馬鈴薯StNiR基因的克隆及其在低氮肥脅迫下的表達分析

摘要：為了研究馬鈴薯亞硝酸還原酶基因StNiR（nitrite reductase，NiR）在低氮肥脅迫中的作用，以馬鈴薯Russet Burbank品種為材料，采用反轉錄PCR法克隆獲得馬鈴薯亞硝酸還原酶基因StNiR。結果表明，該基因的開放閱讀框序列全長為1 755 bp，共編碼584個氨基酸。蛋白質二級結構由36.82% α螺旋、5.31% β轉角、16.78% 延伸鏈和41.10% 無規則卷曲組成，蛋白質三級結構與煙草NiR蛋白的一致性為86.60%。氨基酸序列與潘那利番茄（Solanum pennellii）、番茄（S. lycopericum）、曼陀羅（Datura stramonium）、風鈴辣椒（Capsicum bacctum）、辣椒（C. annuum）、煙草（Nicotiana tabacum）的一致性均＞93%。微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的結果與轉錄組測序結果表明，低氮肥脅迫下StNiR基因在根和葉片中均被抑制表達，且在根中比在葉片中更敏感。本研究為后期如何從分子角度提高馬鈴薯的氮素利用率和培育氮高效馬鈴薯新品種奠定了基礎。

關鍵詞：亞硝酸還原酶；基因克隆；生物信息分析；微滴式數字PCR；馬鈴薯；轉錄組測序

中圖分類號：S532.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）14-0040-06

收稿日期：2023-09-07

基金項目：河南省科技攻關計劃（編號：202102110167）；河南省高等學校重點科研項目（編號：24A210027）；鄭州師范學院高層次人才科研啟動專項經費（編號：2018）。

作者簡介：牛蘇燕（1986—），女，河南安陽人，博士，講師，從事薯類作物育種及功能基因組學等研究。E-mail：niusuyan1234@163.com。

通信作者：崔 波，博士，教授，從事植物分子育種等研究。E-mail：laocuibo@163.com。

馬鈴薯（Solabum tuberosum）為茄科茄屬一年生草本植物，是一種重要的糧蔬兼用作物。在其生育周期內，氮素是一個重要的限制因子。農業生產上為了獲得目標產量總是依賴于過度施用氮肥，然而馬鈴薯對氮肥的利用率較低，農田中氮肥施入量的增加不僅會造成環境污染，同時還會造成生產成本增加和資源浪費等問題，更為嚴重的是氮肥的過量施用還容易導致馬鈴薯塊莖中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量升高，而亞硝酸鹽中毒則容易導致人類高鐵血紅蛋白癥、腎上腺腎小球肥大等癥狀，甚至還會致癌［1-4］。

在植物體內，硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）對初級氮的同化起著非常重要的作用，NR調控硝酸鹽降解為亞硝酸鹽，NiR再進一步將亞硝酸鹽降解為銨，最終銨參與蛋白質的合成［4-7］。研究表明，亞硝酸還原酶是植物體內的NO合成酶，NO在一定程度上可提高植物的抗逆能力，緩解逆境脅迫，從分子角度對氮素攝入、利用、儲存等代謝調控網絡進行研究，對于提高作物產量和品質具有重要意義。近年來，相關學者通過對小麥亞硝酸還原酶基因的克隆與表達分析，驗證了亞硝酸還原酶基因這一硝態氮同化過程的關鍵酶基因在進化上具有高度的保守性［5-7］。此外，有研究將擬南芥NiR基因轉入煙草，發現轉基因株系的NiR活性比野生型高5倍，且有些轉基因株系的亞硝酸鹽含量降低［8］，同時還發現植物下部葉片硝酸鹽含量高于上部葉片，轉基因株系的天冬氨酸和天冬酰胺的含量高于野生型。因此，本研究克隆出馬鈴薯NiR基因，以期為培育出低硝酸鹽含量的馬鈴薯品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以生長于鄭州師范學院學院生物工程研究中心的馬鈴薯品種Russet Burbank（簡稱RB）為材料，取頂部展開葉1～2張。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

利用植物多糖多酚RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，按照其說明書進行RNA的提取。之后，用2%凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用微量分光光度計測得D260 nm/D280 nm的值在1.8～2.1之間，證明RNA的純度符合要求。利用反轉錄酶 M-MLV 將馬鈴薯總RNA 反轉錄成 cDNA 第1條鏈，作為馬鈴薯StNiR基因克隆的模板。

1.3 引物的設計及基因的克隆

根據馬鈴薯轉錄組獲得的NiR基因序列，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物：上游引物為5′-T T G T T C T T G T T A A T T T G T C G-3′，下游引物為5′-A T A T G A T T C T G A A G A T T T T A G A T-3′，用于擴增目的基因。以逆轉錄獲得的cDNA為模板，利用上游和下游引物PCR擴增馬鈴薯的StNiR基因保守片段。反應體系為：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，5 U/μL rTaq DNA聚合酶 0.2 μL，模板cDNA 1 μL，定量補足ddH2O至20 μL。PCR擴增的程序為：94 ℃預變性 1 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 50 s，共30個循環。取PCR產物進行經瓊脂糖凝膠電泳檢測，待檢測之后，將擴增產物進行T-A連接（載體PMD19-T Vector），轉入大腸桿菌DH5a菌株進行測序分析。

