3水平設計Box-Behnken Design試驗（見表1）。

1.2.5" 抗氧化活性試驗

1.2.5.1" " DPPH自由基的清除能力

參考Yu等[18]的方法并加以改進，取DPPH 2.0 mg用無水乙醇定容至50 mL，低溫避光反應30 min，得到0.04 mg·mL^-1的DPPH溶液。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL^-1樣品。精確吸取樣品溶液0.1 mL與2.0 mL的DPPH溶液，避光反應30 min。在517 nm下測定吸光值，同時以相同質量濃度Trolox做對照試驗。每個樣品做3個平行，取均值。

清除率=1-A₁-A₂/A₀ （2）

式中，A0為溶劑與DPPH·混合液吸光值；A1為樣品/標準品與DPPH·混合液吸光值；A2為樣品/標準品與乙醇混合液吸光值。

1.2.5.2" " ABTS+自由基的清除能力

參考Liu等[19]的方法并加以改進，ABTS儲備液的制備：取7.0 mmol·L^-1的ABTS和2.4 mmol·mL^-1過硫酸鉀等體積避光混合12 h后，即得ABTS溶液，使用前蒸餾水稀釋，使得734 nm處吸光值為0.70±0.02。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL^-1樣品。吸取樣品溶液0.05 mL與2.0 mL ABTS溶液，搖勻反應10 min，在734 nm下測定吸光值，同時以相同質量濃度Trolox做對照試驗。

清除率=1-A1/A0 （3）

式中，A₀為乙醇與ABTS+混合液吸光值；A₁為樣品/標準品與ABTS+混合液吸光值。

1.3" 數據處理

采用Design-Expert 12進行響應面設計，Excel 16與Origin 2018對試驗數據進行處理分析及繪圖。

2" 結果與分析

2.1" 單因素試驗結果

2.1.1" 提取方式對總黃酮提取量的影響

由圖1可知，超聲提取、索氏提取、回流提取等3種方式提取的總黃酮含量具有顯著差異（p＜0.05，下同），其中超聲提取效果最好（26.284 5 mg·g^-1），可能是因為超聲提取強震動，增大物質分子運動頻率與速度，增加溶劑穿透力，從而其總黃酮提取量高于索式提取和回流提取，后期試驗均采用超聲提取。

2.1.2" 溶劑體積分數對總黃酮提取量的影響

由圖2可知，甲醇提取的總黃酮含量低于乙醇提取的總黃酮含量。乙醇體積分數過低，枇杷葉總黃酮的提取量低；乙醇體積分數在0～40%時，總黃酮提取量隨著乙醇體積分數升高而升高；當乙醇體積分數達到40%時，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（51.023 4 mg·g^-1）；乙醇體積分數超過40%后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢。說明乙醇體積分數低時，樣品溶出能力較弱，提取效果較差，總黃酮提取量較低；乙醇體積分數過高，由于總黃酮與乙醇極性相差較大，總黃酮不能溶解充分，或是乙醇體積分數過大，溶出更多雜質，導致總黃酮提取量低。因此，選取乙醇體積分數30%、40%、50%作為后續試驗水平。

2.1.3" 料液比對總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在料液比1∶5至1∶25之間，隨著料液比的升高，總黃酮提取量呈升高趨勢，整體呈山峰狀，其中料液比為1∶25時，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（50.394 3 mg·g^-1）?？赡苁怯捎谌軇┻^少，枇杷葉總黃酮無法完全溶解，從而影響提取量；當溶劑過多時，多余的溶劑阻礙了枇杷葉與溶劑的溶解，導致提取量降低。因此，選取料液比1∶20、1∶25、1∶30作為后續試驗水平。

2.1.4" 提取時間對總黃酮提取量的影響

由圖4可知，提取時間在45～60 min時，隨著提取時間延長，總黃酮提取量增大；當提取時間為60 min時，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（55.484 6 mg·g^-1）；時間超過60 min后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢?？赡苁怯捎诳傸S酮溶出后容易被空氣氧化，或者超聲對溶出的總黃酮產生了破壞，導致總黃酮提取量降低。因此，提取時間45、60、75 min作為后續響應試驗水平。

2.1.5" 提取溫度對總黃酮提取量的影響

由圖5可知，溫度在40～60 ℃時，總黃酮提取量隨溫度增高而增加；當溫度達到60 ℃時，枇杷葉總黃酮提取量接近最高值（61.922 1 mg·g^-1）；溫度超過60 ℃后，枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢。可能是由于溫度升高，物質分子活躍度不斷增加，與枇杷葉得到充分接觸，促進總黃酮的溶解；溫度過高時，乙醇揮發，分子結構被破壞或揮發，導致總黃酮提取量降低。因此，選取溫度50、60、70 ℃作為后續試驗水平。

2.2" 響應面優化試驗結果分析

2.2.1" 響應面回歸模型建立

根據單因素試驗結果，采用4因素3水平的響應面中心試驗（見表2），運用Design-Expert 12分析，得到二次回歸方程模型：

Y=66.11+6.34×A+5.44×B+4.99×C+5.02×D+2.37×AB+3.93×AB+3.93×AC+2.49×AD+2.88×BC-0.46×BD-0.35×CD-12.24×A2-13.93×B2-9.78×C2-12.36×D2

由表3可知，模型F=51.365，p＜0.001，模型極顯著，故對枇杷葉總黃銅提取量的影響較為顯著；失擬項F=4.67，p=0.075 3，失擬項不顯著，表明模型擬合程度良好。模型相關系數R2=0.980 9，表明回歸方程相關性良好，校正決定系數R2Adj為0.961 8，說明模型可以解釋96.18%的總黃酮提取量變化，表明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。影響枇杷葉總黃酮提取的因素中，A、B、C、D、AC、A2、B2、C2和D2影響極顯著，BC交互作用影響顯著，都達到了統計學意義水平。由F值可以判斷出，四因素影響排序為：C＞D＞B＞A。

