基于離子淌度質譜與從頭算分子動力學模擬的質子互變異構體結構研究

關鍵詞離子淌度質譜；質子互變異構體；碰撞誘導解離；從頭算分子動力學模擬

質子互變異構體廣泛存在于各類有機化學反應和生物化學過程之中，這些結構與化合物的構象變化、酶引起的催化反應過程、溶劑或添加劑對生物活性的影響等因素緊密相關。如尼古丁的成癮特性源于其質子化形態(tài)與煙酰胺乙酰膽堿受體相互作用，光敏黃蛋白中的發(fā)色團對應于對香豆酸特定的脫質子結構[1-5]。認識這些結構可以為復雜生物活性結構的鑒定以及相關藥物設計與應用提供有價值的信息。然而，不同質子互變異構體結構的差別極小，并且易于相互轉化，解析這類異構體結構充滿挑戰(zhàn)。有研究表明，在質譜電離產(chǎn)生準分子離子峰的過程中加氫（正模式）與減氫（負模式）的離子結構可能會產(chǎn)生質子互變異構體[6-7]，為研究這類結構提供了一種新的手段。有研究者通過紅外多光子解離技術得到離子的紅外光譜圖，再通過理論計算模擬不同質子互變異構體的理論紅外光譜圖研究質子互變異構體結構[8-9]。由于不同質子互變異構體離子表面電荷分布的差異會影響離子與淌度分離氣體的相互作用，有研究者采用離子淌度質譜技術實現(xiàn)了質子互變異構體的直接分離和結構分析[10-14]。然而，在通常情況下很難得到不同質子互變異構體結構的標準品，因此在分離的基礎上，如何確定不同質子互變異構體的結構仍然充滿挑戰(zhàn)。通過對比不同質子互變異構體的實驗碰撞截面積（Collisionalcrosssections，CCS）與理論碰撞截面積是一種有效的手段[15-16]。離子淌度儀器CCS的實驗測定需要精確的校準過程[17]，而通過量子化學計算得到理論CCS的過程又相當復雜[18]，導致質子互變異構體結構定性困難。在有機質譜分析過程中，碎片離子通常提供了解析化合物結構的關鍵信息。碰撞誘導解離（Collision-induceddissociation，CID）技術被廣泛應用于各類商品化的質譜儀器中，特征的碎片離子結構在不同的儀器條件下通常具有一致性。研究表明，質子互變異構體之間由于電荷位點不同特別是質子化/去質子化位置的差異可能會導致離子的CID譜圖具有明顯差異[10，19-21]，在解析這些碎裂路徑和碎片離子結構時通常需要依賴研究者的經(jīng)驗與直覺，這使得通過二級質譜解析質子互變異構體結構仍然存在很多困難。

2013年，德國波恩大學的Grimme[22]基于從頭算動力學方法建立了不依賴于實驗數(shù)據(jù)而是純粹基于物理原理的量子化學方法QCEIMS（Quantumchemicalelectronimpactmassspectrometryprogram）預測化合物的電子轟擊電離源（Electronimpactionization，EI）質譜圖。該方法已被用于測試各類有機和無機化合物，一些經(jīng)典的重排反應（如麥氏重排過程）也能被準確預測[23–25]，采用該方法也可有效預測標準譜庫中缺少的三甲基硅烷衍生化代謝物的EI譜圖[26]。在QCEIMS工作的基礎上，Koopman等[27]在2020年推出了可預測離子CID譜圖的QCXMS（Quantumchemicalmassspectrometryprogram）軟件，該軟件已被用于測試分子的加氫峰、減氫峰以及多電荷離子[28]。Schnegotzki等[29]比較了一些藥物分子的實驗CID譜圖與QCXMS得到的理論CID譜圖。結果表明，QCXMS能夠完整闡明復雜藥物分子的全部碎裂路徑，獲得碎片離子、碎裂路徑中的中間體乃至中性丟失碎片的結構;此外，還能夠揭示一些低豐度解離過程的碎裂路徑。在QCXMS的模擬研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的質子化/脫質子化位置會顯著影響分子的碎裂路徑，實驗質譜圖中的碎片離子可能是由多種質子化異構體離子產(chǎn)生。

