2株貝萊斯芽孢桿菌對葡萄幼苗生長及土壤質量的影響

摘要 將貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis YH-18及B.velezensis YH-20分別與有機肥攪拌形成混合肥，分別應用到葡萄盆栽苗上。結果表明，2種微生物肥料均能夠提高葡萄葉片的葉綠素含量。葡萄生長30 d后，YH-18、YH-20菌劑處理后葉面積較對照提高了8.75%、12.87%，葉綠素含量較對照提高了6.89%、2.23%；生長90 d 后，YH-18、YH-20菌劑處理后葉面積較對照提高45.47%、30.74%，葉綠素含量較對照提高16.26%、10.76%。YH-20對葡萄霜霉病的防治效果為30.44%，YH-18菌劑處理后防治效果為19.59%。30 d時YH-20比對照土壤中水解氮、速效鉀的含量偏低，可能施肥后加速了植物對養分的吸收。90 d后YH-18菌劑處理能提高土壤速效磷含量，比對照高18.15%。YH-20菌劑處理15 d后Ace指數和Shannon指數增加。2種菌劑處理30 d后Ace指數和Chao1指數顯著增加。在30 d內，YH-18、YH-20、CK處理的根際土壤微生物群落的多樣性和豐富度均呈下降趨勢，但菌劑處理后微生物群落多樣性和豐富度下降幅度遠低于CK處理下降幅度。與對照相比，施用YH-18和YH-20菌劑在葡萄上，YH-18、YH-20在30 d顯著富集了變形菌門、擬桿菌門，YH-20在15 d顯著富集了擬桿菌門。處理15 d后，與對照相比，YH-18富集了鞘脂單孢菌屬Sphingomonas；YH-20富集了假單孢菌屬Pseudomonas、黃桿菌屬Flavobacterium；處理30 d后，YH-18、YH-20均相對富集了鞘脂單孢菌屬、黃桿菌屬等。2種菌劑處理均能夠提高葡萄葉片的葉面積及葉綠素含量，且對葡萄霜霉病有很好的拮抗作用。菌劑處理土壤后有效地延緩了30 d內土壤微生物群落多樣性和豐富度的下降，且處理后形成了新的菌群結構，有助于促進葡萄幼苗的生長。

關鍵詞 貝萊斯芽孢桿菌；葡萄幼苗；土壤養分；土壤微生物

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）17-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.037

The Effects of Two Strains of Bacillus velezensis on the Growth of Grape Seedlings and Soil Quality

WANG Xiao-yue

（Shanghai Forestry Station，Shanghai 200072）

Abstract Bacillus velezensis YH-18 and B. velezensis YH-20 was mixed with organic fertilizer to form a mixed fertilizer， which was applied to grape potted seedlings. The results indicated that both types of microbial fertilizers could increase the chlorophyll content of grape leaves. The results showed that after 30 days of grape growth， the leaf area of YH-18 and YH-20 bacterial agents increased by 8.75% and 12.87% compared to the control， and the chlorophyll content increased by 6.89% and 2.23% compared to the control;after 90 days of growth， the leaf area of YH-18 and YH-20 bacterial agents increased by 45.47% and 30.74% compared to the control， and the chlorophyll content increased by 16.26% and 10.76% compared to the control. The control effect of YH-20 on grape downy mildew was 30.44%， and the control effect of YH-18 bacterial agent treatment was 19.59%. At 30 days， the content of hydrolyzed nitrogen and available potassium in YH-20 soil was lower than that in the control soil， which may have accelerated the absorption of nutrients by plants after fertilization. 90 days later， YH-18 bacterial agent treatment could increase the content of soil available phosphorus， which was 18.15% higher than the control. After 15 days of treatment with YH-20 bacterial agent， the Ace index and Shannon index increased. After 30 days of treatment with two bacterial agents， the Ace index and Chao1 index significantly increased. Within 30 days， the diversity and richness of rhizosphere soil microbial communities treated with YH-18， YH-20， and CK showed a decreasing trend， but the decrease in diversity and richness of microbial communities after bacterial treatment was much lower than that of CK treatment. Compared with the control group， when YH-18 and YH-20 bacterial agents were applied to grapes， YH-18 and YH-20 significantly enriched Proteobacteria and Bacteroidetes at 30 days， while YH-20 significantly enriched Bacteroidetes at 15 days. After 15 days of treatment， YH-18 enriched the Sphingomonas genus compared to the control group;YH-20 enriched Pseudomonas and Flavobacterium genera;After 30 days of treatment， YH-18 and YH-20 were relatively enriched in genera such as Sphingomonas and Pseudomonas. Both bacterial treatments could increase the leaf area and chlorophyll content of grape leaves， and had a good antagonistic effect on grape downy mildew. The treatment of soil with microbial agents effectively delayed the decrease in diversity and richness of soil microbial community within 30 days， and formed a new microbial community structure after treatment， which helps promote the growth of grape seedlings.