1.4 StNiR基因的生物信息學分析

利用NCBI網站上的BLAST對馬鈴薯NiR蛋白的氨基酸序列進行比對分析；利用NCBI網站上的CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和InterProScan（http：//www.Ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search） 進行結構域預測；利用PROSITE軟件 （http：//prosite.expasy.org/） 找尋酶活性位點；" 利用ExPasy網站的PrptParam軟件對馬鈴薯NiR蛋白進行理化性質分析；采用在線軟件ExPasy網站上的SOPMA對馬鈴薯NiR蛋白質的二級結構進行預測，利用SWISS-MODEL進行蛋白質三級結構預測；利用Wolf-PSORT （https：//www.genscript.com/tools/wolf-psort） 在線工具對NiR蛋白進行亞細胞定位；采用MEGA 7.0.14構建系統進化樹。

1.5 StNiR基因的表達分析

為了檢測馬鈴薯StNiR基因在低氮肥脅迫中的表達情況，將種植于氮肥供應充足7.5 mmol/L（對照）和供應不足0.05 mmol/L（低氮肥脅迫）的水培系統中幼苗（4個生物學重復）［9-10］培養10 d 后，分別對葉片和根進行取樣提取RNA進行基因表達分析。根據克隆獲得的StNiR基因序列設計出特異性引物：上游引物為5′-T G T C C C A A T A T G T C A C C G C C A A-3′；下游引物5′-T G A A G A A T C C A C C C A C A A G C A G G-3′。馬鈴薯EF1a基因作為內參基因，上游引物為5′-C T G T T A A G G A T C T G A A G C G T G G T-3′；下游引物5′- A A T G T G G G A A G T G T G G C A G T C G-3′。微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）在QX200微滴數字PCR系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上進行，程序設置如下：95 ℃運行5 min；然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，4 ℃ 5 min，共40個循環；最后10 ℃保存PCR產物。ddPCR反應液的準備和基因表達量的計算參考Niu等的方法［11-12］。此外，將ddPCR的結果與轉錄組測序結果進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StNiR基因的克隆

以馬鈴薯Russet Burbank葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示1條大小約為1 800 bp的特異性條帶（圖1），與預測的片段大小一致。由測序結果可知，StNiR基因的cDNA全長是1 799 bp。利用NCBI的ORF Finder對克隆到的馬鈴薯StNiR序列進行分析，發現1個長度為1 755 bp的開放閱讀框，共編碼584個氨基酸（圖2）。

2.2 馬鈴薯NiR蛋白質理化性質分析

馬鈴薯NiR蛋白的理化性質分析結果顯示， 該

蛋白的相對分子質量為65 616.26 u，理論等電點為6.67，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）數為79，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）數為77，不穩定系數為36.12。利用Expasy ProtScale在線軟件分析顯示，StNiR蛋白質序列具有較高的親水性，其中第565位氨基酸的疏水性最強（纈氨酸，2.678），第371位氨基酸的親水性最強（谷氨酸，-3.233），總親水性平均系數為-0.397。由圖3可知，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，因此整個多肽鏈表現為親水性，由此可見StNiR屬于穩定的親水性蛋白。

2.3 馬鈴薯NiR蛋白質二級結構和三級結構分析

使用ExPASy網站上的SOPMA軟件對馬鈴薯NiR蛋白質的二級結構進行預測，結果表明，此蛋白

的主要構型為無規則卷曲（random coil） 和α螺旋。其中，無規則卷曲所占比例最高，包含有240個氨基酸，占總氨基酸數的41.10%；α-螺旋包含有215個氨基酸，占總氨基酸數的36.82%。其余為5.31% 的β轉角和16.78% 的延伸鏈（圖4）。利用SWISS-MODEL軟件分析得到馬鈴薯NiR氨基酸三級結構，以3b0g.1.A為模板進行建模，該模板以X-ray 1.25方法產生，結果顯示，馬鈴薯NiR與煙草NiR蛋白三級結構一致性為86.60%（圖5）。從圖5中可以看出該蛋白質大部分由α螺旋和無規則卷曲組成，與其二級結構預測結果相吻合。

2.4 馬鈴薯NiR蛋白質結構域分析和亞細胞定位

結構域分析結果顯示，馬鈴薯NiR蛋白序列包含有PLN02431（1～578 aa區域）即鐵氧還原蛋白亞硝酸還原酶（ferredoxin nitrite reductase） 的保守結構域；NIR_SIR（197～351 aa和457～564 aa區域）即亞硝酸和亞硫酸鹽還原酶4Fe-4S結構域（Nitrite and sulphite reductase 4Fe-4S domain）；CysⅠ（86～580 aa區域）即血紅素蛋白β亞基結構域［sulfite reductase，beta subunit （hemoprotein） ］（圖6）。利用InterProScan和PROSITE 軟件對馬鈴薯亞硝酸還原酶活性位點進行分析，發現在氨基酸序列區域502～518 aa的TGCPNTCGQVQVADIGF為StNiR蛋白的主要活性位點（PS00365）；還含有2個西羅血紅素結合位點（PR00397）分別在458～476 aa和502～520 aa區域。此外，利用 Wolf-PSORT在線工具對該蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示，StNiR定位于葉綠體的可能性最大。