本研究采用離子淌度質譜結合從頭算分子動力學模擬QCXMS的方法解析質子互變異構體結構，整個流程如圖1所示。通過離子淌度譜分離質子互變異構體，再通過CID得到不同質子互變異構體的二級質譜實驗譜圖；同時，基于QCXMS得到不同質子互變異構體的二級質譜模擬譜圖。通過對比實驗譜圖和理論譜圖解析質子互變異構體的結構，并考察不同異構體之間的碎裂路徑差異。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

BrukertimsTOF捕集離子淌度飛行時間質譜儀（美國Bruker公司），配有電噴霧電離源（Electrosprayionization，ESI）和DataAnalysis5.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；碰撞誘導解離譜圖計算軟件QCxMSv5.2.1（Grimme研究組）。甲醇（色譜純，美國ThermoFisher公司）；丁香酸標準品（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；ESI低濃度調諧液Tunemix（美國安捷倫公司）。

1.2樣品制備

稱取丁香酸標準品10mg（精確至0.1mg），用甲醇溶解并定容，配制成1mg/mL的標準儲備溶液，再用90%甲醇溶液逐級稀釋至適宜濃度，取1mL待分析。

1.3質譜條件

ESI源，負離子模式；毛細管電壓3500V；霧化器氣體壓力30kPa；反吹氣流速3.0L/min；反吹氣溫度200℃；進樣速度為5μL/min。TIMS條件設置：1/K0范圍0.1～0.8V?s/cm2；斜坡分離時間（Ramptime）為100ms；累積時間（Accumulationtime）為20ms；一級質譜掃描范圍m/z50～500；二級質譜掃描范圍m/z50～300，碰撞誘導解離能量10～30eV。

1.4從頭算動力學CID譜圖的模擬計算

通過Avogadro軟件進行分子結構建模，再通過CREST軟件[30]確定分子內不同的質子互變異構體結構。通過QCXMSv5.2.1對得到的結構模擬產(chǎn)生CID譜圖。QCXMS基于以下流程進行CID過程模擬：首先通過一段600K以下15ps的分子動力學模擬得到不同構象的初始結構；初始結構通過設置初始速度接近惰性氣體，發(fā)生碰撞后獲得相應能量，再通過一段平均自由程分子動力學模擬產(chǎn)生相應的碎片；對不同的初始結構進行并行計算；在完成所有的計算任務后，通過電荷分配（Chargeassignment）算法將所有任務中的帶電碎片結構集合在一張理論CID譜圖中。QCXMS軟件中參數(shù)選擇：CID模式；采用xtb6.4.1中的GFN2-xTB[31]方法計算力和能量；最大的分子動力學時間（MaximumMDtime-sampling）設置為10ps；參考此前的相關研究并考慮計算耗時，其他參數(shù)均為軟件默認參數(shù)。采用自寫的Python程序繪制理論譜圖，并與實驗譜圖對比。QCXMS計算得到的每條軌跡均可通過Avogadro軟件可視化。

2結果與討論

2.1質子互變異構體的離子淌度分離與二級質譜分析

香草酸分子具有兩個可能的脫質子位點，即羧基與其對位上的羥基。香草酸廣泛存在于各類蔬菜水果中，被認為具有特殊的抗氧化活性，因此研究其質子互變異構體結構尤為重要。這類結構在以質子活性溶劑（如甲醇）作為ESI溶液時，會產(chǎn)生兩種不同的脫質子結構，形成一對互變異構體，即羥基位脫質子離子（酚氧離子）與羧基位脫質子結構（羧酸離子）。如圖2所示，在香草酸溶于甲醇溶液后，經(jīng)過ESI電離后的香草酸在捕集離子淌度譜分離過程中可得到A與B兩個峰，這兩個峰被認為分別對應香草酸在羥基和羧基位點的脫質子結構。兩個峰對應的二級質譜圖呈現(xiàn)明顯差異，主要表現(xiàn)為m/z152.0088[M–CH3]?與m/z123.0427[M–CO2]?的豐度差異。