Key words Bacillus velezensis;Grape seedlings;Soil nutrients;Soil microorganism

基金項目 上海市綠化和市容管理局項目“微生物肥料的研究與應用”（G191208）。

作者簡介 王小月（1989—），女，江蘇興化人，工程師，碩士，從事林業植物檢疫工作。

收稿日期 2024-01-02

葡萄產業是上海水果產業的重要組成部分，葡萄是目前上海種植經濟效益最高的果樹樹種之一。設施栽培能夠提早或延遲葡萄的成熟時間，極大提高葡萄的生產效益，成為葡萄栽培上的重要生產措施之一［1］。設施栽培的經濟效益普遍高于露地栽培，且農藥使用量降低，對生態環境保護方面有顯著的優勢。但設施栽培中經常出現土壤連作現象，長期葡萄連續種植可能導致土壤惡化、自毒物質的積累以及微生物群落失衡，導致土壤質量顯著下降，限制植物的產量和質量。再加上單一或過量使用有機肥、栽培管理方式不當等行為加重了土壤問題。

微生物群落目前是世界上最大的生物多樣性儲存庫，為土壤提供許多生態系統服務，日益被認為是植物和農業生態環境結構的重要調節者。研究表明，微生物菌肥可以引起土壤微生物群落的變化，特別是增加直接或間接抑制病蟲害發生的有益微生物的數量。通過微生物菌劑菌肥的施用，以外源添加的方式重構根際微生物區系，改善植物根際環境，成為克服連作障礙的一個研究熱點［2］。研究表明，土壤調理劑配施菌劑可顯著提高連作壓砂西瓜田土壤養分，增強壓砂西瓜根系活力，促進其生長［3］。Chen 等［4］研究表明，枯草芽孢桿菌接種劑改變了土壤優勢門的相對豐度，增加土壤中的有效氮，使小麥產量提高了33.4%。解淀粉芽孢桿菌發酵液可以減輕連作對高粱生長的負面影響，改善連作高粱的根際微生態［5］。

從上海櫻花枝干中篩選得到的2株菌YH-18和YH-20是2株高效的PGPR，不僅具有明顯的病蟲害防治效果，還有促進植物生長的特性，如解有機磷、無機磷、產吲哚-3-乙酸（IAA）等能力［6-7］，且2株菌株均能定殖在植物根際。株貝萊斯芽孢桿菌具有良好的促生和抗病能力，但其對葡萄幼苗生長和根際土壤微生態的影響尚未見報道。筆者通過將YH-18、YH-20分別與有機肥混合使用，研究2株菌對葡萄生長的影響，確定2株菌劑對土壤養分含量的影響，探討不同菌劑對葡萄根際土壤細菌群落多樣性和微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于上海市金山區呂巷鎮白漾村（121°E，30°N，位于上海市金山區呂巷鎮，海拔10 m）。金山區是上海西南部的遠郊，位于長江以南的江南地區，地處黃浦江上游，屬于亞熱帶季風氣候，年均氣溫15.8 ℃，年均降水量1 178.2 mm，常年主導風為東南風，氣候溫潤，日照充足，四季分明，雨水充沛，具有明顯的海洋性氣候特征。土壤pH 6.0～6.2。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試樹種。

供試樹種為1年生葡萄盆栽苗。

1.2.2 供試菌株。

貝萊斯芽孢桿菌菌株YH-18、YH-20，保藏于南京林業大學森林保護實驗室。

1.2.3 培養基及發酵液的制備。

培養基Nutrient Broth（NB）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0，滅菌備用。

菌株原液制作方法：將菌種接種于NB培養基中置于搖床活化培養24 h（28 ℃，200 r/min）后取出，吸取1 mL活化好的菌液再次接種于內有50 mL NB培養基的100 mL容量瓶中搖床培養24 h（28 ℃，200 r/min）即得種子液，將種子液接種于50 L液體發酵罐中發酵培養24 h，獲得大量細菌發酵液，取出儲存備用。

