衍生化-氣相色譜-質譜法檢測阿加曲班中氯甲酸異丁酯殘留

關鍵詞阿加曲班；氯甲酸異丁酯；衍生反應；氣相色譜-質譜；甲基異丁基碳酸酯

阿加曲班是新一代抗血栓藥，是一種活性強、高選擇性的小分子直接凝血酶抑制劑，能可逆、迅速地與凝血酶活性位點結合，抑制凝血酶催化或誘導的反應，發揮抗凝血作用[1-2]。1990年，阿加曲班在日本首次上市，2002年在中國正式上市，商品名為諾保思泰，臨床用于缺血性腦梗死急性期患者的抗凝治療[3]、抗凝血酶缺乏患者進行血透時的抗凝處理[4]和心肌梗死溶栓的輔助治療[5]，以及治療和預防肝素誘導的免疫性疾病-血小板減少癥，比肝素具有更好的抗凝和抗血栓作用[6]。

氯甲酸異丁酯（Isobutylchloroformate，IBCF）為無色具有刺激性氣味的液體，遇水或受熱易分解，是一種重要的化工原料，常用于有機物和藥物合成，是合成阿加曲班的重要原料[7-8]。IBCF屬于酰鹵類物質，雖然目前尚無明確毒理學數據證明其基因毒性、致畸性和致癌性，但由于這類化合物含有結構警示基團，所以仍被認為是潛在的基因毒性雜質[9-11]。根據歐洲藥品管理局[12]和美國食品藥品管理局[13]的法規要求，基因毒性雜質的毒理學關注閾值（Thresholdoftoxicologicalconcern，TTC）限度為1.5μg/d，由于阿加曲班每日最高服用劑量為60mg，其中的IBCF的限度值即為25μg/g。因此，有必要建立對阿加曲班中IBCF的殘留進行檢測分析的有效方法，但尚未見阿加曲班中IBCF分析測定的研究報道。

目前，文獻報道的氯甲酸酯類物質的檢測方法很少，主要是氣相色譜法（Gaschromatography，GC）[14]和氣相色譜-質譜法（Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）[15-16]，但由于氯甲酸酯類物質受熱易分解[17]，影響了方法的重現性和準確度。氯甲酸酯類物質是一類常用的衍生試劑[18]，可通過衍生作用改變目標化合物的分子量、極性、揮發性和穩定性等理化性質。IBCF是眾多氯甲酸酯類物質的一種，目前被廣泛應用于氨基酸[19-21]、生物胺[22-26]、脂肪酸[27]、對羥基苯甲酸酯[28]、哌啶類[29]和核酸堿基類[30]物質的檢測分析。上述化合物雖然可與IBCF發生衍生反應，但不具備樣品溶解、IBCF提取以及相關試液配制的功能。基于此，本研究選取甲醇作為阿加曲班原料藥（簡稱阿加曲班）樣品的溶解和IBCF的提取及衍生試劑，通過IBCF與甲醇發生衍生反應生成甲基異丁基碳酸酯（Methylisobutylcarbonate，MIBCB），有效改善了IBCF的熱不穩定性和色譜行為，建立了阿加曲班中IBCF殘留的衍生化-GC-MS檢測方法，并進行了方法學驗證。本方法能同時實現阿加曲班的溶解和IBCF的提取及衍生，通過檢測衍生產物MIBCB，間接實現了IBCF的準確測定，大大簡化了樣品的前處理過程，提高了檢測效率，方法操作簡便、靈敏度高、基質效應低、結果準確可靠，為阿加曲班中IBCF殘留的測定提供了新方法。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

GCMSTQ8040氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，配NIST20標準譜庫（日本Shimadzu公司）；XPE105電子天平（瑞士MettlerToledo公司）；Vortex-Genie2渦旋振蕩器（美國ScientificIndustries公司）。IBCF對照品（純度98%，上海阿拉丁生物試劑有限公司）；甲醇、正己烷、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜（色譜純，美國Fisher公司）；甲基叔丁基醚（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；吡啶（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。8批次阿加曲班樣品由兩家藥業公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1對照品和供試品溶液的配制

準確稱取10mgIBCF對照品，以甲醇溶解并定容至10mL，室溫靜置24h后，制得1000μg/mLIBCF對照品儲備液。取對照品儲備液，以甲醇逐級稀釋，制得濃度分別為25、100、200、250、300和500ng/mL的系列對照品溶液。