2.2互變異構體的QCXMS模擬結果及實驗對比

為了判斷這兩個淌度峰分別對應的結構，通過QCXMS分別獲取兩種離子結構的二級質譜模擬譜圖。圖3為不同異構體實驗譜圖與理論譜圖的對比結果。圖3A的結果表明，酚氧離子模擬二級質譜的譜圖與A峰對應的結果較一致，其中最重要的是作為主要碎片離子的m/z152.0088[M–CH3]?在豐度上也得到了較好體現(xiàn)。羧酸離子的模擬二級質譜譜圖與B峰對應的結果差異較小，在圖3B中，B峰對應的主要碎片離子m/z123.0427[M–CO2]?和m/z108.0195[M–CO2–CH3]?均得到有效重現(xiàn)，這兩個關鍵碎片離子對應的豐度也與實驗結果較一致。同時，在羧酸離子的模擬譜圖中也出現(xiàn)了豐度較低的m/z152.0088[M–CH3]?離子。在類似香草酸結構的相關研究[11]中，羥基位脫質子的酚氧離子結構產(chǎn)生的CCS遠小于羧基位脫質子產(chǎn)生的羧酸離子結構，由于1/K0與CCS成正比，因而從CCS的角度也可以證明A峰對應的結構為酚氧離子，B峰對應的結構為羧酸離子。

2.3互變異構體碎片結構的差異及其原因

推測化合物在CID過程中產(chǎn)生的碎裂路徑以及碎片離子結構是一個極復雜的過程，CID過程施加的能量可使共價鍵斷裂，同時還可能導致質子在分子的不同原子之間流動，即質子的流動模型。更復雜的是分子可能發(fā)生重排反應，如碳骨架成環(huán)或開環(huán)[32-34]。推測化合物的碎片離子結構通常需要研究者具有豐富的經(jīng)驗。QCXMS軟件能夠保留模擬CID過程中離子的每條碎裂軌跡，實現(xiàn)碎裂過程的可視化，同時得到對應的碎片結構，因此可以進一步研究互變異構體結構產(chǎn)生的二級譜圖差異。圖4為QCXMS中得到的不同脫質子結構脫羧過程以及對m/z91.0172碎片離子結構的推測，香草酸脫質子離子的碎裂路徑主要有兩條：甲氧基均裂產(chǎn)生m/z152.0088[M–CH3]?離子以及脫羧產(chǎn)生m/z123.0427[M–CO2]?離子。兩種互變異構體CID譜圖的豐度差異可能來自不同結構，從而影響了兩條碎裂路徑之間的競爭。圖4A展示了兩類脫質子結構的不同脫羧過程。酚氧離子結構由于存在羧基位的氫原子，在脫羧過程中需要有一個羧基官能團旋轉，產(chǎn)生氫處于羧基氧與碳原子之間的過渡態(tài)結構，這使得脫羧過程需要更高的能量，并導致酚氧離子的兩條碎裂路徑中甲氧基均裂路徑更容易發(fā)生，從而導致m/z152.0088[M–CH3]?離子的豐度更高。羧酸離子結構可直接實現(xiàn)脫羧，其脫羧路徑能量低于酚氧離子的脫羧路徑能量，與甲氧基均裂路徑能量接近。這導致羧酸離子脫羧和甲氧基均裂同時發(fā)生，即m/z123.0427[M–CO2]?和108.0195[M–CO2–CH3]?離子是羧基位脫質子結構基峰碎片離子的主要原因。