2.2.2" 交互作用分析

交互作用分析如圖6，響應曲面坡度及響應面投影的形狀可反映出交互效應的強弱，響應曲面越陡及響應面投影為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，響應曲面越平緩及響應面投影為圓形則與之相反。

從圖6中看出，料液比與提取時間的交互作用響應曲面圖陡峭，響應曲面投影為橢圓形，交互作用極顯著；乙醇體積分數與料液比響應曲面圖較陡，投影為橢圓形，兩因素交互作用顯著；乙醇體積分數與料液比、提取溫度的響應曲面投影中橢圓程度明顯，但交互作用較弱，未達到顯著水平，這與方差分析結果一致。

2.2.3" 最佳提取工藝的驗證

本試驗以總黃酮提取量為指標，得出枇杷葉總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為47.323%，料液比為1∶26.3，提取時間為65.445 min，提取溫度為62.297 ℃，此條件下的提取量預測值為69.465 mg·g^-1。結合實際情況，提取參數乙醇體積分數47%，料液比1∶26，提取時間66 min，提取溫度62 ℃，重復3次，實際測得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1，這與理論預測值結果差異小。因此，該方法準確可靠。

2.3" 枇杷葉總黃酮抗氧化活性分析

2.3.1" DPPH清除能力

由圖7可知，在0.1～0.8 mg·mL^-1范圍內，枇杷葉總黃酮提取液有清除DPPH能力，隨著提取液濃度增加，清除能力提升，且上升趨勢緩慢，DPPH清除率為29.272%～34.396%，Trolox對DPPH的清除率隨著濃度增大而提升。Trolox的DPPH清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過分析可知，枇杷葉總黃酮對DPPH有清除能力，說明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

2.3.2" ABTS+清除能力

由圖8可知，在0.1～0.8 mg·mL^-1濃度范圍內，枇杷葉總黃酮提取液有一定的ABTS+清除能力，清除能力隨著提取液濃度增加而提升，ABTS+清除率為11.545%～27.680%，Trolox對ABTS+的清除率隨著Trolox的濃度增大而提升，在相同濃度下，Trolox的ABTS+清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過分析可知，枇杷葉總黃酮對ABTS+有一定的清除能力，說明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

3" 小結與討論

黃酮成分多采用有機溶劑進行提取，本試驗對比了3種提取方式，發現超聲提取效果好、操作簡單，最終選用超聲提取。徐久婷等研究表明乙醇對枇杷葉主要功能成分提取效果良好，與本試驗結果一致[16]。本試驗結果得出枇杷葉總黃酮提取工藝條件為：參數設置為溶劑乙醇體積分數47%，料液比1∶26，提取時間66 min，提取溫度62 ℃，在此條件下，枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1。吳媛琳等對枇杷葉、枝條進行研究，所得枇杷葉提取率為枇杷枝條總黃酮提取率（3.21%）的2倍[20]；高偉城等研究表明，不同產地的枇杷葉總黃酮提取量在6.21～14.23 mg·g^-1[21]。本研究采用超聲提取法對枇杷葉總黃酮的提取量高于熱回流法[2]，可能因為超聲輔助提取對樣品的破碎能力強，能夠讓物質間充分接觸，使得黃酮類成分能更好地溶出。孫運奇等在水浴加熱條件下提取牡丹籽粕的總黃酮成分，所得總黃酮提取率為1.45%，結果乙醇體積分數為50%左右時，對牡丹籽粕的總黃酮提取效果最優[22]，本研究結果與其類似，進而說明并非乙醇體積分數越高，總黃酮有效成分溶出效果越好，這可能與乙醇和總黃酮的極性有關。

有學者研究枇杷葉的多糖、多酚、總三萜酸等活性成分，并具有抗氧化活性[11，23-25]。張敏杰等對響應曲面試驗后的石韋總黃酮提取物的抗氧化活性進行了比較，在石韋總黃酮最大質量濃度下測得DPPH清除率為30%[26]，本試驗枇杷葉在最大質量濃度下測得的DPPH清除率為34.396%，表明不同物種不同質量濃度下的抗氧化活性具有相似性。霍宇航等對測得不同品種枇杷葉的ABTS+清除率最高達23.90%[11]，本試驗枇杷葉總黃酮的ABTS+清除率為27.68%，說明重慶萬州的枇杷葉抗氧化活性可能更好，并且枇杷葉不同活性成分的抗氧化活性能力有相似性。余菲等[27]、陳海娟等[28]研究不同濃度下總黃酮對DPPH的清除能力優于ABTS+清除能力，本試驗通過對DPPH和ABTS+清除自由基體外抗氧化活性進行測定，同樣發現枇杷葉總黃酮清除DPPH效果優于清除ABTS+，這可能與兩者測定抗氧化能力的原理有關，可能是枇杷葉中總黃酮的含量較低，后期也可進一步做純化試驗。本研究表明枇杷葉總黃酮提取物具有一定的抗氧化活性，但未進行不同月份、不同地區及不同品種的總黃酮含量及抗氧化活性比較，后續有必要進一步研究。

基于響應面法優化提取枇杷葉總黃酮方法可靠，測得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g^-1，通過研究DPPH清除能力、ABTS+清除能力，表明枇杷葉總黃酮具有抗氧化活性，可開發枇杷葉在食品、中藥及化妝品領域的應用。

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（責任編輯：易" 婧）