準確稱取100mg阿加曲班樣品，以甲醇溶解并定容至10mL，室溫靜置24h后，制得10mg/mL供試品溶液。

1.2.2儀器分析條件

色譜條件：DB-5MS毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，固定相為5%苯基-甲基聚硅氧烷，美國Agilent公司）；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣模式：恒線速度控制模式；柱流量：1.0mL/min；進樣口溫度：280℃；進樣模式為分流進樣，分流比為5∶1；進樣體積為1.0μL；溶劑延遲2min。升溫程序：初始柱溫50℃（保持2min），以20℃/min升至100℃，再以30℃/min升至280℃（保持5min）。

質譜條件：電子轟擊離子源（Electronimpact，EI）；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；色譜-質譜接口溫度：280℃；采集模式為全掃描監測模式（SCAN），掃描范圍為m/z29～600；采集模式為選擇離子監測（Selectiveionmonitor，SIM）模式；其它質譜參數見表1。

1.2.3方法學驗證

依次檢測1.2.1節配制的濃度為25、100、200、250、300和500ng/mL的系列對照品溶液，考察方法的線性范圍；結合1.2.1節供試品溶液的制備過程，分別按信噪比（S/N）為3和10的原則，確定方法的檢出限（Limitofdetection，LOD）和定量限（Limitofquantification，LOQ）。向阿加曲班樣品中添加低（2.50μg/g）、中（25.00μg/g）、高（50.00μg/g）3個水平的對照品溶液，考察方法的加標回收率。在不同日期，由不同實驗人員測定加標樣品溶液（25.00μg/g），考察方法的精密度。通過微小變動測定條件，在不同的儀器條件下測定加標樣品溶液，考察方法的耐用性。

2結果與討論

2.1提取和衍生試劑的篩選

測定阿加曲班中的IBCF時要求樣品和IBCF均能充分溶于提取試劑。稱取50mg阿加曲班并置于10mL離心管中，平行稱取7份，分別加入5mL甲醇、正己烷、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、甲基叔丁基醚和吡啶，考察其溶解度。結果表明，阿加曲班在正己烷、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的溶解度較差，不能被完全溶解，所以，后續不再考慮這3種溶劑。阿加曲班能完全溶于甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和吡啶，分別采用這4種溶劑配制濃度為100μg/mL的對照品溶液，考察IBCF的響應。結果表明，IBCF在N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的響應很低，N，N-二甲基甲酰胺還會干擾IBCF的測定；IBCF與吡啶會發生衍生反應，生成的產物響應低且不穩定；IBCF不僅與甲醇發生衍生反應生成MIBCB，而且產物穩定、色譜峰形好、響應高。綜上，甲醇同時具備可溶解樣品和提取以及衍生IBCF的功能，因此，選擇甲醇作為提取和衍生試劑。

2.2衍生反應的機理

準確稱取適量IBCF對照品，以甲醇為溶劑，配制成100μg/mL對照品溶液，現用現配，按1.2.2節的儀器分析條件，在SCAN模式下立即進行檢測分析，所獲取的總離子流色譜圖（Totalionchromatogram，TIC）見圖1。由于采用甲醇溶解后立即測定，IBCF雖發生了衍生化，但是反應不完全，仍有部分IBCF為原型，所以共檢測出2個色譜峰：峰1的峰形不對稱，峰2的峰形和響應均良好。對2個色譜峰進行NIST標準譜庫檢索（表2），分別為IBCF和MIBCB，相似度均高達96%。IBCF與MIBCB的分子結構很相近，只有1個取代基的差異，推測MIBCB為IBCF的衍生產物，衍生機理如圖2所示，通過此衍生反應，IBCF的色譜行為發生了顯著改善。

2.3質譜的碎裂機理及定性、定量離子的選擇

為了減小基質背景干擾、降低基質效應以及提高檢測的靈敏度，本研究采用SIM模式對目標化合物進行檢測分析。圖3為2.2節圖1中IBCF和MIBCB對應的質譜圖。在質譜定量檢測的過程中，通常選擇m/z值大且豐度高的碎片離子作為定性離子，再從定性離子中選擇豐度最高的碎片離子作為定量離子。由圖3可見，m/z41、43、56和57為IBCF和MIBCB豐度較高的共性離子，但由于m/z41和43質荷比較小，受基質干擾的可能性較大，因此IBCF首先選定m/z值較大、豐度次之的m/z56和57作為定性離子，MIBCB首先選定m/z值較大，豐度最高的m/z56和豐度次之的m/z57作為定性離子；其次分別選擇m/z值較大、豐度也較高的特征離子m/z63和90作為IBCF和MIBCB的另一個定性離子；最后，再從上述定性離子中選擇豐度最高的m/z56作為二者的定量離子。本方法同時采集m/z56、57、63和90這4個特征碎片離子，可實現IBCF和MIBCB的同時測定，在保證IBCF完全衍生為MIBCB的前提下，通過檢測MIBCB間接實現IBCF的準確測定。IBCF和MIBCB可能的碎裂機理如圖4所示。