在實驗譜圖中，m/z91.0172的碎片離子結構也較明顯。特別是當實驗過程中CID能量增大時，兩種脫質子結構的CID譜圖中都能得到m/z91.0172離子。相比其它碎片離子的結構，基于經(jīng)驗推測m/z91.0172離子的結構較困難。在QCXMS兩種脫質子化異構體的碎裂過程中，QCXMS均得到了m/z91.0172的碎片離子。這些軌跡表明m/z91.0172碎片離子是一個固定的結構。圖4B展示了其中一條碎裂軌跡，首先酚氧離子脫去羧基上的氫，再脫去CO2中性分子，產(chǎn)生羥基對位為自由基位點羥基帶負電的自由基陰離子；然后碳氧鍵均裂，產(chǎn)生分子式為C6H3O1（理論m/z91.0178）的碎片離子。高分辨質譜得到的元素組成與QCXMS得到的碎片結構一致，證明該分子結構可能是圖4B中QCXMS得到的結果。m/z91.0172碎片獨特的電子結構可通過后續(xù)更精確的計算化學方法進行考察。

2.4模擬譜圖與實驗譜圖的差異

值得注意的是，實驗譜圖與理論譜圖還有一些不符合之處。首先，低質量端的碎片離子在實驗中無法出現(xiàn)，這可能是儀器參數(shù)設置的結果導致；另外，在模擬得到的譜圖中應用的碰撞能量通常大于實際電壓，這主要是因為不同儀器之間碰撞誘導解離儀器部分的設置有所差異，這會影響碰撞時給予離子的能量，在QCXMS模擬過程中，采用的模擬條件特別是模擬的碰撞空間與實際的儀器條件會有所差異。

盡管實驗能量與理論能量存在差異，但是增大能量對于離子的碎裂行為的影響是一致的。圖5與圖6分別顯示了酚氧離子與羧酸離子在QCXMS設置不同能量條件下得到的模擬譜圖以及主要離子碎片豐度變化圖。由酚氧離子的實驗CID譜圖（圖5B）可見，當碰撞能量在15eV時左右時，母離子（m/z167.0320）的豐度與m/z152.0088[M–CH3]?離子的豐度出現(xiàn)交叉；當碰撞能量達到25eV時，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子豐度再超過m/z152.0088[M–CH3]?離子，而m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度始終處于較低的水平。由羧酸離子的實驗CID譜圖（圖6B）可見，當碰撞能量為15eV時，母離子（m/z167.0320）的豐度與m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度出現(xiàn)交叉；在20eV處，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子豐度成為基峰，m/z152.0088[M–CH3]?離子豐度始終處于較低的水平。

利用QCXMS模擬不同能量下酚氧離子結構離子豐度的變化，結果如圖5A所示。隨著模擬能量增加，m/z152.0088[M–CH3]?的強度逐漸增強；在能量最高（50eV）的模擬譜圖中，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?的強度也明顯增強，這與圖5B的實驗結果一致。圖6A中羧酸離子結構的模擬CID結果與圖6B的實驗結果一致，這主要體現(xiàn)在隨著實驗能量增強，m/z123.0427[M–CO2]?離子豐度增加，當模擬能量為35eV時，m/z108.0195[M–CO2–CH3]?成為基峰，這與實驗中離子碎片豐度的變化一致。此外，QCXMS的模擬結果也很好地重現(xiàn)了m/z108.0195[M–CO2–CH3]?離子在不同結構中何時成為基峰離子。在圖5A中，50eV時，m/z108.0195離子尚未成為基峰離子；在圖6A中，35eV能量已經(jīng)使得m/z108.0195離子成為基峰離子，這與實驗結果一致。

3結論

通過離子淌度質譜分離質子互變異構體，得到每個異構體對應的CID譜圖；通過QCXMS方法模擬了不同脫質子結構的CID譜圖，實現(xiàn)了對實驗中得到的不同結構的確認。采用QCXMS方法還可得到不同質子互變異構體結構的碎裂路徑，進而分析出一些關鍵碎片離子的結構，極大地降低了CID過程中推測碎裂路徑和碎裂離子結構的難度。本方法應用一種全新的手段揭示質子互變異構體的結構，促進了對異構體產(chǎn)生不同碎裂路徑的理解，有助于對互變異構體體系的認識。本方法也可用于更復雜的實際體系的物質結構鑒定，為關鍵化合物結構定性分析提供了一種新的有效手段。