2.5 馬鈴薯NiR氨基酸序列同源分析

利用BlastP對NiR蛋白進行序列同源性比對分析，發現馬鈴薯RB品種的NiR在氨基酸水平上與茄科植物的NiR蛋白具有高度相似性（圖7），與潘那利番茄（Solanum pennellii，XP_015089758.1）的一致性為97.77%，與番茄（S. lycopericum，XP_004248736.1）的一致性為97.09%，與曼陀羅（Datura stramonium，MCD9640990.1）一致性為94.86%，與風鈴辣椒（Capsicum bacctum，PHT36138.1）的一致性為94.02%，與辣椒（C. annuum，KAF3617369.1）的一致性為93.85%，與煙草（Nicotiana tabacum，NP_001311864.1；XP_016441428.1）的一致性為 93.53%。進一步利用 MEGA 7.0.14軟件，采用鄰接法構建系統進化樹，結果顯示，馬鈴薯NiR與茄科植物番茄和潘那利番茄處于同一個分支上，親緣關系也較近（圖8）。

2.6 馬鈴薯NiR基因在低氮肥脅迫和不同組織中的表達分析

為了分析馬鈴薯StNiR基因在低氮肥脅迫下和不同組織中的表達情況，使用微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）對氮肥供應充足和不足條件下的葉片和根的StNiR基因表達量進行檢測。結果表明，StNiR基因在根和葉片中均有表達，但是表達水平不同（圖9）。在氮肥脅迫下根比葉片敏感，該基因的表達量在根中下調了1.24倍，在葉片中的表達量下調了0.85倍，這可能是由于組織特異性的原因。此外，用ddPCR的結果與轉錄組測序（RNASeq）結果進行比較，發現ddPCR的表達量趨勢與RNA-Seq的結果一致。

3 結論與討論

本研究從馬鈴薯Russet Burbank中克隆到獲得StNiR基因，開放閱讀框長度為1 755 bp，共編碼584個氨基酸。蛋白的相對分子量為 65 616.26 u，理論等電點為6.67，不穩定系數為36.12，為穩定性蛋白，總親水性平均系數-0.397，預測其為親水性蛋白。馬鈴薯StNiR蛋白質二級結構含有α螺旋36.82%、β折疊5.31%、延伸16.78%和無規則卷曲41.10%。有研究表明，NiR具有亞硝酸還原酶4Fe-4S區域［7，13］，在對馬鈴薯Russet Burbank的NiR蛋白結構域進行分析時發現第197～351位和第457～564位氨基酸區域屬于亞硝酸鹽和亞硫酸鹽還原酶4Fe-4S結構域，第86～580位氨基酸為血紅素蛋白β亞基結構域。此外，活性位點分析發現該馬鈴薯NiR蛋白也包含有2個西羅血紅素結合位點，說明該結果與前人研究結果相符。

系統進化樹分析發現，馬鈴薯NiR蛋白與潘那利番茄和番茄的相似性均大于97%，與曼陀羅和風鈴辣椒的相似性高于94%，與辣椒和煙草的相似性大于93%，說明NiR蛋白在茄科植物中高度保守。Mitra等研究發現，NiR蛋白定位在葉片的葉綠體、非綠色組織的質體及細胞膜中［14］，本試驗利用Wolf-PSORT在線工具對馬鈴薯NiR蛋白進行亞細胞定位發現該基因存在于葉綠體的可能性最大。此外，本研究數字微滴式PCR結果顯示StNiR在葉片和根中都有表達，不管是在正常氮肥供應量和低氮肥脅迫下的葉片和根組織中都可以檢測到其表達量，這間接說明馬鈴薯亞硝酸鹽代謝的場所不僅分布于葉片中，同時也存在于非綠色組織的質體中。研究發現，紅麻HcNiR基因在葉中表達量明顯高于其在根中的表達量［15］；茶樹亞硝酸還原酶基因CsNiR在成熟葉片、芽、二葉和根中都有表達［16］；白菜亞硝酸還原酶基因葉片中的表達量遠高于根表達量［17］；在橡樹的葉片、根和花等組織中都有檢測到亞硝酸還原酶基因的表達［18］，這些研究證明了葉和根中確實都存在亞硝酸還原酶基因的表達。此外，本研究通過對不同氮素（NO-3）量的脅迫條件下馬鈴薯葉片和根進行表達分析，發現低氮肥脅迫處理后的樣品中亞硝酸還原酶基因的表達量明顯降低，且數字微滴式PCR的結果與轉錄組測序結果一致。本研究結果有助于深入研究StNiR基因在馬鈴薯硝態氮同化過程中的關鍵作用，為種質資源鑒定和培育氮高效馬鈴薯品種提供理論依據。

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