1.2.4 有機肥。

選擇山東肥沃農資有限公司提供的富農有機肥，主要成分為雞糞、豆粕、麻餅，氮磷鉀含量＞5%，有機質含量＞45%。總計需要有機肥50 kg。

1.3 試驗方法

將有機肥與土壤按照1∶3的比例翻勻混合，將葡萄苗栽入盆內。將菌劑發酵液稀釋后直接施用在盆栽苗內，稀釋比例為1∶10。2019年葡萄盆栽苗試驗設計見表1。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 葉面積、葉綠素。

在施菌前測定葡萄葉面積和葉綠素等指標，在施菌后30、90 d分別對葡萄的葉面積、葉綠素含量等指標進行調查，用SPSS軟件處理數據，分析各處理的增長情況。

1.4.2 葡萄病害。葡萄霜霉病分級標準見表2。

發病指數=∑（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）×100

防治效果=（處理組發病指數-對照組發病指數）/對照組發病指數×100%

1.4.3 土壤氮（N）、磷（P）、鉀（K）、有機質含量。

菌劑處理前、處理30 d、處理90 d后，分別對各處理土壤取樣，將土壤送至土壤檢測中心檢測氮、磷、鉀及有機質含量。每個時間段每個處理組取6個重復，3個處理合計18個樣品。

1.4.4 土壤微生物多樣性。

分別在15和30 d，對盆栽葡萄苗土壤進行取樣，每個處理取6個重復，3個處理合計18個樣品，送至公司進行16S rDNA高通量測序并分析微生物多樣性和結構。

2 結果與分析

2.1 菌劑處理對葡萄葉片葉面積和葉綠素含量的影響

菌劑處理30和90 d，分別測定葉面積和葉綠素指標，結果顯示（表3），葡萄生長30 d時，YH-18、YH-20菌劑處理后葉面積較對照提高了8.75%、12.87%；葉綠素含量較對照提高了6.89%、2.23%；生長90 d時，YH-18、YH-20菌劑處理后葉面積較對照提高45.47%、30.74%，葉綠素含量較對照提高16.26%、10.76%。

2.2 菌劑處理對葡萄病害發生的影響

2019年7月，葡萄大范圍發生葡萄霜霉病。對病害發生情況進行統計，結果顯示（表4），對照發病指數為74.00，處理YH-20的發病指數為51.47，防治效果為30.44%；處理YH-18發病指數為59.50，防治效果為19.59%。YH-18、YH-20在一定程度上對葡萄霜霉病有較好的拮抗作用。

2.3 菌劑處理對土壤肥力的影響

由表5可知，在有機質含量上，葡萄生長30和90 d時，YH-18、YH-20處理后的有機質含量與對照相比均無顯著差異。葡萄生長30 d時，YH-20處理的水解氮含量比對照降低7.16%，可能一定程度上加速了植物對土壤中水解氮的吸收，促進植物生長。YH-18處理與對照無顯著差異。90 d時，2個處理與對照均無顯著差異。在速效鉀含量上，葡萄生長30 d時，YH-20處理比對照降低17.06%，可能一定程度上加速了植物對速效鉀的吸收，促進植物生長。YH-18與對照差異顯著。90 d時，2個處理與對照均無顯著差異。在速效磷含量上，葡萄生長30 d時，2個處理與對照均無顯著差異。90 d時，YH-18處理比對照提高18.15%，差異顯著。

2.4 菌劑處理對土壤微生物群落多樣性的影響

Alpha 多樣性指數是反映物種豐富度和多樣性的綜合指標，其中Ace、Shannon是豐富度指數，Chao1、Simpson是多樣性指數。Coverage是指各樣品（克隆）文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣品中序列被測出的概率越高，而未被測出的概率越低。該指數反映本次測序結果是否代表了樣品中微生物的真實情況。各處理在不同時期的豐富度指數和多樣性指數見表6。由表6可知，與CK組相比，YH-18菌劑處理15 d后，Ace指數、Chao1指數和Shannon指數略低于對照，Simpson指數無顯著差異；YH-20菌劑處理15 d后，Ace指數和Shannon指數略有增加，Chao1指數及Simpson指數無顯著差異。2種菌劑處理30 d后，Ace指數和Chao1指數均增加，Shannon指數及Simpson指數均無顯著差異。30 d內，YH-18、YH-20、CK處理的

