G-四鏈體二聚體/核酸外切酶Ⅰ輔助信號放大紙芯片檢測黃曲霉毒素B1

摘要 本研究利用DNA 四面體（TDN）精準調(diào)控識別配體的取向和密度，結(jié)合核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）對單鏈DNA 的特異性切割活性，借助G-四鏈體（G4）二聚體對硫黃素T（ThT）的熒光增強作用，構(gòu)建了旋轉(zhuǎn)型紙芯片，用于快速高靈敏檢測黃曲霉毒素B1（AFB1）。以含有G4 二聚體與AFB1 識別序列的單鏈DNA（G4 二聚體探針）為識別探針，其中AFB1 識別序列與TDN 的延伸手臂鏈通過堿基互補配對形式結(jié)合。當AFB1 不存在時， G4 二聚體探針上的G4 二聚體與ThT 結(jié)合，體系呈現(xiàn)出較強的熒光信號；當AFB1 存在時， AFB1 與G4 二聚體探針結(jié)合，使其脫離TDN。此時， Exo Ⅰ切割脫離的G4 二聚體探針，釋放出AFB1， AFB1 能夠再次與TDN 上的G4 二聚體探針結(jié)合，如此循環(huán)，使得TDN 上的G4 二聚體探針減少，導(dǎo)致體系剩余的G4 二聚體減少，熒光強度降低。此旋轉(zhuǎn)型紙芯片在AFB1 濃度為0.0001～500 ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.1 pg/mL。將本方法用于花生和紅酒樣品中AFB1 的檢測，回收率為85.2%～118.2%。本研究開發(fā)的的TDN/G4 二聚體/ Exo Ⅰ檢測策略顯著增強了體系的特異性和靈敏度。

關(guān)鍵詞 旋轉(zhuǎn)型紙芯片；核酸外切酶Ⅰ；G-四鏈體二聚體；DNA四面體；黃曲霉毒素B1

谷物和堅果類農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工和儲存過程中極易受到真菌毒素的污染，黃曲霉毒素是主要真菌毒素之一[1]。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）是已確認的黃曲霉毒素中毒性最大的類別，其毒性是氰化鉀的10 倍、砷的68 倍[2]。AFB1 具有致畸性、誘變性、腎毒性、免疫抑制性和致癌性，已被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）歸為Ⅰ類致癌物[3-5]。我國現(xiàn)行的食品安全國家標準（GB 2761-2017）中規(guī)定谷物類、堅果類食品中AFB1 的限量范圍為5～20 μg/kg[6]。因此，快速、準確和高靈敏檢測AFB1 對于公眾安全和癌癥預(yù)防具有重要的意義。

目前，檢測AFB1 的方法主要分為兩大類。一類是色譜法，如高效液相色譜法[7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]等，此類方法具有較低的檢出限、較高的準確性和靈敏度[11-12]，但這些方法需要精密的儀器，且預(yù)處理較復(fù)雜、耗費時間較長，不適用于快速篩查[13-14]。另一類是免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法[15-16]、免疫色譜法[17]等，此類方法也具有較高的靈敏度和選擇性，但反應(yīng)時間較長，操作過程復(fù)雜，抗體和酶儲存易變性，限制了它們的實際應(yīng)用[18-19]。與抗體相比，適配體易合成、穩(wěn)定性好且易于長期保存，基于核酸適配體的生物傳感器發(fā)展迅速[20]。其中熒光適配體生物傳感器具有特異性好、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，在分析傳感領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[21]。Qin 等[22]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，以二氧化錳納米片作為傳感平臺，開發(fā)了一種用于檢測玉米赤霉烯酮的適配體傳感器。Wei等[23]設(shè)計合成了一種具有脫氧核酶信號放大功能的熒光適配體傳感器，實現(xiàn)了血液中癌胚抗原的靈敏檢測。G-四鏈體（G4）能與ThT結(jié)合，增強其熒光信號，而G4 二聚體（由兩個能形成G4 的序列串聯(lián)折疊而成）與ThT 結(jié)合后，能使其熒光信號更強，且信號更穩(wěn)定[24]。Ma等[25]基于氮芥能抑制G4二聚體與ThT結(jié)合，導(dǎo)致熒光強度急劇下降的原理，實現(xiàn)了氮芥的靈敏熒光檢測。研究表明，采用DNA四面體（TDN）作為生物傳感器中識別探針的固定支架，能精準調(diào)控識別探針的分布密度和方向，有效提高探針的識別效率，進而提高體系的靈敏度[26-27]。Li等[28]開發(fā)了一種用于檢測AFB1 的電化學(xué)發(fā)光（ECL）適配體傳感器，利用TDN 作為支架為氮摻雜碳點提供了大量的結(jié)合位點，實現(xiàn)了ECL信號放大，顯著提高了體系的檢測靈敏度。此外，采用合理的信號放大策略可以進一步降低生物傳感器的檢出限[29-32]，其中基于核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）等工具酶的信號放大策略設(shè)計簡單且效果顯著[33]。Tang 等[34]構(gòu)建了基于Exo Ⅰ催化目標循環(huán)放大的生物傳感器，實現(xiàn)了對AFB1的高靈敏、高選擇性檢測，檢出限為9.4 ng/mL。

紙芯片技術(shù)以其成本低、操作簡單、可高度集成化、生物相容性良好以及快速高效等優(yōu)點引起了研究者的廣泛關(guān)注[35-36]。Wang 等[37]通過采用不同電壓激發(fā)發(fā)光物質(zhì)與目標分子反應(yīng)，設(shè)計了一種多通道紙基微流控芯片，實現(xiàn)了對miRNA-155 和miRNA-126 的高靈敏檢測。Jiang 等[38]將比色競爭免疫分析集成到紙基微流控裝置中，開發(fā)了一種能夠檢測食品和飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的紙基微流控芯片，與傳統(tǒng)方法相比，此策略大大降低了檢測成本和分析時間。基于上述方法及材料的優(yōu)點，本研究利用Exo Ⅰ對單鏈DNA 的高效切割活性、TDN 對識別配體的精準固定以及G4 二聚體對ThT 的熒光增強性能，開發(fā)了一種旋轉(zhuǎn)型紙芯片用于AFB1 的快速靈敏分析，為食品安全領(lǐng)域中真菌毒素的高靈敏、高選擇性檢測提供了一種新策略。