2.4衍生反應時間的優化

由圖1可知，現配現測IBCF對照品甲醇溶液在檢出MIBCB的同時，仍有明顯的IBCF檢出，說明IBCF與甲醇混合后雖能發生衍生反應，但不能立即反應完全，為了確保IBCF能在最短的時間內完全衍生為MIBCB，需對衍生時間進行優化。溫度是影響反應速度的關鍵因素。相比于室溫，雖然升高衍生溫度能夠增加反應速率，縮短反應時間，但IBCF在高溫下不穩定，易分解，并且高溫會加快反應試劑的揮發，引發不必要的副反應，不利于衍生反應的順利進行和控制。因此，本研究選擇在室溫條件下對衍生時間進行優化。

采用甲醇作為溶劑，配制100μg/mLIBCF對照品溶液，在室溫下靜置0、2、4、8、16、24、36和48h后，按1.2.2節的儀器分析條件進行檢測，根據IBCF和MIBCB的定量離子m/z56的峰面積可知，衍生16h后，MIBCB的響應基本保持穩定，IBCF仍有微弱檢出，對應的S/N=3.3，接近儀器的檢出限。衍生24h后，已完全無法檢出IBCF，MIBCB仍保持穩定，m/z56峰面積的變化趨勢如圖5所示，因此，確定衍生反應時間定為24h。衍生24h后，IBCF對照品溶液的SIM譜圖見圖6。

2.5方法學驗證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

在優化的條件下檢測系列對照品溶液，以衍生產物MIBCB的定量離子m/z56的峰面積（y）對IBCF的質量濃度（x，ng/mL）繪制標準曲線，IBCF在25～500ng/mL濃度范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為y=62.18x+476.69，線性相關系數（R2）為0.9999。逐級稀釋IBCF對照品溶液進行檢測分析，分別按S/N為3與10的原則確定方法的LOD和LOQ分別為0.75和2.50μg/g。

2.5.2加標回收率和精密度

按1.2.1節方法制備某批次的阿加曲班供試品溶液，采用本方法進行測定，未檢出IBCF。配制濃度為250、2500和5000ng/mL的IBCF對照品溶液。稱取上述阿加曲班樣品100mg，分別加入上述對照品溶液1mL，以甲醇定容至10mL，制得加標濃度分別為2.5（低）、25.0（中）和50.0μg/g（高）的加標樣品溶液，每個濃度水平重復測定6次，加標回收率分別為97.8%（RSD=3.1%）、97.4%（RSD=2.1%）和95.2%（RSD=2.0%）。為了考察隨機變動因素對方法精密度的影響，在不同日期，由不同實驗人員分別重復測定加標樣品溶液（25.00μg/g）6次，12次測定結果的平均值為24.28μg/g，RSD為2.1%。

2.5.3方法的耐用性

耐用性是指在測定條件發生微小變化時，測定結果不受影響的承受程度。分別在原測試條件、初始柱溫±5℃、升溫速率±2℃/min和柱流量±0.1mL/min的條件下，檢測IBCF對照品溶液（250ng/mL）和加標樣品溶液（25.00μg/g），采用外標法單點計算加標樣品溶液中IBCF的含量，考察方法的耐用性。在不同測定條件下，7次檢測結果的平均值為24.16μg/g，RSD為2.2%，表明本方法耐用性良好，檢測結果穩定，測定條件的微小改變對檢測結果的影響較小。

2.6實際樣品分析

對兩家藥業公司生產的8批次阿加曲班樣品進行測定，檢測結果如圖7所示，IBCF和MIBCB均無響應，表明上述8批樣品中均未檢出IBCF。

3結論

本研究對提取和衍生試劑、衍生反應時間、定性和定量離子進行了篩選和優化，推測了衍生反應和特征碎片離子的碎裂機理，建立了阿加曲班中IBCF殘留的衍生化-GC-MS檢測方法，同時進行了方法學驗證，結果令人滿意。本方法在SIM模式下同時采集IBCF和MIBCB的4個特征碎片離子，在保證IBCF與甲醇完全衍生為MIBCB的前提下，通過檢測MIBCB，間接實現IBCF的準確測定。采用本方法對兩家藥業公司生產的阿加曲班樣品進行測定，結果表明，8批次的阿加曲班樣品中均未檢出IBCF。本方法能同時實現阿加曲班的溶解和IBCF的提取及衍生，操作簡便、靈敏度高、基質效應低、檢測結果準確可靠，為阿加曲班中IBCF殘留的測定提供了參考方法。