根際土壤微生物群落多樣性和豐富度與15 d處理相比均呈下降趨勢，但菌劑處理后微生物群落多樣性和豐富度下

降幅度遠低于CK處理下降幅度，說明菌劑處理有效地延緩了30 d內土壤微生物群落多樣性和豐富度的下降。

2.5 菌劑處理后分類學水平上的細菌群落組成

不同處理下土壤門水平和屬水平細菌群落組成見圖1和圖2。序列共測定出36個門細菌群落，其中前20個優勢菌門的組成見圖1，其中相對豐度大于1%的優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria，49.55%～53.93%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，11.55%～29.79%）、酸桿菌門（Acidobacteria，9.83%～18.68%）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes，2.97%～5.76%）、放線菌門（Actinobacteria，1.85%～4.10%）、Patescibacteria（1.73%～2.80%）、綠彎菌門（Chloroflexi，1.11%～2.18%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.74%～2.88%）。

在這些優勢菌門中，與對照相比，YH-18、YH-20在30 d顯著富集了變形菌門、擬桿菌門，YH-20在15 d顯著富集了擬桿菌門。

各處理土壤樣品中30個菌屬平均相對豐度均大于1%（圖2）。在這些優勢菌屬中，處理15 d后，與對照相比YH-18富集了鞘脂單孢菌屬Sphingomonas；YH-20富集了假單孢菌屬Pseudomonas、黃桿菌屬Flavobacterium；處理30 d后，YH-18、YH-20均相對富集了鞘脂單孢菌屬、黃桿菌屬、羅河桿菌屬Rhodanobacter、Chujaibacter等。30 d后，各處理的菌群豐度都發生了變化，形成了新的菌群豐度結構。

3 結論與討論

YH-18、YH-20菌劑處理對盆栽葡萄苗的葉面積、葉綠素等指標方面均有較好的提高作用，這與Shi等［8］研究YH-18與YH-20菌劑處理后提高桃樹盆栽苗葉面積等指標結果一致。2種菌劑對葡萄霜霉病有較好的防治效果。果樹長勢優良是提高果實品質的基礎。葡萄苗早期平穩生長，枝干緊實茁壯，后期才不至于養分供應不足，枝梢葉片枯黃［9］。葡萄葉片的光合作用和養分積累對于葡萄果實品質的提高至關重要，葉片光合作用產物會促進葡萄進行營養積累，進一步升果實質量與風味。

2種菌劑處理90 d后YH-18菌劑處理能顯著提高土壤速效磷含量，比對照高18.15%，較好提升了土壤肥力。YH-18具有較好的溶磷作用，可能通過分泌酶等物質降解了土壤中難溶性磷與有機磷，加快了土壤中磷的釋放。江明明［6］研究表明24 h YH-18溶解無機磷含量高達93.49 mg/L，為對照的11.0 倍，還具有較好的固氮耐鹽能力。

2種菌劑處理后，土壤微生物群落都產生了變化。YH-20菌劑處理15 d后微生物群落的豐度增加，2種菌劑處理30 d后細菌豐度和多樣性顯著增加，這與葉靜等［10］研究不同微生物菌肥對濱海鹽漬土土壤微生物的影響結果一致。與同期對照相比，接種后30 d內根際微生物多樣性和豐度下降速度減緩。這表明菌劑處理對葡萄根際微生物群落具有顯著的正向影響，可減緩根際土壤微生物豐富度和多樣性的下降。2種菌劑處理不同時間段富集了不同的門細菌及屬細菌。該研究菌劑處理富集了變形菌門、擬桿菌門、鞘脂單孢菌屬、假單孢菌屬、黃桿菌屬等細菌群落。變形菌門是富營養細菌，包括很多參與氮循環的細菌［11-12］，如固氮的根瘤菌屬，菌劑處理后變形菌門豐度增加，與葉靜等［10］及王國麗等［13］研究結果一致。擬桿菌門的大多數成員主要分解纖維素和難降解的芳香族化合物，是土壤氮循環的參與者［14］。假單孢菌屬的很多細菌可促進植物生長，并能有效控制冠腐病。鞘脂單孢菌屬是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解［15］且對一些農藥的降解有良好效果，對克百威降解率為 55.58%、異丙威62.74%、辛硫磷 77.55%、毒死蜱 56.59%和氯氰菊酯81.8%［16］。

芽孢桿菌存活期長、抗逆性強，廣泛分布在不同的土壤和植物根際中，有的也可侵入植物組織內部，該屬中的許多菌株以其固氮能力、對致病菌的抗性和對植物的促生作用而受到研究者的廣泛關注［17-19］。該研究結果顯示，YH-18、YH-20這2株菌結合有機肥使用促進了葡萄幼苗葉綠素及葉面積的提高，促進了土壤速效磷含量的釋放，同時短期內也豐富了土壤微生物群落優勢門和屬的細菌，適合在大田試驗中進一步推廣使用，但對葡萄幼苗長期的土壤影響有待進一步研究。

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